マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

私たちは消化管における宿主微生物との相互作用の糖成分生物学を研究しており、特に消化管を覆う粘液層、特にムシンとその糖団が健康と疾患に与える役割に焦点を当てています。ムシングリカンは細菌に栄養素や結合部位を提供するため、宿主と微生物の相互作用において重要な要素としてますます認識されています。糖鎖化プロファイルの変化は微生物組成の乱を引き起こし、その逆もまた然りであり、これは疾患状態でよく観察される表現型です。

しかし、ムシンは非常に糖鎖化されているため、研究が非常に難しいことで知られています。サンプリング技術の革新や、その後のバイオインフォマティクス解析の革新、そして新しいサンプル処理手法によって、スループットが向上し、サンプル採取から結果までの時間短縮が期待できます。他の解析技術は糖団のより詳細な構造特性評価を可能にしますが、長時間の分析と時間を必要とします。

ここで説明するMALDI-TOF質量分析法を用いた技術は、高速性が優れており、高スループットかつスクリーニングやプロファイリングに適しています。まず、精製されたムシンと250マイクロリットルのベータ除去バッファーを4ミリリットルのガラスバイアルに混ぜます。バイアルをポリテトラフルオロエチレンで裏打ちしたキャップでしっかり密封し、45度で16時間培養します。

氷の上に5%酢酸溶液を1ミリリットルずつ反応混合物に加えます。サンプルの塩脱水には、少量のガラスウールをガラスピペットに詰めます。上部からガラスピペットに樹脂懸濁液を1.5ミリリットル加え、沈殿させて排出します。

次に、樹脂を5%酢酸2ミリリットルで洗い、流れる部分を捨てます。その後、ムシンサンプルを脱塩カラムに加え、5ミリリットルのチューブで流出液を収集します。5%酢酸1ミリリットルでカラムを2回洗浄し、流れを集めます。

その後、遠心蒸発器を使い、酢酸を除去し、サンプルを5ミリバール、30度摂氏で2時間濃縮します。試料を0.5ミリリットルのメタノール酢酸に溶かし、窒素流で乾燥させます。ガラスシリンジを使い、水酸化ナトリウムとメタノールの混合物を含むバイアルにDMSOを4ミリリットル加えます。

渦を巻いた後、溶液を2,000Gで2分間遠心分離します。上澄液を慎重にデカントし、ゲルを乱さずに塩分を除去してください。塩が形成されないことを確認した後、4ミリリットルの無水DMSOに再懸浮させ、過酸化基懸濁液を準備します。

次に、乾燥したムシンサンプルに無水DMSOと過塩基を加え、その直後にヨードメタンを加えます。パーメチル化反応を室温で激しく振って30分間培養します。次に、反応を終わらせるために0.5ミリリットルの水を加えます。

試料が濁ったら、窒素で洗浄して透明になるまで洗い流します。試料を親水性脂溶性バランス96井戸抽出板に載せます。試料を固体相に約1ミリリットル毎分の流量で押し込むために正圧をかけます。

流水を捨てた後、井戸を1ミリリットルの水で2回洗います。1ミリリットルのメタノールでプレートからグリカンを2回洗い出します。メタノールが板から出始めるまで圧力をかけ、その後は重力の流れで必要な速度を維持するのを待ちます。

遠心蒸発器で試料を乾燥させ、10マイクロリットルのTA50に溶かします。1マイクロリットルのサンプルとマトリクスを混合した後、鋼製MALDIターゲットプレートに装着し乾燥させます。データ解析のために、GlycoWorkbenchでマススペクトルのエクスポートしたASCIIファイルを読み込みます。

基準補正を行った後、ピーク重心を計算し、ポップアップウィンドウで適切な質量範囲、最小信号対雑音比、最小質量分析ピーク強度を選択します。その後、Glyco-Peakfinderツールを使ってピークリストに一致する構造組成を特定します。導関数としてperMeを、還元端にredEndを選び、期待残数の最小と最大を設定します。

ムシンについては、ヘキソース、N-アセチル-ヘキソサミン、デオキシ-ヘキソース、N-アセチルニューラミン酸を選びます。硫酸化グリカンの場合は、質量87.9の「他の残基」オプションを使いましょう。MALDI-TOFデータでは、ナトリウムイオンと電荷の最大数をそれぞれ1つずつに設定し、精度を0.5ダルトンに設定します。

Controlキーで正しい注釈をすべて選択し、それぞれをクリックします。選択した注釈を右クリックし、「注釈付きピークリストに追加」を選択します。複数の注釈付きスペクトルを比較するレポートを生成するには、「ツール」の後に「レポート」へ行き、異なるプロファイルを比較するレポートを作成してください。

レポートをPDFとして印刷して保存してください。断片化スペクトル解析では、スペクトルをGlycoWorkbenchに読み込み、先に示したようにピークリストを生成します。注釈付き糖団組成に対応する推定の糖鎖構造を描きます。

各構造体ごとにフラグメントを生成するには、右クリックして「フラグメントをキャンバスにコピー」を選択し、「フラグメント」ツールの「フラグメントを計算します」を選択してください。さらなる断片解析については、スペクトラムビューアで興味のあるピークをクリックしてください。右クリックして「ピークに一致するすべての構造を探す」を選択して、選択したピークのマスターチャージ比率をオンラインデータベースで照会します。

興味のある推定構造物を選択し、右クリックで適切なオプションでキャンバスウィンドウにコピーします。各糖鎖構造から可能な断片を計算するには、キャンバス内の構造を選択します。次に、ツールとフラグメントの項目で、現在の構造の計算フラグメントを選択します。

複数の糖鎖構造の断片が計算されている場合は、サマリータブのフラグメントテーブルビューから比較テーブルをご覧ください。各潜在的な糖鎖構造に対してピークリストに一致する断片を選択します。右クリックして、ドロップダウンメニューから「断片をキャンバスにコピーする」を選んでください。

最後に、ツールタブでプロファイラーに行き、すべての構造を注釈したピークを選びます。次に「ツール」→「レポート作成」を選択し、注釈のレポートを作成してください。イオン交換による脱塩により、より大きな糖団の回収率が向上し、これらの大きな構造は総糖団の31%を占め、PGC抽出時の21%を上回りました。

同定された糖鎖構造のうち、1つの糖団はイオン交換の脱塩試料でのみ同定されました。さらに、イオン交換やホウ酸塩除去による脱塩により、PGCを用いた固体相抽出による脱塩後のスペクトルよりも信号対雑音比が向上しました。パーメチル化反応時間は30分と90分で33個の糖団ピークを特定できたのに対し、5分の反応では31個のピークしか特定できませんでした。