Name: マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぼう、ペルメチル化ムチンO型糖鎖のMALDI-TOF質量分析法によるプロファイリング手法。β-脱離による糖鎖遊離とGlycoWorkbenchを用いた構造解析により、宿主・微生物相互作用におけるムチン糖鎖の役割を解明する高速スクリーニング法を習得できる。

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</ol>

<table><tbody><tr><td>150mmガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15202699</td><td>消耗品 本文内の参照(該当する場合):ガラスピペット</td></tr><tr><td>5mLチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30122305</td><td>消耗 品</td></tr><tr><td>96ウェルHLB抽出板</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>16553290</td><td>消耗 品</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>A6283</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アセトニ トリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15624520</td><td>試薬</td></tr><tr><td>無水DMSO</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>5.89569</td><td>試薬</td></tr><tr><td>無水メタノール</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>5.89596</td><td>試薬</td></tr><tr><td>オートフレックス質量分析計</td><td>ブルーカー</td><td></td><td>備品</td></tr><tr><td>DOWEX 50w x8 レジン、H+フォーム、200-400メッシュ</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>44519</td><td>試薬 本文中の参照(該当する場合):カチオン交換樹脂</td></tr><tr><td>ドライブロックヒーター</td><td>叶える</td><td>QBD2</td><td>備品</td></tr><tr><td>ブロックヒーター用の蒸発器/濃縮器</td><td>コール・パーマー</td><td>WZ-36610-99</td><td>備品</td></tr><tr><td>flexAnalysis</td><td>ブルーカー</td><td></td><td>ソフトウェア、独自製品&nbsp;</td></tr><tr><td>flexControl</td><td>ブルーカー</td><td></td><td>ソフトウェア、独自製品&nbsp;</td></tr><tr><td>ジュネバックEZ-2</td><td>バイオ医薬品</td><td>EZ-2</td><td>機器 本文中の参照(該当する場合):遠心蒸発器</td></tr><tr><td>PTFEキャップ付きのガラスバイアル(4 mL)</td><td>ウィートン</td><td>DWKW224582-144EA</td><td>消耗 品</td></tr><tr><td>PTFEキャップ付きのガラスバイアル(8 mL)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>11587413</td><td>消耗 品</td></tr><tr><td>グラスウール</td><td>スペルコ</td><td>1.04086</td><td>消耗 品</td></tr><tr><td>グリコワークベンチ</td><td>NA</td><td></td><td>ソフトウェア;https://glycoworkbench.software.informer.com/ からダウンロード可能</td></tr><tr><td>HLB SPEカートリッジ</td><td>スペルコ</td><td>57493-U</td><td>消耗品、96ウェルHLB抽出プレートの代替として</td></tr><tr><td>ヨードメタン</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>289566</td><td>試薬</td></tr><tr><td>MALDIターゲットプレート</td><td>ブルーカー</td><td></td><td>備品</td></tr><tr><td>ModulyoD フリーズドライヤー</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>ModulyoD-230</td><td>機器 本文の参照(該当する場合):フリーズドライヤー</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>452882</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ナオオホー(NaOH)ペレット</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>567530</td><td>試薬</td></tr><tr><td>NaOH溶液50%</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>415413</td><td>試薬</td></tr><tr><td>正圧96プロセッサー</td><td>水</td><td>186006961</td><td>備品</td></tr><tr><td>スーパー・DHB</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>50862</td><td>試薬</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>T6508</td><td>試薬</td></tr></tbody></table>

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン o型糖鎖のプロファイリング

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a powerful tool for the profiling of mucin glycans that ...

私たちは消化管における宿主微生物との相互作用の糖成分生物学を研究しており、特に消化管を覆う粘液層、特にムシンとその糖団が健康と疾患に与える役割に焦点を当てています。ムシングリカンは細菌に栄養素や結合部位を提供するため、宿主と微生物の相互作用において重要な要素としてますます認識されています。糖鎖化プロファイルの変化は微生物組成の乱を引き起こし、その逆もまた然りであり、これは疾患状態でよく観察される表現型です。しかし、ムシンは非常に糖鎖化されているため、研究が非常に難しいことで知られています。サンプリング技術の革新や、その後のバイオインフォマティクス解析の革新、そして新しいサンプル処理手法によって、スループットが向上し、サンプル採取から結果までの時間短縮が期待できます。他の解析技術は糖団のより詳細な構造特性評価を可能にしますが、長時間の分析と時間を必要とします。ここで説明するMALDI-TOF質量分析法を用いた技術は、高速性が優れており、高スループットかつスクリーニングやプロファイリングに適しています。まず、精製されたムシンと250マイクロリットルのベータ除去バッファーを4ミリリットルのガラスバイアルに混ぜます。バイアルをポリテトラフルオロエチレンで裏打ちしたキャップでしっかり密封し、45度で16時間培養します。氷の上に5%酢酸溶液を1ミリリットルずつ反応混合物に加えます。サンプルの塩脱水には、少量のガラスウールをガラスピペットに詰めます。上部からガラスピペットに樹脂懸濁液を1.5ミリリットル加え、沈殿させて排出します。次に、樹脂を5%酢酸2ミリリットルで洗い、流れる部分を捨てます。その後、ムシンサンプルを脱塩カラムに加え、5ミリリットルのチューブで流出液を収集します。5%酢酸1ミリリットルでカラムを2回洗浄し、流れを集めます。その後、遠心蒸発器を使い、酢酸を除去し、サンプルを5ミリバール、30度摂氏で2時間濃縮します。試料を0.5ミリリットルのメタノール酢酸に溶かし、窒素流で乾燥させます。ガラスシリンジを使い、水酸化ナトリウムとメタノールの混合物を含むバイアルにDMSOを4ミリリットル加えます。渦を巻いた後、溶液を2,000Gで2分間遠心分離します。上澄液を慎重にデカントし、ゲルを乱さずに塩分を除去してください。塩が形成されないことを確認した後、4ミリリットルの無水DMSOに再懸浮させ、過酸化基懸濁液を準備します。次に、乾燥したムシンサンプルに無水DMSOと過塩基を加え、その直後にヨードメタンを加えます。パーメチル化反応を室温で激しく振って30分間培養します。次に、反応を終わらせるために0.5ミリリットルの水を加えます。試料が濁ったら、窒素で洗浄して透明になるまで洗い流します。試料を親水性脂溶性バランス96井戸抽出板に載せます。試料を固体相に約1ミリリットル毎分の流量で押し込むために正圧をかけます。流水を捨てた後、井戸を1ミリリットルの水で2回洗います。1ミリリットルのメタノールでプレートからグリカンを2回洗い出します。メタノールが板から出始めるまで圧力をかけ、その後は重力の流れで必要な速度を維持するのを待ちます。遠心蒸発器で試料を乾燥させ、10マイクロリットルのTA50に溶かします。1マイクロリットルのサンプルとマトリクスを混合した後、鋼製MALDIターゲットプレートに装着し乾燥させます。データ解析のために、GlycoWorkbenchでマススペクトルのエクスポートしたASCIIファイルを読み込みます。基準補正を行った後、ピーク重心を計算し、ポップアップウィンドウで適切な質量範囲、最小信号対雑音比、最小質量分析ピーク強度を選択します。その後、Glyco-Peakfinderツールを使ってピークリストに一致する構造組成を特定します。導関数としてperMeを、還元端にredEndを選び、期待残数の最小と最大を設定します。ムシンについては、ヘキソース、N-アセチル-ヘキソサミン、デオキシ-ヘキソース、N-アセチルニューラミン酸を選びます。硫酸化グリカンの場合は、質量87.9の「他の残基」オプションを使いましょう。MALDI-TOFデータでは、ナトリウムイオンと電荷の最大数をそれぞれ1つずつに設定し、精度を0.5ダルトンに設定します。Controlキーで正しい注釈をすべて選択し、それぞれをクリックします。選択した注釈を右クリックし、「注釈付きピークリストに追加」を選択します。複数の注釈付きスペクトルを比較するレポートを生成するには、「ツール」の後に「レポート」へ行き、異なるプロファイルを比較するレポートを作成してください。レポートをPDFとして印刷して保存してください。断片化スペクトル解析では、スペクトルをGlycoWorkbenchに読み込み、先に示したようにピークリストを生成します。注釈付き糖団組成に対応する推定の糖鎖構造を描きます。各構造体ごとにフラグメントを生成するには、右クリックして「フラグメントをキャンバスにコピー」を選択し、「フラグメント」ツールの「フラグメントを計算します」を選択してください。さらなる断片解析については、スペクトラムビューアで興味のあるピークをクリックしてください。右クリックして「ピークに一致するすべての構造を探す」を選択して、選択したピークのマスターチャージ比率をオンラインデータベースで照会します。興味のある推定構造物を選択し、右クリックで適切なオプションでキャンバスウィンドウにコピーします。各糖鎖構造から可能な断片を計算するには、キャンバス内の構造を選択します。次に、ツールとフラグメントの項目で、現在の構造の計算フラグメントを選択します。複数の糖鎖構造の断片が計算されている場合は、サマリータブのフラグメントテーブルビューから比較テーブルをご覧ください。各潜在的な糖鎖構造に対してピークリストに一致する断片を選択します。右クリックして、ドロップダウンメニューから「断片をキャンバスにコピーする」を選んでください。最後に、ツールタブでプロファイラーに行き、すべての構造を注釈したピークを選びます。次に「ツール」→「レポート作成」を選択し、注釈のレポートを作成してください。イオン交換による脱塩により、より大きな糖団の回収率が向上し、これらの大きな構造は総糖団の31%を占め、PGC抽出時の21%を上回りました。同定された糖鎖構造のうち、1つの糖団はイオン交換の脱塩試料でのみ同定されました。さらに、イオン交換やホウ酸塩除去による脱塩により、PGCを用いた固体相抽出による脱塩後のスペクトルよりも信号対雑音比が向上しました。パーメチル化反応時間は30分と90分で33個の糖団ピークを特定できたのに対し、5分の反応では31個のピークしか特定できませんでした。

profiling-permethylated-mucin-o-glycans-using-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。...

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

免疫臓器や細胞内のスフィンゴ糖脂質抗原の発現プロファイルを洞察するための特異的かつ高感度の方法が記載されている。この方法は、化学的に合成された基準と比較して、構造解析のためのスフィンゴ糖脂質分子の段階的な断片化を許可するイオントラップ質量分析法を活用しています。...

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

O結合型糖鎖の多様性を包括的に探求するために、ペルメチル化および迅速な相分配法と組み合わせた新しいゲル内還元的β除去の手順を、SDS-PAGEによって分離され、その後の質量分析による糖鎖分析に適した糖タンパク質から直接放出されるO結合型糖鎖の分析に適用されます。...

質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

このプロトコルは、酵素(エンドキシラナーゼ)加水分解の前にREを2つのアミノベンザミドでタグ付けし、その後、質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)を使用して得られたオリゴ糖を分析することにより、ヘテロキシランの還元末端(RE)および内部領域のグリコシル配列の構造特性評価に使用される特定の技術について説明しています。...

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

この記事は、GC-MSによる検出のために、糖鎖をそれらの構成結合特異的単糖類に化学的に分解することにより、未分画生体流体中の糖鎖のプール組成プロファイルを分析するように設計された新しいボトムアップグライコミクス技術の強化形を提示します。潜在的なアプリケーションには、がんやその他の糖鎖影響性疾患の早期発見が含まれます。...

糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

合成高分子の質量分析法 (MALDI-TOF MS)...

マトリクスによる合成高分子のキャラクタリゼーション支援レーザー脱離イオン化時間 (MALDI Tof) 質量分析装置

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

マイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)は、生体サンプル中の糖鎖の組成分析のためのハイスループット技術です。...

ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。...

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

sheathless多孔チップインタフェース設計を使用してキャピラリー電気泳動 - 質量分析法による生体試料の代謝プロファイリングのためのプロトコルが提供されます。...

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

学ぼう、ペルメチル化ムチンO型糖鎖のMALDI-TOF質量分析法によるプロファイリング手法。β-脱離による糖鎖遊離とGlycoWorkbenchを用いた構造解析により、宿主・微生物相互作用におけるムチン糖鎖の役割を解明する高速スクリーニング法を習得できる。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

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