超音波ローカリゼーション顕微鏡を用いたラット脳微小血管系の2次元超解像可視化

私たちの研究の範囲は、ラットの脳微小血管系の超解像イメージングを実現するための超音波局在顕微鏡のプロトコルの開発に焦点を当てています。私たちは、小血管のイメージングにおける特殊解像度と浸透深さのバランスをとるという課題に対処し、健康な状態と疾患状態における血管構造と血流動態に関する詳細な洞察を提供することを目指しています。

当社のプロトコルは、MRI、CT、二重超音波などの従来の方法を上回り、最大 12 ミリメートルの浸透深さを維持しながら、12.5 マイクロメートルの高い空間分解能を達成するという利点を提供します。光学技術とは異なり、脳深部領域の画像化、微小血管構造の再構築、血流動態の視覚化を同時に行うことができます。

私たちの結果は、神経膠芽細胞腫瘍やアルツハイマー病などの神経障害における微小血管の変化を調査する道を開きます。血流動態と微小血管構造を高解像度で視覚化する機能は、疾患の進行、治療効果、筋肉の変化と脳機能の関係を研究する新たな機会を開きます。

[ナレーター]まず、麻酔をかけたラットを手術台に置きます。ラットの上切歯を切歯バーの切り欠きに固定し、下顎をバーの下に配置します。イヤーバーを外耳道の少し前方の骨のくぼみに配置し、頭蓋表面が水平に保たれるようにします。安定性を評価するために、頭のさまざまな部分に少量の圧力を加えます。イメージングプラットフォームの高さを微調整し、切歯バーノッチを使用してラットの頭の角度を調整し、呼吸が妨げられないようにします。エリスロマイシン軟膏または30%グリセリン溶液をラットの目に塗布して、手術用ライトからラットを保護し、水分を維持します。手持ちの電動バリカンで、ラットの頭を毛が生えている方向に逆らって剃り、耳の間と目から首までの領域を覆います。次に、ラットの頭蓋骨の矢状縫合糸に沿って切開し、後頭骨だけから始めて前方に約4センチメートル伸ばします。止血剤を使用して両側の皮膚を引っ込めます。オプションで、アクセスしやすくするために頭蓋骨の上の皮膚を切除します。小さなハサミを使用して頭蓋骨から骨膜を取り除き、硬い骨層を完全に露出させます。2.5 ミリメートルの球形ドリルビットを備えたハンドヘルド ミニ頭蓋ドリルを使用して開頭術を実行します。軽くたたいて骨を磨き、一度に2〜3秒間ドリルで穴を開け、中央から始めて外側に進みます。2 分ごとに約 1 ミリリットルの 0.9% 塩化ナトリウム溶液を掘削エリアに注入して、破片を冷却して洗い流します。白骨組織が一貫して接続されなくなったら、より細い 1 ミリメートルのドリルビットに切り替えます。中央の主要な血管が暗褐色としてはっきりと見え、周囲の組織がピンク色に見え、微小血管がわずかに赤みがかった色になるまで穴あけを続けました。造影剤を調製するには、SF6ガスと凍結乾燥造影剤粉末を5ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムに溶解します。混合物を激しく振ってマイクロバブル、またはMB懸濁液を形成し、最終的なSF6濃度は1ミリリットルあたり8マイクロリットルです。0.8ミリリットルのMB懸濁液をマイクロインジェクションポンプに取り付けられた1ミリリットルのシリンジに引き込みます。カテーテル付きの26ゲージの宿舎針をラットの尾静脈に挿入し、注入します。イメージングする前に、中心周波数15.625メガヘルツのプローブを、クランプを備えた脳定位固定装置のマニピュレーターアームに取り付けます。超音波プローブを露出したラットの脳の真上に配置し、露出した脳表面にカップリングゲルを塗布して、最適な信号伝達を確保します。ラップブレインアトラスとモーターモーションコントロールプログラムを統合したソフトウェアのメインインターフェイスを開きます。BGMA ポイントを原点として設定し、ソフトウェアのリアルタイム ディスプレイを使用してプローブの軌道と対応するラットの脳スライスの位置を監視します。BGMAから1ミリメートルを引いたものなど、ターゲットのイメージングプレーンを選択します。MATLAB 2021a ソフトウェアを起動し、MATLAB 2021a にデータ収集スクリプトを入力します。ルートディレクトリで、コマンドラインウィンドウに「activate」と入力して、ランタイム環境をアクティブにします。次に、データ収集の開始深度と終了深度をそれぞれ5波長と120波長に設定して、関心領域を効果的にキャプチャします。平面波透過のステアリング角度をマイナス5度から5度まで2.5度刻みで設定し、画像の解像度とコントラストを向上させます。超音波局在顕微鏡検査により、最大12ミリメートルの深さで微小血管が鮮明に視覚化されることが明らかになりました。半分の最大での全幅の分析により、検出可能な最小の血管直径は13マイクロメートルであることが示されました。フーリエリング相関により、微小血管イメージングの空間分解能が 12.5 マイクロメートルであることが確認されました。ラット脳の断面スライスにおける血流方向は、それぞれ青と赤で表される小皮質動脈では下向きの流れ、小静脈では上向きの流れを示しました。 速度マップは、より大きな容器でより高い流量を示し、速度の大部分は毎秒10〜25ミリメートルの範囲に集中していました。神経膠芽腫ラットモデルの画像化により、異常な血管拡張、腫瘍付近の構造的不規則性、腫瘍領域の血流パターンの変化、腫瘍内および腫瘍周囲の不均一な血管流が示されました。