すべての幼虫期にわたる高解像度 のC.エレガンス イメージング

研究室では、発生生物学に関するあらゆる種類の問題に取り組んでいます。私自身は、技術的な面でより深く取り組み、イメージング技術を使用してこれらの問題にうまく対処する方法を開発しています。C. elegans 分野は、CRISPR 遺伝子編集、トランスクリプトミクス、プロテオミクスから超解像顕微鏡に至るまで、多種多様な方法の採用に成功しています。C. elegans は素晴らしいモデルですが、高解像度での in vivo 観察の文脈では、最良の解像度を得るために固定化が必要であり、動物の生存率が制限されるという課題が伴います。このプロトコルは、C.エレガンスの長期イメージングのための1つの可能な解決策を提示し、研究者が自分の研究室でこの方法を採用し、さまざまな動的発生プロセスを生体内で直接研究できるようにします。研究室内では、この方法により、たとえば、形態形成の文脈や成人期への体細胞分裂の後など、臓器形成の詳細な観察が可能になりました。それ以来、この方法は、さまざまな発達プロセスを研究する多くの研究室で採用されています。

[プレゼンター]まず、デバイスをサポートフレームに取り付け、正立顕微鏡に取り付けます。シリンジに脱イオン水を入れ、23ゲージの針と1 x 16インチのチューブの長い部分を中空の曲げ鋼ピンで取り付けます。シリンジからの脱イオン水をチューブに充填し、バルブ入口のパンチ穴にスチールピンを挿入してチューブを接続します。チューブをオフチップソレノイドに取り付ける前に、シリンジと針を取り外します。イメージング ソフトウェアを使用して、ソレノイドをオンにし、デバイスを数分間加圧して、バルブからすべての空気を排出します。空気水界面が暗く見え、PDMS材料に消えることを目視で確認して、完了を確認します。イメージングソフトウェアを使用してソレノイドをオフにします。次に、1ミリリットルの注射器にろ過した細菌溶液を入れ、30ゲージの針と1×32インチの長いチューブを針に取り付けます。プランジャーを押して、針と付属のチューブの両方に細菌溶液を入れます。次に、ピンセットを使用して、32インチのチューブをマイクロ流体装置の食品入口に直接挿入し、シリンジをシリンジポンプに置きます。背面のつまみネジを使用してシリンジプランジャーを押し、デバイスに液体を入れます。ウォームの入口と出口の両方を密閉されたスチールピンで塞ぎ、止めネジを使用して追加の圧力を加えて、デバイスから残っている空気を取り除きます。次に、出口で詰まったスチールピンを取り外し、廃棄物容器を出口に取り付けます。シリンジを押して、廃棄物容器が正しく接続され、システム内に詰まりがないことを確認します。2 番目のブロックされたスチール ピンを入口から取り外し、ウォーム入口に少量の液体が現れるまでシリンジを押します。次に、23ゲージの針を使用して、約15〜20センチメートルの1×16インチのチューブの長い部分を、S-ベースバッファーで満たされた1ミリリットルのシリンジに取り付けます。チューブのもう一方の端にまっすぐな 23 ゲージのスチール ピンを取り付けます。針とチューブにシリンジからのS-ベースバッファーを入れます。次に、チューブの端にあるスチールピンをウォームの入ったチューブに挿入し、少量の液体をチューブに押し込んで空気が残らないようにします。ワームをシリンジに引き込まずにチューブに引き込みます。次に、スチールピンに少量の液体が現れるまでウォームに接続されたシリンジを押し、スチールピンをマイクロ流体デバイスのウォーム入口に挿入します。デバイスを5倍または10倍の低倍率の顕微鏡に置くか、解剖顕微鏡に置きます。視野の片側に入口が見え、反対側にトラップチャネル入口の背面が見えるようにデバイスを配置します。ウォームシリンジのプランジャーをそっと押します。次に、動物をチャネルアレイに向かって押します。動物が水路に面したら、水路に押し込み、他の動物に対しても繰り返します。十分な動物を捕獲した後、実験中ずっと残る顕微鏡ステージのワーム入口に取り付けたままのシリンジを置きます。解剖顕微鏡でロードを行った場合は、デバイスをイメージング顕微鏡に移します。次に、シリンジポンプのスイッチを入れ、0.5マイクロリットルに対して1時間あたり1マイクロリットルのプリセット速度で運転します。0.5マイクロリットルで1時間あたり1マイクロリットルで動作するようにシリンジポンプをプログラムし、その後、流量を0.5マイクロリットルで1時間あたり100マイクロリットル増加させ、実験全体を通してフローパターンを繰り返します。デバイスを顕微鏡ステージに置き、しっかりと保持されていることを確認します。希望のイメージング倍率に切り替えます。トラップチャネルアレイ内の動物と関心領域を特定し、目的のイメージング条件を設定します。希望のイメージング条件で画像を取得し、画像取得の10秒前にソレノイドを介してオンチップバルブを作動させ、動物を所定の位置に保持します。 マイクロ流体デバイスは、厚さ170マイクロメートルのカバーガラスを使用しているため、明視野、落射蛍光、スピニングディスク共焦点、超解像法など、さまざまな顕微鏡モダリティにわたって高いイメージング品質を維持しました。初期L1から中期L2幼虫期まで可視化されたCaenorhabditis elegans上皮細胞の発生一次色あせた外陰部前駆細胞の誘導と、その後のL1後期からL4幼虫期への初期への分裂が明らかでした。初期L3から成人期までの外陰形成段階取得した画像は、画像のデコンボリューションとレジストレーションによって強化され、視覚的な鮮明さが向上しました。見られた細胞分裂は、すべての動物で一貫したタイムリーな方法で発生し、すべての分裂は典型的な幼虫の段階の期間内に完了しました。生殖腺の長さは、L2およびL3段階で着実に増加し、動物のまっすぐな向きによって一貫した測定が可能になりました。