Name: 等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ diSPIMと自動細胞系譜解析を用いてCaenorhabditis elegans胚発生における細胞内分解能を解析する方法。神経発生の単一細胞動態を可視化し、軸索や樹状突起の形態を詳細に追跡できます。

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私たちは、lineaging 株 BV514 を生成するために、統合株、ujIs113 のジョンマレーに感謝します。ブランドン・ハーベイ (NIBIB) プロトコルのテストについてのヘルプ。ジョン・ダニエルズとゲイリー・ロンドー (応用科学機器) マイクロマネージャーと diSPIM 楽器の支援のため;そして、アンドリュー・ヨークとハンク・エデンは、diSPIM システムに関する重要なフィードバックのために。また、会議とブレーンストーミングのプラットフォームを提供するためのセルバンテス文化センター・デ・ Neurobiología ホセ・デル・カスティージョ (ユニベルシダード・デ・プエルトリコ) の研究センターにも感謝しています。この作品の多くは、森の穴にある海洋生物学研究所でホイットマンプログラムを通して行われました。この作品は、NIH 国立生物医学イメージング研究所とバイオエンジニアリングの学内研究プログラム、および NIH 助成金によってサポートされていました。U01-HD075602 とノーR24-OD016474。マーク w. モイルは、F32 ・ NS098616 によってサポートされ、R24-OD016474 の多様性の補足によってサポートされました。

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作者は何も開示することはありません。

C. elegansは27の既知の各成体ニューロンの最終的な位置と接続性を持つ唯一の生物として際立っています。しかし、 elegansコネクトームを構成する作業回路やネットワークの組織化につながる発達力学は不明のままである。光顕微鏡の進歩から生じた機会に基づいて、 elegans胚発生における細胞の位置、形態形成、および神経新生を捕捉し、分析することができるようになりました。
我々が研究室で日常的に使用している手順は、 C elegans胚の細胞 lineaging に対する標識ニューロンと核の 4d-等方性画像をもたらす。さらに重要なことは、diSPIM を使用した長期的なイメージング条件を最適化し、半自動 lineaging 機能と高解像度画像を組み合わせて、 C elegansの胚発生を解析する速度と精度を向上させることです。この統合されたプロトコルにより、ユーザーは初期のけいれんの開始を通じて、細胞を可視化して識別し、神経突起の移行や軸索手筋などの三次元特徴を定量化することができます。この手順は、ASI diSPIM システムと任意の施設に容易に適合することができ、我々はこのプロトコルのために特別にこのシステムをお勧めします。商業的に提供される他のスピム製剤は、試料チャンバーおよび光学的特性における ASI 構成とは異なる場合がある。ただし、他のプラットフォームからエクスポートされたデータは、データパイプラインを介して配置することもできます。したがって、lineaging におけるそれらの値の評価は、画像品質および器具安定性の厳しい試験であり、実現可能である。我々は積極的に他の標本 (ショウジョウバエおよびゼブラフィッシュ胚など) をイメージするために diSPIM を使用しているが、胚の記述および包括的な lineaging 分析は、現在でも線虫種に限定されている。より大きいか厚いサンプルのために、私達は静止した軽いシートを通してサンプルをスキャンする段階スキャンのアプローチを使用することを選ぶ。クマール et al. 以前は、diSPIM10に追加の変更を加えることなく厚いサンプルから高品質の画像を生成するために、この改良された diSPIM 断面を実証しました。
プロトコル内の重要なステップは、カバースリップコーティングされたポリ L リジンへのelegans胚の取り付け、データ取得、およびデータ処理を含む。ガラスカバースリップに収穫し、 elegansの胚を取付けることは経験の浅いユーザーに挑戦することができるが、ここで学習を促進するために主要なステップの詳しい議定書を提供する。長期画像化が望まれる場合、我々は8-10 若年成人28から4細胞またはそれ以前の胚を収穫する最良の結果を得る。高齢者は、子宮の古い胚と未受精卵を含む傾向があるので、初期の胚を収穫することはあまり望ましくないことに注意してください。取り付け胚に関しては、組み立てられた吸引器 (口ピペット) の閉塞や microcapillary ピペットでの開口の大きすぎるなどの問題が、胚の適切な取り付けおよび配向を妨げることがある。最適なイメージングのために準備するために、我々は、光シート、カメラ、目標、およびオートフォーカスの性能をチェックするために、早期および後期事前けいれん胚の事前捕捉試験を行います。これらのすべての操作がテストされ、プリ集録テスト中に高品質の画像が得られると、最良の結果を得ることができます。これは、両ビュー (目標) から取得した raw 画像が高品質でなければならない等方性空間分解能を持つ画像を生成する場合に特に重要です。取得後、各ビューについて取得したボリュームは、等方性画像を生成するために処理されます。このプロトコルで説明されているように、適切なグラフィックスプロセッシングユニット (GPU) カードを使用することが重要です (下記参照)。これにより、対しの融合画像が生成される処理速度が向上し、データ解析までの時間を短縮することができます。また、ユーザーが CytoSHOW の最新バージョンを実行しており、StarryNite 自動 lineaging のダウンロードバンドルで提供されているパラメーターを使用していることも不可欠です。他のサンプル (例えば、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエなど) の自動 lineaging を使用することに興味がある場合は、StarryNite で使用されるパラメータに追加の最適化が必要になります (参照3,4を参照)。
私たちの統合されたプロトコルは、画像と lineaging の結果を事前にけいれん胚に提供しますが、ユーザーは、lineaging 後の胚における自動的な変化は現在実現不可能であることに注意すべきである: 核の位置は、秒の順序で過剰にけいれんした胚は、系統追跡を可能にするには速すぎる。しかし、diSPIM は、神経発達のイベントを捕捉し、23,29の胚発生後の段階でいくつかの細胞位置を追跡する有望な能力を実際に実証した。ユーザーがけいれん後の胚を調べることに興味がある場合、diSPIM は容積型のスナップショットを得る速度を提供し、急速に移動する胚における神経突起伸長などの微細な神経発達イベントを追跡します。
このプロトコルは、WormGUIDES アトラス30の細胞ごとの完了のための基礎となり、高解像度等方性画像を有する統合アプローチを提供し、 中に標識されたニューロンの3d 形態を識別し、捕捉する。胚発生の最初の430分。それがあるように、プロトタイプ WormGUIDES アトラスは、開発胚の細胞の核位置を提供し、胚ニューロンのサブセットの発達ダイナミクスを捕捉することを目的としています。このプロトコルは、追加の開発ニューロンを WormGUIDES アトラス30に統合するための鍵となります。
私たちの統合されたプロトコルはまた、 elegans胚における新しい遺伝子発現プロファイルの探索を容易にします。トランスジェニックc. elegansにおいて、多くの細胞特異的プロモーターは、トランスジーン発現を空間的に時間的に制御する。ほとんどの遺伝子の発現パターンは成人動物31、32、33、34で広範囲に特徴付けられているが、ほとんどすべてが開発において特徴付けられることはまだない (特に後期) 胚。Elegans promoterome は、ワームコミュニティにとって細胞特異的なトランスジーン発現を促進し、遺伝子機能が細胞自律的であるか非自律的であるかを判断するために役立つリソースとなっています。等方性高解像度と動的発現パターンの遺伝子を捕捉し、lineaging を介して発現細胞を正確に同定することは、科学界の多くの人にとって貴重なものとなるであろう。
胚発生は、主要なプロセス、細胞分化および組織形態形成の2つの絡み合いを含む。Elegansの開発中に異なる細胞型を定義するメカニズムと分子については、多くのことが知られています。しかし、 elegans胚における細胞遊走、細胞接着、細胞形状にとって重要なメカニズムについては、ほとんど分かっていない。Elegans不変の細胞系統が知られているので、我々のプロトコルは、新しい詳細レベルでの形態形成の間に、例えば軸索手筋、シナプス形成、ニューロン活動といった、カタログ化された microanatomy の胚を容易に識別することを可能にする。Ardiel et al. は以前、 C elegans胚における単一ニューロンのレベルでのカルシウムトランジェントを捕捉するために diSPIM の力を実証した。発達生理学の他の多くの側面は、これらの方法による問い合わせのために熟している。
最後に、このプロトコルは主に自動化されており、逆畳み込み画像を生成し、StarryNite および Acetree を介してセル lineaging を実行するのにかかる時間を体系的に削減します。このプロトコルで使用されるソフトウェア戦略は、我々はここでそれらを実証している非常に特定の分野から遠く離れた生物学の多くの質問に適用することができます。
ソフトウェアの互換性とダウンロードアクセスの詳細
マイクロマネージャーと diSPIM イメージングのプラグインに関する情報は、http://dispim.org/software/micro-manager と https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin で入手できます。
現在、データ処理パイプラインには Windows オペレーティングシステムが必要です。私たちは、すべての必要なデータ処理プログラムとサポートファイルのインストールを簡素化するために、単一のアーカイブファイルをバンドルしています。Http://dispimlineage.wormguides.org でダウンロードできます。
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) は、広く使用されているオープンソース画像解析プラットフォーム、ImageJ (v1) に基づいています。CytoSHOW を使用するには java をコンピュータにインストールして最新の状態にする必要があり、CytoSHOW の更新は Java Web Start を介して自動的に展開されます。CytoSHOW の多くの ImageJ ベースの機能は、https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html で説明されており、図示している。CytoSHOW は、ASI diSPIM からの多次元の生データ、および TIFF 出力を作成するその他のイメージングソフトウェアを表示するようにカスタマイズされています。原理的には、他のマルチビュースピムイメージングシステムは、このプロトコルは、異なる顕微鏡システム上で実行することを可能にするために CytoSHOW のマイナーな変更によってサポートすることができます。

SpimFusion は、Visual Studio 2013 を使用した cuda/C++ で CUDA toolkit v 7.5 で書かれました。SpimFusion を実行するには、特定のコンピュータハードウェアが必要です: CUDA 計算機能1.0 以上と最小 2 GB のグラフィックスカードメモリを備えた NVIDIA グラフィックスプロセッシングユニット (GPU) カード。私たちのプロトコルの公開時には、SpimFusion は未発表 (最小の Shroff とハリのない) ですが、上記のソフトウェア・バンドル・アーカイブで利用可能です。

特別に構築されたコマンドライン駆動バージョンの StarryNite では、自由に利用できる MATLAB コンパイラランタイムがインストールされている必要がありますが、商用 MATLAB ソフトウェアのライセンスは必要ありません。MATLAB コンパイラーのランタイムは、前述のソフトウェア・バンドル・アーカイブに含まれています。このプロトコルで使用される StarryNite のコードは、共焦点画像6に使用されるものと本質的に変わりません。しかし、StarryNite 処理のための入力画像の作成および StarryNite 結果の処理のためのいくつかの運用上の問題は、溶融等方性のための連続データ処理パイプラインを可能にする CytoSHOW の方法によってここで対処されている diSPIMボリューム。これらの変更は、これらの前処理および後処理のステップを処理する CytoSHOW コードによって自動化されています。CytoSHOW はまた、事前に最適化された diSPIM 固有のテンプレート StarryNite パラメータセットを編集して、セグメンテーションアルゴリズムを画像データ内の原子核の蛍光強度に自動的に調整します。その後、各 diSPIM データ・セットで StarryNite によって使用される固有のパラメーターが、出力イメージおよび lineaging データとともにファイルに保存されます。
16ビットイメージで動作し、Java3D レンダリングとの互換性を維持する AceTree のカスタムバージョンは、このプロトコルに最も適しています。また、前述のソフトウェア・バンドル・アーカイブにも含まれています。

Elegansは、胚のすべての細胞が neurodevelopment を通して観察することができる唯一の生物として際立っている。細胞系列全体が既知で不変の1であり、胚の単一細胞の標識および連続画像化を可能にする新しいツールの開発とともに、生物学者は、線虫の神経の発達における異なるステップを検討することができるようになりましたすべての角度からのシステム-細胞誕生;移行と差別化;神経突起の形成、標的化した伸長および手筋;シナプス形成;機能回路のチューニング。Elegans胚におけるニューロン伸長ダイナミクスの捕捉は、レポーター及び蛍光顕微鏡を安定的に発現させることにより、科学界にとって貴重である。
C. elegansにおける発達研究は、しばしば、この種の不変の細胞系譜および細胞運命の地図を利用して、無傷の生物体1内の単一細胞レベルでの文脈的理解を増大させる。自動 lineaging 分析-StarryNite2、3、4 、AceTree5、6、7、8ソフトウェアを使用-高コントラスト、高解像度からの利点蛍光核の画像。最適に働くために、StarryNite/AceTree はまた開発の間にイメージされた胚の予測可能で限られたオリエンテーションによって決まる。共焦点顕微鏡は、2つのカバースリップ間で圧縮されたelegans胚において行われる、高コントラスト/高解像度および予測可能な拘束の両方を提供するので、10年以上にわたって標準のオート lineaging 顕微鏡法である胚の配向は7,8.我々は、以前、 C elegans胚形成などのライブサンプルイメージングのための新規ライトシートベースのデュアルビュー反転選択的平面照明顕微鏡 (diSPIM) の構築と使用について説明しました9,10,11,12,13. ライトシートの顕微鏡検査は、一般に、生きている3d 標本14,15の低い光毒性、高速および長期イメージ投射を提供する。DiSPIM 法は、具体的には、約 330 nm9のほぼ等方性の空間分解能を有する4次元 (4d) 画像を生成する。
共焦点顕微鏡検査と比較されて、diSPIM はより高い信号対雑音および速度を提供し、より等方性の空間分解能、および長期インビボのイメージ投射16のためにより適している。そこで diSPIM データを StarryNite/AceTree に適合させることに取り組み、lineaging 分析を強化するかどうかを検討した。主なハードルは、diSPIM 標本が卵殻圧縮によって容易に StarryNite/AceTree に期待される向きをとることができないことである。解析中のボリューム内のセル位置のランダムな方向は、自動 lineaging 解析の精度を低下させる。
従って私達は CytoSHOW を、ユーザーが diSPIM のイメージの前処理の間に胚の精密な3D オリエンテーションを選択することを可能にし、StarryNite に入力のための質の最大限に活用され、文脈に対応しているイメージデータを降伏させる視聴者ガイド付きユーザー・インタフェースを採用した/AceTree.画像化された胚のユーザ選択に際して、CytoSHOW は自動データ処理パイプラインを指揮する。トリミングされた、背景を減算した胚画像は、各位置、timepoint およびビューのための TIFF スタックファイル内に保存します。次に CytoSHOW は、そのプログラムを SpimFusion して、2つの前処理されたビューを共同登録し、共同 deconvolve して、等方性高解像度の体積画像を生成するためにリチャードソン-ルーシー17、18アルゴリズムを使用します。DiSPIM 固有のパラメータセットは、StarryNite が対し融合画像の画像セグメンテーションと核追跡の際にその動作を制御するために最適化されています。その後、融合イメージと lineaging 結果は AceTree を使用して編集されるため、ユーザーは StarryNite によって生成された自動系統トレース内のエラーを特定して修正することができます。AceTree はまた、胚の中の追跡された核の系譜木と3D モデルのレンダリングを提示することができます。スピムカメラの raw 画像と比較して、対しの融合画像を使用することで、lineaging の速度と精度が著しく向上することがわかります。私たちのプロトコルは、ここで説明するelegansアプリケーション用に最適化されている間、一般的に他の種または標本のために生産 diSPIM データの自動 lineaging に適応することができます。これがプロトコルの使用目的である場合は、3,4に記載されている新しい標本に対して、StarryNite パラメータの追加の調整が必要になる可能性があることに注意してください。
このプロトコルの実装を成功させることは、4D 等方性の分解能を持つ画像になり、生物学者が細胞系譜をトレースし、同時にelegans胚のニューロンを同定および分析することができる。さらに、いくつかの後処理アルゴリズムをマージすることにより、ハードウェアアクセラレーションがこれらの最も時間のかかるものであることから、生きている胚の細胞間の詳細とセルの系譜と細胞の運命の両方を本質的にリアルタイムで分析できるようになりました。この新しいプロトコルは、生体内の分化および形態形成の証拠研究中に、正確で情報に基づいた操作および細胞挙動の観察を可能にする。本稿では、胚発生、遺伝子発現または neurodevelopment の研究を強化するために、 elegans胚の開発における lineaging と細胞追跡のために開発したプロトコルの改良について詳細に説明する。

<table><tbody><tr><td>Steps 1-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concavityスライドサー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1519006</td><td>直径5-18mm、深さ0.6-0.8mm、1.2-1.5mm</td></tr>解<tr><td>剖顕微鏡、10回;&ndash;50回;ズーム範囲</td><td>Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &times; 50 mm</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>メチルセルロース &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509-25G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーピペット吸引チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーピペット、内径 0.4mm</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-800</td><td></td></tr><tr><td>Needle, no. 18G x 1 &frac12;(1.2mm×40mm)</td><td>BD Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NGM プレート</td><td></td><td></td>は<td>、Brenner (1974) の記載に従って調製されましたイメージング</td></tr><tr><td>チャンバー</td><td>O-リング ウェスト</td><td>M1.5X40</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>コーニング/シグマ-アルドリッチ</td><td></td> CLS7095D5X <td></td></tr><tr><td>プラチナ ワイヤー、直径 0.5 mm</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td> 267201 <td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製長方形チャンバー (76.0 mm x 50.5 mm)</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td>I2450</td><td></td></tr><tr><td>Worm Eyelash Pick</td><td></td><td></td><td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&nbsp;(2006年)。</td></tr><tr><td>Worm Pick</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Steps 5-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488nmロングパス</td><td>フィルターSemrock</td><td>LP02-488 RU-2</td><td></td></tr><tr><td>561-nmノッチ</td><td>フィルターSemrock</td><td>NF03-561E-25</td><td></td></tr><tr><td>BLP02-561R-25、数量 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>561 nm EdgeBasic ベストバリュー ロングパス エッジ フィルター</td></tr><tr><td>ボトム カメラ用制御ソフトウェア</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>ProgRes CapturePro</td></tr><tr><td>diSIPM アセンブリ ビデオ</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td></tr><tr><td>diSPIM アライメント ビデオ</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td></tr><tr><td>diSPIMイメージングPC</td><td>Intel</td><td></td><td>Xeon CPU E5-2630 2.6GHz、計12コア、&nbsp;64&nbsp;GBメモリ、Windows 7</td></tr><tr><td>FF01-525/45-25、数量2</td><td>Semrock</td><td></td><td>525/45 nm BrightLineシングルバンドバンドパス</td></tr><tr><td>フィルターFF555-DI03-25X36、数量2</td><td>Semrock</td><td></td><td>555 nmエッジ BrightLineシングルエッジダイクロイックビームスプリッター</td></tr><tr><td>イメージングPCグラフィックカード</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Tiグラフィックカード</td></tr><tr><td>Kumar他 diSPIMセットアップ</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>このプロトコルの機器のセットアップは、Kumar et al 10,11 &nbsp;diSPIMは、40×0.8NAの水浸レンズを使用してイメージングします。(手順5.1と注を参照してください)</td></tr><tr><td>マイクロマネージャー</td><td>マイクロマネージャー</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>クマールらのdiSPIMセットアップの変更（下記参照)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイソレータ付き光学テーブル、4フィート&タイム;6フィート&タイム;12インチTMC</td><td></td><td>784-651-02DRおよび14-416-34</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>Steps 7-10Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PC</td><td>Intel</td><td></td><td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz、合計6コア、64 GBメモリ、Windows 10</td></tr><tr><td>Analysis PCグラフィックカード</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Tiグラフィックカード</td></tr><tr><td>のインストール手順</td><td>ソフトウェアバンドル</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td></tr><tr><td>ソフトウェアバンドル</td><td>ソフトウェアバンドル</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org</td></tr></tbody></table>

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を caenorhabditis elegans 胚発生

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、生体内で単一細胞の分解能で、神経系全体の細胞起源を理解するという挑戦が観察できる唯一の有機体として際立っている。ここでは、 elegans胚に neurodevelopment を検査するための統合プロトコールを提示する。我々のプロトコルは、現像胚における単一細胞の画像化、lineaging および neuroanatomical トレースを組み合わせたものである。我々は、二重視野反転選択的平面照明顕微鏡 (diSPIM) の使用を通じて、ほぼ等方性空間分解能を有する生きたelegans胚の長期にわたる4次元 (4d) 画像化を達成する。線虫の胚における核とニューロンの構造は、すべての三次元で ~ 330 nm の分解能で画像を対しに融合して撮像される。次に、この分単位の高解像度4D データセットを分析して、単一細胞および細胞内レベルでの決定的な細胞系列の同一性と遺伝子発現および形態学的ダイナミクスを相関させます。私たちのプロトコルは、記述された各ステップのモジュラー実装を可能にし、胚発生、遺伝子発現、または neurodevelopment に関する研究を強化するように構成しています。

我々はまず、diSPIM 取得のためのプロトコルのパラメータを用いて画像化された胚の生存率を検証した (セクション 1-6)。10個の胚を20° c、1つの容積/胚/分で同時に画像化し、2細胞ステージから2倍ステージ (7.5 時間、451体積/胚) にした。胚発生全体にわたって細胞分裂を監視するために、我々は、遍在mCherryを表現するひずみ BV514 を使用した::ヒストンレポーターは、 ujIs113の統合トランスジーンアレイから構成される。図 6は、画像化された胚の1つについての胚発育のこの前半のタイムラインを示す。各画像は、画像化された胚の単一ビューの最大強度投影 (ステップ7-8 によって生成される) を表す。最適化されたプロトコールは、細胞分裂のタイミング (図示せず)、孵化時間、および発達的マイルストーンに関連するタイミングによって評価されるように、胚に検出可能な光毒性を誘導しなかったことを発見した (図 6および文献1,25,26)。
そして、開発した胚の単一ニューロンの伸長ダイナミクスを解析するプロトコルを適用した。我々は、未同定細胞のサブセットにおいて神経ペプチドflp-19プロモーターから GFP を発現するトランスジェニック線虫株 DCR7692 (olaex4655) を画像化した (DACR2819, Pflp-19 (3.6 KB):: Syn21:: GFP:: CAAX::p 10 3 ' UTR).ここで概説したプロトコルの手順に従って、未知の細胞が RMDDL および RMDDR の運動ニューロン、排泄管細胞、および2つの筋細胞に対応することを決定しました (図 7)。次に、RMDDL および RMDDR ニューロンの伸長ダイナミクスを調べ、定量化しました。我々は、RMDDL および RMDDR ニューロンが、受精後360分の早い時期に斜めに形成されており、より長い細胞軸が神経突起伸長の後続の軸を表すことを観察した (図 7およびムービー S1)。フィジーの「単純神経突起追跡」プラグインを使用して、対し融合体積の3D 再復元にそれを適用し、6つの胚の RMDDL と RMDDR 神経突起の型どおりの伸長を定量化しました。我々は、伸長ダイナミクスが胚全体に RMDDL および RMDDR に対してステレオタイプ化されたことを決定した (ここでは RMDDs と呼ばれる)。受精後385-410 分から、RMDDs 神経突起拡張6.0 ±0.5 μ m (平均± SEM;n = 12 神経突起) 細胞体の前方 (図 7b, C, I)。415-445 分から受精後、両方の神経突起は、推定神経環 (図 7dにおけるアスタリスク) の中およびその周辺に dorsally を拡張する。平均して、各 RMDD 神経突起は11.0 ±0.6 μ m (平均± SEM;n = 12 神経突起) は、リングの頂点で同期的にその対の対応を満たす前に、セルボディから (図 7I)。私たちの代表的な結果は、統合されたプロトコルを使用して、単一の識別可能な細胞のニューロンの発達特徴を検査、比較、定量化できることを示しています (図 7および図 8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> 図 1: diSPIM サンプルの取り付け設定。(A) ポリ L リジンをカバースリップの調製.このインセットにおいて、ポリ L リジンの10μ l を5分間カバースリップにコートするために使用した。ポリ L-リジンは胚の卵殻は、長方形のカバースリップにしっかりと固執することができます。(B) 鉄骨イメージングチャンバー及び組立チャンバの概略図。このインセットにおいて、代表的な胚は、カバースリップ上の長軸に直交する前後方軸を向いている。(C) microcapillary ピペットで吸引管を組み立てた。(D) diSPIM 40 倍の目標の下でサンプルホルダーに取り付けられたスチールイメージングチャンバー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> 図 2: マイクロマネージャーでの長期 diSPIM イメージングのセットアップ。(A) 光毒性を減少させながら長時間の画像化のために最適化された diSPIM レーザーパワーパラメータ (赤色矩形) を推奨 ( C elegans胚のより高い孵化率によって評価)。561 nm レーザーを79Μ w (0.25) と 488 nm レーザーを179Μ w (0.5) に設定します。レーザーパワーへのソフトウェア設定の正確なキャリブレーションは、diSPIM のインストールによって異なりますのでご注意ください。ユーザーは79Μ w (561 nm) および179Μ w (488 nm) レーザー力を達成するためにレーザー力を測定し、調整することを推薦する。(B) データ保存のためのパラメータを diSPIM (緑の長方形)、音量設定 (青の正方形)、およびスライスの設定 (オレンジ色の正方形)。(C) diSPIM elegans胚発生の長期イメージングのためのオートフォーカスパラメータ (手順 6.1-6.6 を参照)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> 図 3: CytoSHOW を使用したイメージの視覚化とデータ処理のセットアップ。(A) CytoSHOW によって開かれた Raw diSPIM 画像。CytoSHOW は、両方のカメラパス (スピム A と B) によってキャプチャされた画像を開くことができます。これらの raw 画像は、 diSPIM モニタと呼ばれる多次元ウィンドウで開きます。DiSPIM モニターでは、胚の前方、後方、背部および腹側縁を選択するために「蝶のパターン」が生成される (ステップ9.1 を参照)。ボウタイ選択は、逆畳み込みおよび StarryNite 支援 lineaging トレースのための胚の向きを示す。(B) 等方性画像を生成するために用いられるパラメータの最適化。Deconvolved ウィンドウを取得中に、ステップ 9.5.1-9.5.8 で指定されたパラメータを設定します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> 図 4: diSPIM カメラの構成。(A) diSPIM カメラの配置と向きの写真。(B) 収集されたスピム B 画像に一致するようにスピムの + 90 度の回転の描写。(C) 私たちの diSPIM のカメラ構成に基づいて、オリエンテーションインデックス + 1 に関連する入力ボリューム (ステップ9.5.2 を参照してください)。スピム B 画像と一致するように登録する前に、Y 軸周りの画像 (s) + 90 度のスピムを回転させます。スケールバーは10μ m です。画像は、代表的な単一視野、最大強度の突起、および標識された核 (561-nm、赤) およびニューロン (488-nm、緑色) を有する1.5 倍胚の逆畳み込み画像である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> 図 5: AceTree におけるelegans胚系統のキュレーションと編集(A) AceTree を使用して StarryNite の系統トレースを編集します (参照5、6、8、原稿もダウンロードバンドルに含まれています)。AceTree は、手順 10.1-10.2 の完了時に、各核 (緑色の長方形) のelegans体系的な名前を表示します。このウィンドウ (A) は、リネージュ・トレースのトラッキングおよび編集時にユーザーをガイドするのに役立つ、系列追跡の各セルに関する情報 (黒色の四角形) を提供します (青色でハイライト表示されます)。ユーザが、Sulston et al.1によって以前に報告されたelegans胚細胞系統への lineaged 細胞とその位置を確認し、比較することが推奨される。deconvolved データ系列 (下記参照、 B) は、検索バー (オレンジ色の長方形) にelegansの体系的な名前を入力します。(B) ユーザーの deconvolved データ系列も、手順 10.1-10.2 の完了時に自動的に開きます。ここでは、赤色で標識された核を有する4細胞期胚の対し融合画像を示す。原子核の追跡中、ユーザーは画像の強度 (赤の四角) を変更し、キーボードの矢印キー (時間-左/右、z アップ/ダウン) を使用して時間と z をナビゲートする必要があります。(C) timepoint の3d 漫画 (B) で回転可能な3d 視覚化を有効にする特定の機能 (紫色の長方形)。AceTree とその3d 機能の概要については、参照5、6、8を参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> 図 6: diSPIM 上のc. Elegans胚の時間発達動態トップパネルは、画像化された胚の1つについての胚発生の前半を示す diSPIM 画像 (株 BV514 ujIs11324) である。胚を連続的に画像化し、毎分7.5 時間 (20 ° c で) にする。トップパネルの最初の2つの画像は4と8細胞の胚の核 (赤) と極体の位置 (濃い赤色の球体、青いアスタリスクでマーク) を表します。各画像は、画像化された胚の単一ビュー最大強度投影を表す。スケールバー = 10 μ m。タイムライン (横棒) は、 elegans胚の発生後の分受精 (m.p.f.) を表す。我々は、diSPIM 獲得のための我々のプロトコルのパラメータが、生存率、細胞分裂のタイミング、孵化のタイミング、および発達マイルストーンのタイミングによって評価されるように、画像化された胚に検出可能な光毒性を誘導しなかったことを検証した (参照1,25,26). 我々は、発達のマイルストーンのタイミングが、我々の画像化パラメータ (6.4 時間長いイメージングセッションのための SEM ±8.174 分) を有する胚間で再現可能であることに留意する。n = 10)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> 図 7.Elegans胚の開発における神経突起伸長ダイナミクスの細胞識別と単一細胞の特性解析BV514 ujIs11324 (lineaging 用) と DCR7692 (olaex4655) とを交配して作られた菌株をデュアルカラー画像化することで、未同定細胞のサブセットにおけるニューロペプチドFLP-19プロモーターの GFP を発現するトランスジェニック線虫株である。(A-H)ここで概説したプロトコルの手順に従って、未知の細胞は、運動ニューロン RMDDL および RMDDR (黄色の矢印)、排泄管細胞 (青い矢印)、および2つの筋細胞 (白い矢印) に対応することを決定しました。(I) フィジープラグイン「単純神経突起トレース」を使用して、RMDDL および RMDDR ニューロンの伸長ダイナミクスを定量化し、対し融合ボリュームの3d 復元に適用します。RMDDL と RMDDR の両方が、合計で11.0 ±0.6 μ m (平均± SEM) で同期的に伸びる型どおり伸長ダイナミクスを示していることに注意してください。n = 12 神経突起) と神経環の背尖部での会合 (映画 S1も参照)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> 図 8: elegans胚における神経形態の等方性 diSPIM 画像の検討AVHL と AVHR ニューロンの等方性可視化 (黄色矢印).DiSPIM を用いて、神経形態は、約 330 nm の等方性空間分解能を有する4次元 (4D) 画像を得て捕獲することができる。DiSPIM は、ユーザーがすべての方向に同一の解像度で画像ボリュームを仮想的に回転させることができます。A−D内の画像は、胚の長軸を中心とする異なる回転から diSPIM 像体積を融合した同じ対しの最大強度投影である。スケールバー = 5 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください</a>。
補足の映画 S1: c. elegansの胚は受精の後の434分に280から成長する。DCR7692 (olaex4655) の等方性動画は DACR2819 まばらな標識 RMDD 神経突起でujIs113遍在を発現している (図 7a-D、黄色矢印)。DACR2819 はまた、2つの筋細胞 (図7a −d、白色矢印) および排泄管細胞 (図 7a−d、青色矢印) を胚発生時に標識する (図7a − d)。スケールバー = 10 μ m<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください</a>。

ここでは、 elegans胚における高分解能顕微鏡、計算ツール、および単一細胞標識法を用いて、neurodevelopment 中の単一細胞動態を理解するための組合せアプローチを提示する。

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

このプロトコルは、生きた胚の細胞系素子とアイデンティティの効率的なトレースを可能にする一方で、C.elegansニューロンの発達における軸索や樹状突起などの詳細な細胞形態を同時に分析する。共焦点顕微鏡と比較して、デュアルビュー反転選択的平面照明顕微鏡またはdiSPIMは、ノイズに対するより高い信号、より等方性の空間分解能を提供し、長期的なインビボイメージングに適しています。凹型顕微鏡スライドのうつ病に1%メチルセルロース溶液の500マイクロリットルを加えることで始めます。プラチナワイヤーピックを使用して、線虫増殖培地プレートからM9メチルセルロース溶液に成人を移す。18ゲージの皮下注射針の鋭利な先端を使用して、各動物を中身で横方向にスライスし、少なくとも1〜4個の細胞胚にスライスします。歯の間にそっと保持された吸引マウスピースで、マイクロキャピラリーピペットに10〜15マイクロリットルのM9バッファーをプレフィルし、スライドから毛細血管に複数の胚を穏やかに吸引します。新鮮なM9バッファーで満たされたスチールイメージングチャンバーのカバースリップの中央の長方形に胚を分配します。各胚の長い軸がカバースリップの長い軸に垂直になるように、胚を垂直方向にそっと向けます。次に、スチールイメージングチャンバをdiSPIMのステージ上のサンプルホルダーに配置します。イメージング用の胚を準備するには、マイクロマネージャーを開き、488ナノメートルの場合は179マイクロワット0.5%の同等値にレーザー強度を設定し、561ナノメートルの場合は79マイクロワット0.25%同等値に設定します。ソフトウェア調整と真のレーザー出力の間の校正は、特定のマイクロワットの範囲を設定するために、事前に行う必要があります。プラグインメニューで、デバイス制御を選択し、科学画像diSPIMを適用し、適用された科学イメージングデュアルビューの二重ビューの選択的平面照明顕微鏡ウィンドウを開きます。取得タブで、パラメータが示すように設定されていることを確認します。オートフォーカスタブで、示されているとおりにパラメータを設定します。オートフォーカスチャネルは、計画的な系統化実験に対して核蛍光チャネルを指定する必要があります。ビームとシートボックスのパス A または B をチェックし、ライブをクリックして画像の取得を開始します。ライブビューウィンドウが開きます。次に、対象となる胚の周りにボックスを描いて胚の自動焦点解析領域を選択し、取得開始をクリックして、長期的な多次元画像キャプチャを開始します。画像表示、処理、および細胞系の分析のために、ソフトウェアバンドルをダウンロードして解凍した後、CytoSHOW_app.jnlp ファイルをダブルクリックして CytoSHOW の実行を開始します。ファイル メニューで、新規および diSPIM モニタ マイクロ マネージャーを選択して、raw マイクロ マネージャー イメージが保存されたルート データ セット フォルダを見つけます。任意のタイムポイントフォルダを選択し、[開く]をクリックします。多次元ナビゲーションウィンドウは、SPIM AとSPIM Bの両方で自動的に開かれます。ポリゴン選択ツールを使用して、対象となる胚の前部、後部、後部、腹側、腹側のエッジのすぐ外側をクリックして、SPIM AとSPIM Bビューの両方で胚の上に蝶ネクタイパターンを生成し、diSPIMをクリックします。各 SPIM アームの緑と赤のチャネルを調整し、もう一度 diSPIM をクリックします。シフトは、他のすべての位置ウィンドウでトリガーされます。次に、diSPIM をクリックしてヒューズを押してデコンボルブヒューズ diSPIM 生データ ボリューム ダイアログ ボックスを開き、示されているとおりにパラメータを設定します。すべてのパラメータが設定されたら、[はい]をクリックし、処理されたファイルを保存する出力ディレクトリを指定してから[OK]をクリックします。プレビュー ウィンドウで、t-scroll バーをウィンドウのタイム ポイント 2 に移動し、ビューが胚の長い軸に直接表示されるまで Z スライダを移動します。t-scroll バーをプレビュー ウィンドウのタイム ポイント 1 に戻し、線選択ツールを使用して、腹側の最も円形の核から AB 細胞メタフェーズ プレートの平面を通る線を描画します。diSPIM プレビュー ボタンをクリックして、プレビューされたイメージボリュームの向きに微調整を保存します。diSPIM モニター・ウィンドウの t-scroll バーを、処理するイメージの全スパンの開始および終了のタイム・ポイントに設定します。次に、[OK] をクリックします。効率的で正確な細胞系統解析のためには、スターリーナイト処理の前にデータ量の正確なADL方向を達成することが重要です。AceTree で Starry Night 系列トレース シリーズを開くには、提供されたカスタマイズされた AceTree ファイルを開き、オープン構成ファイルを選択して、前に示した出力ディレクトリを見つけます。対象となる胚のヒューズサブフォルダを開き、編集したファイルを選択します。次に、[開く] をクリックし、前述のように、系統の視覚化と編集に進みます。最適化されたプロトコルは、孵化の時間と発達のマイルストーンに関連するタイミングによって評価される胚に検出可能な光毒性を誘発しない。このプロトコルを用いて実証したように、この線虫株を発現するトランスジェニック緑色蛍光タンパク質における未確認細胞は、運動ニューロン、排泄管細胞、及び2つの筋細胞に対応すると判断した。同定されたニューロンは、受精後360分で斜めに形を整え、後の神経突起成長の軸を表す長い細胞軸を有する。RMDD神経突起は、受精後385分から410分まで、細胞体の約6マイクロメートル前部を拡張した。受精後415分から445分まで、両方の神経突起は推定神経環の前後に背もたって伸びた。平均して、各RMDDニューライトは、リングの頂点で対側の相手を同期的に満たす前に、細胞体から約11マイクロメートルを拡張した。これらのデータを組み合わせることで、単一の識別可能な細胞の神経発達機能を、この統合プロトコルを使用して調べ、比較し、定量化できることを実証する。各胚の長い軸がカバースリップの長い軸に垂直になるように、胚を垂直に向けることを忘れないでください。このプロトコルを用いて、あらゆる角度から新生胚性神経系を探求し始めました。例えば、細胞の誕生、移動および分化、神経突起形成、成長および魅惑の間に。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

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