のためのシンプルなマイクロ流体デバイス

こんにちは。私はインド国立生物科学センターのTUR Kika研究室のポストドクター、Shamalです。このビデオでは、一般的なラボ環境でソフトリソグラフィ技術を用いてバイオチップマイクロデバイスを作製する方法をご紹介します。これらのデバイスを使用して、遺伝学的モデル生物の高解像度な細胞および細胞内イメージングを行います。

本プロトコルにより、研究者は麻酔を使用せずに、無傷の個体でタイムラプスイメージングを行うことができます。それでは、始めていきましょう。私たちは、C. elegans、無傷のショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどの遺伝学的モデル生物を用いて、麻酔剤不使用のin vivoイメージングを行うためのシンプルなマイクロ流体デバイスを開発しました。

本研究では、PDMSのソフトモールド法を用いて作製した、メンブレンベースの透明な固定化デバイスを実証します。単一の個体を固定化するために、実体顕微鏡下で個々の動物の位置を特定し、マイクロピペットを用いてバッファー溶液の少量液滴で動物を採取し、個体を流路に挿入してPDMSメンブレンの下で固定します。3方ボールバルブを介した加圧窒素ガス接続を使用します。

クリーニングソフトウェアを用いてマイクロフルイディクス構造を設計します。2 cm × 2 cmのシリコンウェハーを20% KOHで1分間洗浄し、超純水で rinse します。窒素ガスで乾燥させ、122 °Cで4時間脱水します。

シリコン片にhexa metalを500 RPMで5秒間、次いで3000 RPMで30秒間スピンコートします。シリコンウェハーにSU 8 2 0 2 5を500 RPMで5秒間、次いで2000 RPMで30秒間スピンコートします。コーティングしたシリコン片を65 °Cで1分間、その後95 °Cで10分間ソフトベイクします。

焼き付けたSU-8コートウェハを、フロー層用のデザイン1およびコントロール層用のデザイン2のフォトマスクを介して、200 WのUVランプで露光します。ウェハを65 °Cで1分間、次いで95 °Cで10分間ポストベイクします。SUA現像液を用いて、20分間現像します。

デシケーター内で三クロロパーフルオロシラン蒸気を用いて、試料を2時間コーティングします。ポリジメチルシロキサンベースと硬化剤を、重量比10:1で混合します。混合中に生じた気泡をすべて取り除くため、混合物を脱気します。

デザインのSC重量パターンが施されたシリコンウェハー上に、厚さ5 mmのPDMS混合液を注ぎます。気泡の形成を防ぐため、ゆっくりと注いでください。流路層用に、まず500 RPMで5秒間、次に1500 RPMで30秒間スピンコートを行い、シリコンウェハー上に均一なPDMS層を形成します。

PDMSを含むデザイン1とデザイン2の両方を、50 °Cで6時間加熱します。SCHパターン2を含むサブブレードを用いて、シリコン基板からPDMS片を切り出します。PDMSモールド内のメイントラップに接続されるリザーバーの上部に、小さな穴を開けます。

18ゲージの穿刺針を使用して、コントロール層の下面とフロー層の上面を18Wのエアプラズマに2分間曝露させます。プラズマ処理した2つの面を軽く圧力をかけて合わせ、50 °Cで2時間焼き付けます。

SUH design oneを用いて、シリコン基板から接合したデバイスを切り出し、流路の入口および出口のリザーバーにアクセスホールを開けます。デバイス底面のPD部分を露出させ、ガラスカバーを洗浄します。18 Vのエアプラズマで2分間処理します。

プラズマ処理した2つの表面を、軽い圧力をかけながら合わせ、50 °Cで2時間焼き付けます。作製したデバイスは、後の使用に備えてクリーンな環境で保存してください。デバイスの作製後、PDMS膜を用いてC. elegansをデバイス内に固定する方法を説明します。マイクロフレックスチューブの一端を加圧窒素ガス供給レギュレーターに接続し、もう一端を18ゲージ針を介してメイントラップのリザーバーに接続します。

チューブ接続の中間に使用される三方活栓により、メンブレンへの圧力の印加または解放が可能です。メイントラップのリザーバーに接続する前に、PDMSデバイスに接続するチューブに10 centimeterの蒸留水のカラムを満たします。窒素供給のバルブを開いてタンパク質PSIを読み取り、倒立顕微鏡の低倍率で、メイントラップのメンブレンがフローチャネルに向かってたわむ様子を観察します。

3方コックを緩め、メンブレンを静止位置に配置します。流路にバッファーを満たし、10分間放置します。実験前に、低倍率の実体顕微鏡を用いて単一の sea elegance を特定します。

少量のバッファー溶液を用いて、マイクロチップで1匹の個体を選別します。その個体をフローチャネルの入口から押し込みます。ピペッティング圧を調整し、個体をメイントラップの直下に配置します。

PDMSメンブレンの圧力をゆっくりと上げ、動物をチャネル境界に密着させ、7～14 PSIの圧力で固定します。倒立顕微鏡を使用し、高解像度の明視野または蛍光イメージングに適した設定にします。あらかじめ設定したフレームレートで、単一またはタイムラプス蛍光画像を撮影します。

トラップの圧力を解放し、動物の移動行動を観察します。低倍率で5分間、動物を洗い流し、新しい個体を導入します。DevOpの手順を繰り返すには、カットしたマイクロピペットチップを使用して単一のoph幼虫をピックアップし、よりサイズの大きいマイクロフェリックデバイスに導入します。

単一の幼虫をフローチャネルの入口から押し込みます。PDMSメンブレンの圧力をゆっくりと上げ、7 ESIの圧力で固定します。倒立顕微鏡を用いて低倍率で蛍光イメージングを行い、輸送イメージングのためのタイムラプス蛍光画像を取得します。

トラップの圧力を解放し、低倍率で幼虫の運動挙動を観察します。同様の装置原理を用いて、受精後30時間のゼブラフィッシュの心臓を固定し、タイムラプス画像を撮影します。

このビデオを視聴することで、ご自身の研究室で同様のマイクロデバイスを作製し、高解像度の優れた実験のために生物を固定化させ、適切に使用できるようになります。ビデオをご視聴いただきありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。