低密度好中球の効率的な精製のための迅速な磁気マイクロビーズ法
2025年11月11日
低密度好中球 (LDN) は、いくつかの疾患で大幅に増加します。LDNは通常、細胞選別によって単離されます。純粋で生存可能なLDNを得るための実用的な方法を提示します。末梢血の密度勾配遠心分離後、細胞を磁気マイクロビーズでインキュベートし、LDNを磁気カラムで分離します。
末梢血単核細胞内の低密度好中球を研究し、その機能を特徴づけて異なる疾患における役割を明らかにします。低密度好中球は健康な血液では稀ですが、全身性エリテマトーデスやがんなどの疾患では著しく増加します。まず、抗凝固剤としてヘパリン10単位を15ミリリットルの円錐形遠心分離機チューブに添加します。
次にPBSに6%デキストランT500を2ミリリットル加えます。健康な成人ボランティアから10ミリリットルの血液を静脈穿刺で採取します。別の新しい15ミリリットルの遠心分離機チューブに、密度勾配培地を5ミリリットル加えます。
赤血球に触れずに慎重にピペットで血漿を抽出し、培地の上に重ねて2つの別々の相を形成します。チューブを516gで4度の温度で20分間遠心分離します。PBMCを単離するには、PBMCバンドより上の血漿を細胞を乱さずに吸引して廃棄します。
プラズマと培地の間に単核細胞帯を採取し、培地の収集を最小限に抑えましょう。PBMC(発酵液)入りチューブにPBSを20ミリリットル追加し、400gで4度の温度で5分間遠心分離します。上清液を慎重に吸引し、チューブをこすってペレットを分離します。
細胞を再懸浮させるために10ミリリットルの冷たいPBSを加えます。好中球を分離するには、培地をピペットで取り出した後、チューブをこすって細胞を分離します。次に冷たいPBSを10ミリリットル加えます。
次に細胞を新しい50ミリリットルの円錐形遠心分離機チューブと遠心分離機に移します。上澄液を吸引し、再度チューブをこすり取ってください。次に冷たい低張液10ミリリットルをチューブにピペットで入れ、優しく混ぜます。
ちょうど1分間、優しく混ぜます。冷たい高張液を10ミリリットル素早く加えて等張溶液にします。その後、ニューバウアーチャンバーを使って好中球を数え、純度が95%以上であることを確認し、遠心分離して細胞ペレットを得ます。
その後、ペレットを冷たいPBSで再懸浮させます。末梢血の単核細胞を400gで4度摂氏で5分間遠心分離する。上澄液を除去した後、細胞を120マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁させます。
次に、細胞懸濁液にCD66b磁気マイクロビーズ35マイクロリットをピペットで送り込みます。混合物を暗闇で4度Cで30分間孵化します。次に、チューブに1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーをピペットで送ります。
チューブを400gで3分間遠心分離します。上澄液を除去した後、チューブをこすって細胞ペレットを分離します。そして細胞を1ミリリットルのウォッシュバッファーに再懸浮させます。
磁石の上に磁気分離カラムを置きます。カラムに0.5ミリリットルのウォッシュバッファーを加え、完全に通過できるようにします。再懸濁した細胞を1ミリリットル単位でカラムに移し、バッファーを一滴ずつ通過させます。
洗浄後、カラムをマイクロ遠心分離機のチューブに移します。次に、1ミリリットルのウォッシュバッファーをカラムにピペットで注入します。次にプランジャーを柱の上に差し込みます。
優しく圧をかけて細胞を溶出させます。その後、プランジャーを外してカラムを新しいマイクロ遠心分離機のチューブに置きます。カラムにさらに1ミリリットルのウォッシュバッファーを加えます。
次に再びプランジャーを挿入し、優しく圧力をかけて残りの細胞を洗い出します。両方のマイクロ遠心分離管を800gで3分間遠心分離します。両方のチューブから細胞ペレットを1ミリリットルの冷たいPBSに再懸浮させます。
セルの懸流は冷やしておけ。精製細胞をPBS中の1%胎児用牛血清で作られた標識バッファーに再懸濁させます。250マイクロリットルの懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移します。
好中球膜分子に対する対応する抗体をチューブに加えます。その後、光を遮った状態で4度の温度で30分間培養します。次に、チューブにPBSを1ミリリットルのピペットで送ります。
チューブをマイクロ遠心分離機で800gで3分間回します。上清液を吸引して吸い出してください。チューブを軽く叩いてペレットを割ります。
細胞を1%パラホルムアルデヒド0.5ミリリットルで再懸濁します。その後、細胞を4度の温度に保ち、光から保護してフローサイトメトリーによる分析を行います。フローサイトメトリーを用いてサンプルを解析し、1サンプルあたり1万件のイベントを捕捉します。
健康な個体の低密度好中球は末梢血単核細胞の約5%を占め、磁気隔離プロトコルでは約98%の回復率で低密度好中球が検出されました。好中球は膜マーカーCD10、CD11b、CD15、CD62L、CD66bを発現します。磁気的に精製された低密度好中球は好中球と同じ膜マーカーを発現しました。
精製された低密度好中球は多葉核を示し、好中球と似た大きさでした。好中球と低密度好中球の両方がPMA刺激に反応して活性酸素種を生成し、低密度好中球は好中球よりも高いレベルを生成しました。低密度好中球はPMA刺激に反応して好中球細胞外トラップを放出し、これはDNAとエラスターゼおよびシトルリンの共局在によって示されています。
精製好中球と低密度好中球の両方が、PMA処理後に類似の動態学と量を持つNETを放出しました。当プロトコルは、高度に純度が高く機能的な低密度好中球を迅速かつ再現性のある方法で得ます。私たちは、低密度好中球をヒト血液から分離するための標準化され、時間効率の良いプロトコルが存在しない問題に取り組みます。
このプロトコルは複雑な機器に対して特別な訓練を必要としず、FACSよりも経済的で高速です。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、健康な個人には稀であるが様々な疾患で著しく増加する末梢血単核球に見られる低密度好中球（LDN）に焦点を当てています。この記事では、密度勾配遠心分離法と磁気分離技術を用いて純粋で生存可能なLDNを単離する実用的な方法を提示しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 低密度好中球は、全身性エリテマトーデスやがんなどの疾患と関連しています。
- LDNの理解は、疾患メカニズムにおけるその役割に洞察を与えることができます。
- LDNの単離は、その機能と治療の可能性を研究するために重要です。
- 現在のLDN単離方法では、純粋で生存可能な細胞が得られない可能性があります。
研究の目的
- 低密度好中球の機能を特徴づける。
- 様々な疾患におけるLDNの役割を定義する。
- 末梢血からLDNを単離する効率的な方法を提示する。
使用した方法
- 血液採取における抗凝固剤としてのヘパリンの使用。
- 密度勾配分離のためのデキストランT500の適用。
- 細胞選別のための磁気マイクロビーズインキュベーション。
- 磁気カラムを使用したLDNの分離。
主な結果
- この方法は純粋で生存可能な低密度好中球を成功裏に単離します。
- LDNは疾患における機能的役割について特徴づけることができます。
- LDNの理解が向上することで、より良い治療戦略につながる可能性があります。
- この単離技術は様々な研究設定に適用できます。
結論
- LDNを単離することは、健康と疾患への影響を研究するために不可欠です。
- 提示された方法は、単離された細胞の純度と生存可能性を向上させます。
- LDNに関するさらなる研究は、免疫学と治療アプローチの進歩に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
