好中球単離プロトコル
2008年7月23日
好中球は炎症性免疫応答のサイトに到着する最初のセルの一つです、そしてその機能とメカニズムをin vitroで広く研究されている。我々は、市販の分離媒体を用いて全血からヒト好中球を分離するために標準の密度勾配分離法を示しています。
好中球単離プロトコル。この手順では、全血サンプル装置、遠心分離機、バイアルから白血球を抽出します。ボルテックスサーニードルとシリンジシリンジフィルター。
Milli pourブランドMX gv 0.22マイクロメーター材料。ハンクスペルと塩溶液の好中球分離には、2種類のHBSS溶液が必要です。塩化カルシウムを含むHBSSを使用して、ヒト血清アルブミンとの溶液を調製します。
塩化カルシウムを含まないHBSSは、好中球を懸濁して洗浄するために使用されます。この手順では、適切なHBSSソリューションを使用するように特に注意してください。ヒト血清アルブミン(HSA)は、pHとSMO圧を維持する血漿中のタンパク質です。
ウシ血清アマルガメート赤血球溶解バッファーは使用しないでください。これは、好中球分離メディアNIMシーダーラインラボリンパライトポリ分離メディアは、光から保護され、最良の結果を得るために冷蔵庫に保管されている好中球分離メディア、好中球分離メディアによって製造されています。すべての試薬は、使用時に室温で保存する必要があります。
実験の1時間前に試薬を冷蔵庫から取り出します。好中球分離用のH-B-S-S-H-S-A溶液を調製します。塩化カルシウムを入れたHBSSをバイアルにピペットで入れます。
HSAをシリンジに引き込みます。気泡を閉じ込めないでください。シリンジ針を取り外し、フィルターと交換します。
HSAをフィルターを通してHBSSバイアルボルテックス2ミックスに注入します 他の材料の準備ができていて、室温で、約15ミリリットルの全血を取得します。これにより、10〜15ミリリットルの10〜8番目の好中球が得られます。ドナーは、血液サンプルを提供する前の24時間、アルコールや市販薬を摂取してはいけません。
これらは分離プロセスを混乱させる可能性があります。全血は、メーカーの指示に従って、K1部、3部のクエン酸EDTAナトリウム、またはヘパリンに9部の血液を追加することにより、EDTAクエン酸塩またはヘパリンで抗凝固することができます。この手順では、次の手順について説明します。
血漿と単球を分離して除去します。好中球を分離し、赤血球を溶解する好中球層を自由懸濁して獲得し、最初の分離を行います。NIM層で好中球を取得します。
5ミリリットルの分離媒体を遠心分離チューブに集めます。分離媒体をチューブの下部に置くと、遠心分離機が血液を慎重に押し下げるため、フィルターとして機能することができます。NIM上に5ミリリットルの血液を重ねてきれいに分離します。
溶液を混ぜないように十分注意してください。このステップは、遠心分離機の混合を防ぐために、ピペットの先端を分離媒体の表面に近づけて、ゆっくりと慎重に実行します。500 RCFで35分間のソリューション。
摂氏20度から25度では、血液は6つの異なるバンドに分離するはずです。6つのバンドは、血漿単球、単離培地、好中球、その他の単離培地、および下部の赤血球ペレットです。これらの6つのバンドが明確で明確でない場合、分離プロセスはクリーンではなく、繰り返す必要があります。
分離不良の一般的な原因には、古い分離メディアのドナーが過去72時間以内にアルコールを摂取したこと、またはドナーがタイレノールやアスピリンなどの他の薬を摂取したことが含まれます。血漿単球と単離培地を慎重に取り外して廃棄します。.これらの層を密封可能なチューブに入れ、好中球の層と好中球の下にあるすべての分離媒体を慎重にピペットで清浄な遠心分離機ファイルに廃棄して、できるだけ多くの好中球を回収します。
多くの場合、下のレイヤーから分離メディアの一部を含めるのが最も簡単です。パレットの底部を邪魔しないでください。2番目の宣言は、好中球層を微細化することです。
好中球溶液をカルシウムを含まないHBSSで10ミリリットルに希釈します。チューブを数回反転させて、細胞を遠心分離機に懸濁します。好中球溶液。
10分間350RCF。摂氏20〜25度では、好中球と残留赤血球を含むチューブの底に赤いペレットが存在するはずです。ピペットでスープラナチンを取り外します。
底のペレットを乱すように注意してください。赤血球を溶解します。
サンプル中の赤血球は、溶解によって破壊されなければなりません。残存する赤血球を溶解するために、2ミリリットルの赤血球溶解バッファーをチューブに追加して蘇生します。ペレットをバイアルを3〜4の設定で渦巻いて吊り下げます。
渦の設定を4以上に増やすと、好中球が活性化する可能性があるため、避けてください。数秒間渦巻くか、口蓋を溶かすために渦をパルスする必要があるかもしれません。溶解液を250 RCFで5分間遠心分離します。
ソフトスタートオプションを使用して、サンプルへの損傷を最小限に抑えます。ピペットでスープラナチンを取り外します。ライシングプロセスを繰り返します。
必要に応じて、好中球の懸濁液を放出し、カルシウムを含まない500マイクロリットルのHBSSを各チューブに加えます。ペレットを3〜4の設定でボルテックスし、カルシウム遠心分離機を使用せずにHPSSで10ミリリットルに希釈します。250 RCFで5分間の好中球は、スナットを吸引して廃棄します。
HSA溶液でHBSSの250マイクロリットルにペレットを再懸濁し、2回10から6倍。ミリリットルあたりの好中球は通常収集されます。
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概要
この記事では、全血からヒトの好中球を分離するための標準的な密度勾配分離技術の方法を紹介します。好中球は炎症性免疫応答において重要な役割を果たしており、その分離の理解はさらなる研究にとって不可欠です。
主要な研究要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- 好中球は炎症反応における最初の応答者の1つです。
- その機能とメカニズムはin vitroで広範に研究されています。
- 分離技術は好中球の挙動と機能を研究するために不可欠です。
- 標準化された方法は研究における再現性を向上させます。
研究の目的
- ヒトの血液から好中球を分離する信頼性の高い方法を実証すること。
- 炎症における好中球の機能に関するさらなる研究を促進すること。
- 研究室で容易に採用できるプロトコルを提供すること。
使用した方法
- 密度勾配分離法。
- 市販の分離培地の使用。
- 遠心分離機とバイアルを含む機器。
- 塩化カルシウムとヒト血清アルブミンを含むHBSSを使用した溶液の調製。
主な結果
- 全血サンプルからの好中球の成功的な分離。
- 分離方法の有効性の実証。
- 研究者のための明確なプロトコルの提供。
- 様々な条件下での好中球の挙動を研究するための潜在的な応用。
結論
- 提示された方法は好中球の分離に効果的です。
- このプロトコルは免疫応答に関する研究を強化できます。
- さらなる研究は、この分離技術を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
