Name: 好中球単離プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶ 密度勾配遠心法を用いたヒト好中球単離法。HBSS溶液とヒト血清アルブミンを使用し、赤血球溶解処理で高純度の好中球を取得できます。炎症免疫応答研究に応用可能です。

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NIH R01 HL56621から資金調達。

好中球単離プロトコル<ol><li>室温にすべての試薬をもたらす。 </li><li>遠心分離管に好中球分離培地5.0 mlを収集する。分離媒体上に血の慎重層5.0 mlである。ゆっくりと慎重に、そして血液やメディアの混在を防ぐためにメディアの表面に近いピペットの先端で、この手順を実行します。 </li><li> 20〜25時35分、500 RCFで遠心℃、血漿、単球、分離培地、好中球、より多くの分離培地、および赤血球細胞ペレット（図1）：血液は、6つの異なるバンドに出て分離する必要があります。これらのバンドが明確でない場合は、分離プロセスは、クリーンではなかったと繰り返される必要があります。 </li><li>慎重にピペットを使用して、上位3階層を（プラズマ、単球、および分離培地）を取り外します。これらの層を廃棄してください。 </li><li>慎重に好中球と好中球の下に分離媒体のすべての層をピペットで。新しい遠心チューブにソリューションを配置。 </li><li>のCa 2 + / Mg 2 +をせずにHBSSで10mlへの好中球希薄溶液。細胞を中断するチューブを数回転倒。 </li><li> 10分350 RCFで好中球ソリューションを遠心分離します。赤色のペレットは、好中球と残留赤血球（RBC）を含む、チューブの底に存在すべきである。慎重にペレットが乱されていないことをピペットで上清を取り除きます。 </li><li>残留赤血球を溶解するために、チューブに2ミリリットル赤血球溶解バッファーを追加します。ペレット、渦3-4設定でバイアルを再懸濁させる。これは好中球が活性化する原因となりますので、4の上に渦の設定値を増加させることは避けてください。それは数秒間ボルテックスに必要になることがあります、またはペレットを溶解するために渦を&quot;パルス&quot;へ。 </li><li> 5分の250 RCFでチューブを遠心分離します。ピペットで上清を取り除きます。必要に応じて、溶解プロセスを繰り返します。 </li><li>のCa 2 + / Mgの2を使わずに 500μlのHBSSを追加する+各チューブに。再び、渦は3-4の設定でペレットを再懸濁します。のCa 2 + / Mg 2 +をせずにHBSSで10mlに希釈する。 </li><li> 5分の250 RCFでチューブを遠心する。上清を吸引して捨てます。 </li><li> 250μlのHBSS / HSAの溶液（2％HSA）でペレットを再懸濁する。次いで、細胞を計数し、所望の濃度に調節することができる。 </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

密度勾配分離法は、ナトリウムmetrizoateとデキストラン500の混合物を用いて全血からヒト好中球を分離するために使用されます。このメソッドは、フェランテとトーン（1980）による好中球を分離するために変更されたBoyum（1968）によって単核白血球分離法に基づいています。 ドナーから収集した後、全血は、EDTA、クエン酸、またはヘパリンで抗凝固することができます。彼らは短命なので、好中球は、コレクションの2〜4時間以内にご使用ください。手順は、密度勾配媒体上階層化全血を、遠心分離、好中球層の分離、および残存赤血球の溶解で構成されています。次いで、細胞を洗浄し、計数し、所望の濃度に再懸濁する。 6バンドが最初の遠心分離工程の後に異なるでない場合は、分離プロセスは、クリーンではなかったと繰り返される必要があります。明確に分離、分離培地の有効期限が切れたり、汚染されていないことを確認してください。献血者は採血前72時間以内にアルコールや薬を消費した場合の分離にも失敗する場合があります。 分離操作中に好中球活性化を防ぐために、それはカルシウムなしでHBSSを使用するのが最適です+ / Mg2 +の、イオンが主要な細胞が示されているから...

<table><tbody><tr><td>Lymphocyte Poly(R)</td><td>試薬</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>代替品としてPolymorphprepTMが使用可能</td></tr><tr><td>塩化カルシウム不含Hank&amp;rsquo;s 平衡塩溶液</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>試薬</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パステールピペットおよび球電球</td><td>器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>試薬</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Lymphocyte-Poly (R)の代替試薬</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>その他</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0.22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, ガンマ線滅菌済み</td></tr><tr><td>塩化カルシウム含有Hank&amp;rsquo;s 平衡塩溶液</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

好中球単離プロトコル

Neutrophil Isolation Protocol

好中球多形核顆粒球（PMN）はヒトおよび炎症性免疫応答のサイトに到着する最初のセルの中で最も豊富に存在する白血球である。炎症におけるそれらの重要な役割のために、このような運動、サイトカイン産生、貪食、および腫瘍細胞の戦闘などの好中球の機能は広範囲に研究されています。好中球が短命であり、コレクションの2-4時間以内に使用すべきである特に以来、好中球の特定の機能を特徴づけるために、他の血液細胞からそれらを分離する、クリーンで高速、かつ信頼性の高い方法は、in vitro試験が望ましい。ここで、我々は、ナトリウムmetrizoateとデキストラン500の混合物である市販の分離媒体を用いて全血からヒト好中球を分離するために標準の密度勾配分離法を示しています。手順は、密度勾配媒体上階層化全血を、遠心分離、好中球層の分離、および残存赤血球の溶解で構成されています。次いで、細胞を洗浄しカウント、および所望の濃度の緩衝液に再懸濁されている。正しく実行する場合、このメソッドは&gt; 95％の生存率で&gt; 95％の好中球のサンプルを得ることが示されている。

好中球は炎症性免疫応答のサイトに到着する最初のセルの一つです、そしてその機能とメカニズムをin vitroで広く研究されている。我々は、市販の分離媒体を用いて全血からヒト好中球を分離するために標準の密度勾配分離法を示しています。

好中球多形核顆粒球（PMN）はヒトで最も多く存在する白血球であり、炎症部位に最初に到達する細胞の一つである……

好中球分離プロトコル。この手順では、全血サンプルから白血球を抽出します。使用機器は遠心分離機とバイアルです。ボルテックスミキサー、針および注射器、シリンジフィルターを使用します。MilliporeブランドのMX GV 0.22 µmフィルターを使用します。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を用いた好中球の分離には、2種類のHBSS溶液が必要です。塩化カルシウムを含むHBSSを用いて、ヒト血清アルブミンを含む溶液を調製します。好中球の懸濁および洗浄には、塩化カルシウムを含まないHBSSを使用します。本手順では、適切なHBSS溶液を使用するように特に注意してください。ヒト血清アルブミン（HSA）は、pHおよび血漿浸透圧を維持する血漿中のタンパク質です。bovine serum amalgamate red cell lysis bufferは使用しないでください。本製品はRoche Diagnostics社によって製造されています。好中球分離用培地NIM（Cedar Line Labs社製）およびLymph light Poly分離培地を使用してください。最良の結果を得るために、光を避け、冷蔵庫で保管してください。すべての試薬は、使用時に室温に戻しておく必要があります。実験の1時間前に試薬を冷蔵庫から出しておく。好中球分離用のHBSS-HSA溶液を調製する。塩化カルシウム含有HBSSをバイアルにピペットで分注する。HSAをシリンジに吸い取ります。気泡が入らないように注意してください。シリンジの針を取り外し、フィルターに交換します。フィルターを通してHSAをHBSSバイアルに注入し、ボルテックスで2回混合します。他の材料の準備が整い室温になったら、全血を約15 mL採取します。これにより、10⁸個の好中球を含む10〜15 mLのサンプルが得られます。ドナーは、血液サンプルの採取前24時間は、アルコールや市販薬を摂取していない必要があります。これらは分離プロセスを妨げる可能性があります。全血は、血液9部に対してK3EDTA、クエン酸ナトリウム、またはヘパリンを1部の割合で添加するか、あるいは製造元の指示に従ってヘパリンを添加することで、抗凝固処理を行うことができます。本手順では、以下のステップについて説明します。血漿と単球を分離して除去します。赤血球を溶血させ、赤血球を含まない好中球層を分離して回収し、一次分離した好中球を懸濁させます。NIM層から好中球を回収します。遠心分離管に分離培地を5 mL分注します。遠心分離によって血液が培地を通過して下方へ押し下げられるため、分離培地を管の底の方に配置することでフィルターとして機能させます。きれいな分離を行うため、NIMの上に血液5 mLを慎重に重層します。溶液が混ざり合わないよう、細心の注意を払ってください。遠心分離による混合を防ぐため、ピペットチップを分離ゲルの表面に近づけ、ゆっくりと慎重にこの操作を行ってください。500 RCFで35分間遠心分離します。20～25°Cにおいて、血液は6つの明確な層に分離されるはずです。これら6つの層は、血漿、単球、分離媒体、好中球、さらに分離媒体、そして最下層の赤血球ペレットです。これらの6つの層が明確に分かれていない場合は、分離プロセスが適切に行われなかったことを意味し、再度実施する必要があります。分離不良の一般的な原因としては、分離培地の劣化、ドナーによる過去72時間以内のアルコール摂取、あるいはタイレノールやアスピリンなどの他の薬剤の服用が挙げられます。血漿、単球、および分離培地の層を注意深く取り除き、廃棄してください。これらの層は密閉可能なチューブに入れ、慎重に廃棄します。その後、好中球の層および好中球より下の分離培地をすべて、きれいな遠心管に注意深くピペットで移し、可能な限り多くの好中球を回収してください。下層の分離培地を少量含めるように採取するのが最も効率的なことが多いです。底部のペレットを乱さないようにしてください。次に、好中球層を精製します。カルシウム不含HBSSを用いて、好中球溶液を10 millilitersに希釈します。チューブを数回転倒混和して細胞を懸濁させ、好中球溶液を遠心分離します。350 RCFで10分間遠心分離します。20〜25°Cにおいて、好中球および残留赤血球を含む赤色のペレットがチューブの底部に形成されます。ピペットを用いて上清を除去します。底部のペレットを乱さないように注意しながら、赤血球を溶血させます。サンプル中の赤血球を溶血させて除去する必要があります。残存する赤血球を溶血させるため、赤血球溶血バッファー 2 mL をチューブに加えて再懸濁させます。ペレットを懸濁させ、バイアルをボルテックスミキサーの設定 3～4 で撹拌してください。好中球が活性化する可能性があるため、ボルテックスの設定を4以上に上げないでください。ペレットを溶解させるために、数秒間ボルテックスにかけるか、パルス操作を行う必要がある場合があります。溶解液を250 RCFで5分間遠心分離します。サンプルの損傷を最小限に抑えるため、ソフトスタートオプションを使用します。ピペットで上清を除去します。溶解工程を繰り返します。必要に応じて好中球懸濁液を回収するため、各チューブにカルシウム不含HBSSを500 µL加えます。ペレットを強度3～4でボルテックスし、カルシウム不含HPSSを用いて10 mLに希釈します。250 RCFで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。ペレットを 250 µL の HSA 含有 HBSS 溶液で再懸濁します。通常、1 mL あたり 2×10⁶ 個の好中球が回収されます。

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生物学

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好中球単離プロトコル

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