豚脂肪組織から脂肪由来幹細胞および脂肪細胞の効率的な単離
May 26th, 2026
ここでは、処理時間>90%短縮、高い細胞生存率、広範な適合性を特徴とする、脂肪由来幹細胞および脂肪細胞を効率的に単離する標準的な方法を提示します。
この研究の目的は、脂肪組織から細胞を効率的かつ迅速に分離することです。従来の消化は時間がかかり、消化が過剰になることもあります。酵素と機械的な波動測定は穏やかな分散を提供し、分離時間を短縮します。
まず、安楽死した豚の皮下脂肪組織の一部を培養皿に入れます。脂肪組織と真皮の間の自然な平面に沿って解剖し、厚さ2〜3ミリメートルの完全なULBシートを得ます。ULBは氷のように冷たい無菌生理食塩水で一度だけ洗い流してください。
滅菌皿を破った後、滅菌皿内の組織を事前に滅菌された天秤で計量します。組織1.8グラムごとに、氷のように冷えたD-Hank'sバッファーを10ミリリットル加え、組織を完全に水に浸したままにします。無菌の外科用ハサミを使って、組織から見える血管をすべて特定・切除します。
結合組織や線維化性の成分をすべて除去してください。切り離した材料は指定されたバイオハザード容器に捨ててください。D-ハンクのバッファー内の組織をすすいで、残留血液や破片を除去してください。
破った皿を破った後、滅菌培養皿の組織をあらかじめ滅菌された天秤で計量してください。洗浄組織の断片1.8グラムを無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離機チューブに移します。チューブに800マイクロリットルのA型組織解離緩衝液を加えます。
滅菌眼用ハサミを使って、チューブ内の組織を約1〜2立方ミリメートルの大きさの細かい塊に細かく刻みます。ミンス組織と周囲のバッファーを新しいマイクロ遠心分離機チューブに移します。チューブに200マイクロリットルのA型組織解離剤を加えます。
チューブを手で優しく回転させて3回振って中身を混ぜます。脂肪片が解離液に完全に浸透していることを確認しましょう。チューブキャップがしっかり閉じているか確認してください。
チューブを37度の金属浴槽に入れ、5〜10分間培養します。部分的に消化された脂肪組織をバッファー内で、機械的解離系専用の無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。脂肪組織用のプリセットプログラムを実行し、200ヘルツの正弦波を使って機械的解離を行います。
細胞懸濁液を集め、200マイクロメートルのセルストレーナーを通して新しい50ミリリットルの遠心分離機管に通します。4度の予備冷却済みD-Hank溶液を5ミリリットル加えます。ストレーナーをD-Hankの溶液で2回すすいでください。
ろ過セルの懸浮液を500Gで4度の温度で5分間遠心分離します。無菌パスツールピペットで上澄液脂質層を吸引して除去し、脂肪細胞層を保護するために1ミリリットルのバッファーを残します。第3および第4層を乱さずに、脂肪細胞を含む第2層を採取します。
三つ目の層を吸引して捨てる。基質血管分画(SVF)を含む底のペレットにD.Hank'sバッファーを1ミリリットル加えます。細胞ペレットを緩衝液に優しく再懸浮させ、細胞濃度を2〜5×10の6細胞/ミリリットルの乗数にします。
SVFセル懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管で準備します。使用まではサスペンションを氷の上に置いておく。無菌の0.5ミリリットルマイクロ遠心機チューブに、SVFセル懸濁液10マイクロリットルと0.4%トリパンブルー溶液10マイクロリットルを加えます。
ピペットを優しく上下に3回行います。染色された細胞混合物を10マイクロリットル、自動細胞計数器に適したカウントスライドに移します。試料がチャンバーに完全に満たされ、溢れていないことを確認します。
カウントスライドを自動セルカウンターに挿入します。トリパンブルーアッセイタイプを選択し、必要に応じて細胞濃度範囲を調整してください。カウントを押して自動セルカウントを開始します。
カウントチャンバーの画像を監視し、生細胞と死細胞の自動的な区別を観察してください。細胞の生存率と機器画面に表示される生存可能な細胞の総数を記録します。各サンプルに対して3回独立した測定を行います。
脂肪組織の平均生存率と細胞収量を計算します。D.Hank'sに5マイクログラム/ミリリットルと1マイクロモルのボディパイを用いて染色液を準備します。分離した脂肪細胞を染色液で37度の環境で15分間培養します。
蛍光顕微鏡に適したスライド準備には、自作の脂肪細胞に優しいスライドカバーガラスシステムを使用してください。自作の脂肪細胞に優しいマウントシステムにより、完全な脂肪細胞の均一な分布が可能となり、明確なイメージングが可能となりました。従来の方法で密集した多層的な配列を生み出すのに対し、抽出された脂肪細胞は完全な構造と正常な形態を示しました。
機械的解離法で得られた脂肪細胞の生存率は、従来の酵素的加水分解法と比べて有意に高かった。精製・培養された脂肪由来幹細胞は、均一な線維芽細胞のような形態を示し、細長い紡錘状の細胞が秩序正しく配置されていました。ほとんどの細胞は染色されず、生存可能性を示しましたが、青色に染まった細胞はごく一部で、死んだ細胞を表していました。
このプロトコルにより、研究者は脂肪貯留施設全体で分離された細胞特性を比較できます。プロトコルから分離されたSVFはオルガノイド構築や脂肪幹細胞の精製に利用できます。今後の研究では、デポ全体の細胞外マトリックスの脂肪組織の違いを考慮し、分離法をさらに最適化できる可能性があります。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a rapid and efficient protocol for isolating adipose-derived stem cells (ADSCs) from adipose tissue using a combination of enzymatic digestion and mechanical wave-based dissociation. The method, exemplified by the SoniConvert system, significantly reduces processing time, improves cell viability, and yields high-quality single-cell suspensions suitable for downstream applications in regenerative medicine and research.
Key Study Components
Area of Science
- Regenerative medicine
- Cell biology
- Stem cell isolation
Background
- ADSCs are valuable for tissue repair, disease modeling, and cell therapy due to their multipotency and immunomodulatory properties.
- Traditional isolation methods are time-consuming (1–3 hours), yield low cell viability (<70%), and suffer from batch variability.
- Efficient, reproducible isolation of high-viability ADSCs is critical for research and clinical translation.
- Mechanical wave-based dissociation offers a potential solution to these limitations.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a rapid, gentle, and reproducible protocol for isolating ADSCs from adipose tissue.
- To compare the new method's efficiency and cell viability with traditional enzymatic digestion protocols.
- To provide a platform compatible with various downstream applications, including organoid construction and cell culture.
Methods Used
- Harvesting and preparation of subcutaneous adipose tissue from euthanized pigs.
- Enzymatic digestion using a tissue-specific dissociation buffer and agent.
- Mechanical dissociation via a preset program using a 200 Hz sinusoidal wave (SoniConvert system).
- Filtration, centrifugation, and separation of stromal vascular fraction (SVF) and adipocytes.
- Cell viability assessment using trypan blue staining and automated cell counting.
- Fluorescence staining and microscopy to assess adipocyte morphology and integrity.
Main Results
- The core isolation process is completed in approximately 30 minutes, representing a >90% reduction in processing time compared to conventional methods.
- Cell viability of isolated ADSCs is 80–95%, significantly higher than traditional protocols.
- The method yields intact, morphologically normal adipocytes and uniform, viable ADSCs.
- Single-cell suspensions are suitable for primary culture, flow cytometry, cytotoxicity assays, and organoid construction.
Conclusions
- The combined enzymatic and mechanical wave-based protocol enables rapid, high-viability isolation of ADSCs.
- This approach reduces variability and preserves cell integrity, facilitating adipose tissue research and clinical applications.
- Future optimization may further improve isolation efficiency across different adipose depots.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Porcine Adipose Tissue Harvesting and Preparation
1:36
Dissociation of Adipose Tissue for Cell Isolation
3:08
Isolation of Adipocyte and Stromal Vascular Fractions (SVF)
4:21
Analysis of SVF Cell Suspension and Adipocyte Samples
6:16
Results
7:23
Conclusion
