Name: プラセンタから造血幹細胞の単離と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: 学ぶ マウス胎盤から造血幹細胞を単離し、微小環境ニッチ内で可視化する実験手法。胎生期におけるHSCの発生と拡張メカニズムを解明し、幹細胞生物学の理解と再生医療への応用に貢献します。

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1。胚の除去と胎盤切開<ol><li>開始するには、胚が最初に妊娠した母獣から分離する必要があります。 </li><li>動物は、承認された手順に従って安楽死させる - 私たちのケースで我々は、イソフルラン麻酔薬の致死量を使用するつもりです</li><li>最初に、エタノールで腹をスプレーし、ハサミで小さな切開を行います。 </li><li>腹部を明らかにし、腹膜を切り開くために両手で皮膚を離れて引き裂く。 </li><li>鉗子で、子宮角をピックアップし、それぞれの先端にはさみを使用してそれらを収集する。 PBSと氷の上で場所で満たされたペトリ皿の子宮角に置きます。また、胎盤を分離する前にPBSで数回洗浄してください。我々は現在、胎盤を分離することができます。 </li><li> two鉗子で、慎重に胚のconceptusesを周囲の子宮内膜組織を離れて剥離を開始。これはその後の解剖の手順を複雑にするので一つは、胚への構造的な損傷を与えていない穿刺またはそうでなければ注意する必要があります。 </li><li>氷上でPBSで新しいペトリ皿の中で孤立conceptusesを置き、すべてのconceptusesが子宮内膜から解放されるまで続けます。 </li><li>顕微鏡下と離れて胎盤から脱落膜ピールtwoピンセットで配置されたPBSで新しいペトリ皿一つ受胎を転送する。脱落膜の細胞は単一細胞懸濁液およびフローサイトメトリーを妨害するため、可能な限り脱落膜の限りを削除します。滑らかな連続的な剥離動きが最良の結果を達成することをお勧めします。 </li><li> two器官の間の接合部での胎盤から卵黄嚢を切り​​取って、そっと胎盤から卵黄嚢と卵黄血管を引き出します。注意は、特に初期の胚で、胎盤の絨毛膜板を混乱しないように注意してください。 </li><li>注意深くピンセットと相互に臍帯と胎盤の絨毛膜板を保持し、離れて胎盤から臍帯と接続されている胚を引き出します。 </li><li>単一細胞懸濁液の調製中に凝集細胞を最小限にするために胎盤の端に余分な巨大な細胞組織を削除します。 </li><li> PBS 5パーセントFCSとし、氷の上で、そのような15 mlのファルコンチューブのような適当な容器に胎盤を収集する。解剖全ての胎盤に対して、この手順を実行します。 </li><li>この時点で、あなたはそのような体外培養や移植のように、フローサイトメトリー、機能アッセイのための単一細胞懸濁液の調製に進むことができます、または組織の固定および最終的な免疫組織化学のために埋め込み固定冷凍ブロック用に全体胎盤を準備。 </li></ol> 2。胎盤組織の単細胞懸濁液の調製<ol><li>我々は現在、FACS分析のための胎盤から単一の細胞懸濁液を生成する方法を紹介します。 </li><li>胎盤からの単細胞懸濁液を調製するために、機械的および酵素的解離が必要です。最初に10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液をPBSに0.1％コラゲナーゼ溶液を調製。 </li><li>あなたがいくつあるかに応じて、胎盤にコラゲナーゼ溶液の適切なボリュームを追加します。倍胎盤のボリュームと2〜5ミリリットルの間であるボリュームをお勧めします。 </li><li>機械的に針3回を通じてコラゲナーゼ溶液と胎盤を継代により組織を混乱させるために5 mlのシリンジに装着した16 G針を使用してください。 18 - G針を繰り返します。 </li><li> 45分間37℃、5％CO 2インキュベーター内のサンプルを置きます。 </li><li>コラゲナーゼ20 - G針を介して、通過細胞溶液、および37に、さらに45分間インキュベート℃で45分間のインキュベーション後</li><li>それぞれの針と22 - Gと25 Gの針を介してコラゲナーゼ、通過細胞溶液で1.5時間、総インキュベーション後の3回。 </li><li>新しい15 mlのファルコンチューブに接続されている50μmのフィルターを通してサンプルをフィルタリングする、4℃でPBS 5パーセントFCSと遠心機で洗う℃で5分間300℃× gで</li><li>この時点で、我々は、FACS分析または機能性アッセイに適した単一の細胞懸濁液を持っている。 </li></ol> 3。凍結切片用組織の固定<ol><li>すぐにそれぞれの胚から胎盤を分離した後、それらは寒い1X PBSに配置されます。通常は96ウェルプレートは、若い胎盤（E8.5 - 11.5）に適していますが、古い胎盤で、E12.5と古いが、24ウェルプレートの方が便利かもしれません。 </li><li>それぞれの胎盤がよく新鮮な融解4パーセントparaformaldahydeまたはPFAで満たされた新たに転送されます。 E12.5胎盤の場合、組織は手で新しいウェルに移動されますが、E10.5のために、ピペットで慎重にPBSを除去し、PFAを追加することができます。それは、胎盤が完全に組織の年齢やサイズに応じて、4℃で2〜4時間浸漬されていることが重要です。 </li><li> 30％ショ糖に組織を移し、あるいは組織が非常に小さく、壊れやすい場合は、PFAを吸引し、直接ショ糖を加える。この段階では、胎盤は、溶液中でフローティングされます。組織は、4℃で一晩滞在しましょう​​℃に</li><li> 30％ショ糖で一晩ステップの後、組織は最終的に適切な凍結保存を示すウェルの底に沈むはず。ショ糖溶液の半分を削除して、OCTでボリュームを交換し、℃で1-2時間を4に戻って組織を置く。これは、OCTの浸透を容易にします。 </li><li>それを埋め込むことができる、その後、1時間に100％OCTに組織を移す。 </li></ol> 4。固定組織の埋め込み<ol><li>適切な組織の識別（ショーの例の金型）のラベルは、プラスチック金型。 </li><li> OCTのソリューションからティッシュを引き出して、下に向け臍帯側と円盤状の胎盤を向きや慎重に確実に圧力をリリースする前に、前後に刃を移動するために確実にきれいなカミソリの刃でスライスして半分に胎盤を切るさらにカット。胎盤は、後に胎盤造血幹細胞を可視化するために最善prientationを達成するために半分にカットされます。 </li><li>金型の底面と接触する面取り部と金型の下部に片足胎盤の半分。残りの半分のための新しい金型を繰り返します。 E10.5胎盤の場合は、両方の半分は、同じテクニックを使用して、同じ金型に配置されることがあります。 </li><li>金型にOCTを注ぐときに、それは正しい方向に胎盤を維持することが困難な場合があります。鉗子で組織の半分を保持することによって場所に胎盤を固定します。徐々に金型内にOCTのソリューションを注ぎ、気泡を生成することは避けてください。 E10.5胎盤の場合は、鉗子によって1つの組織の半分をホールドし、鉗子の外側に対して、他の組織の半分を置きます。ゆっくりとしてE12.5胎盤で説明したOCTのソリューションを注ぐ。 </li><li>金型がOCTでいっぱいになると、すぐにドライアイスの上に金型を配置、OCTは組織を凍結白いフラッシュを向けるだろう</li><li> DRIERITEを含む小さなビニール袋に金型を配置し、直ちに-80℃の冷凍庫で保管してください。 </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

このプロトコールに記載される実験手順は、胎盤組織と造血幹細胞や前駆細胞の分離と可視化が可能になります。胎児の発育を通して胎盤や他の胎児の造血臓器における造血幹細胞の予想される細胞の収量と数に関する包括的な概要については、我々はスゲカスらを参照してください。 2005年。胎盤で造血幹細胞および他の造血細胞の開発のローカライズのために我々はローズ、らを参照してください。 2008

材料のリスト ： 100mMのグルコース 10mMのNaN3 15 mlコニカルチューブ（BD） 16 G、18 G、20 G、22 G、25 G針（BD） 30％のショ糖液 35ミリメートルのペトリ皿（BD） 4％パラホルムアルデヒド 50 - mのセルのフィルタ（Celltrics） 5 mlのシリンジ（BD） アルカリホスファターゼ基質キットI（ベクトル赤、ベクトル） アルカリフォスファターゼ基質キットIII（ベクトル青、ベクトル） 抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン、P / S）ソリューション コラゲナーゼI型（シグマ） Cryomold使い捨てビニール片金型（10mm x 10mmの× 5mmの、組織- Tek社） サイトケラチン一次抗体（DakoCytomation） 解剖ピンセット、ステンレス鋼やチタン、5番または55 DRIERITE ウシ胎児血清（FBS） Fisherbrandプラスチック顕微鏡スライドメーラー（フィッシャー） グルコースオキシダーゼ1000u/ml レバミゾール（ベクター） マウントメディア、水性ベースのマウンティングメディウム（VectamountTM AQ） 正常ウマ血清（ベクトル） 最適な切削温度（OCT、ティッシュ- Tek社） ペルオキシダーゼ基質キットDAB（ベクトル） リン酸塩は、カルシウム/マグネシウム（WのCa2 + / Mg2 +を）と緩衝生理食塩水（PBS） リン酸塩は、カルシウム/マグネシウム（W / OのCa2 + / Mg2 +は）なしで緩衝生理食塩水（PBS） プラスチック製のスライドボックス（100スライドを保持する） プラスチックチューブ（Nalgene 180 PVC無毒オートクレーブ可能） ポリプロピレン丸底試験管5 mlの（12x75ミリメートル、BDファルコン） プロテイナーゼK 20mg/ml溶液（Amresco） 研究プロダクツインターナショナルコーポレーションスーパーパップペンHT *スライドマーカー（2,5 mmの、フィッシャー） 組織培養U字型（丸底）治療を96ウェルまたは24ウェルプレート（BDファルコン） Tween20を、SigmaUltra（シグマ） チラミド増幅キット（Invitrogen社） ベクタステインABCアルカリホスファターゼスタンダードキット（ベクター） ベクタステインABC標準エリートキット（ベクター）

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

造血幹細胞（HSC）は、自己更新し、個々の生涯を通して血液系統のすべての細胞型を生成する機能を持っている。すべての造血幹細胞は、それらのプールサイズは自己複製細胞分裂によって維持され、その後、胚発生時に出現する。多くの解剖学的部位が胎児の造血中に参加するとHSCの開発の過程を調節する造血幹細胞との重要な発達のイベントの解剖学的起源を特定することはややこしくなっている。最近、我々は造血幹細胞がユニークな微環境のニッチ（スゲカス、ら、2005、ロードス、ら2008）で生成し、展開されている主要な造血器官として胎盤を同定した。その結果、胎盤は、彼らの出現と初期の展開時の造血幹細胞の重要な源です。 この記事では、我々はそれぞれ、造血幹細胞および胎盤におけるHSCプールの大きさのピークの開始の発達段階に対応するE10.5からマウス胎盤の分離およびE12.5胚の解剖の技術を、示す。さらに、我々はフローサイトメトリーまたは機能アッセイで使用するための単一細胞懸濁液中に胎盤組織の酵素的および機械的解離のために最適化されたプロトコルを提示する。我々は、胎盤の単細胞懸濁液のためのコラゲナーゼの使用は、造血幹細胞の十分な収量を示すことを発見した。胎盤からHSC収量に影響を与える重要な要因は、前に機械的解離の度合い、及び酵素処理、の期間です。 我々はまた彼らの正確な細胞のニッチにおける免疫組織化学によって開発造血幹細胞の可視化のための固定凍結胎盤組織切片の調製のためのプロトコルを提供しています。造血特異的な抗原はパラフィン包埋切片の準備中に保持されていないとして、我々は日常的に胎盤造血幹細胞および前駆細胞をローカライズするための固定凍結切片を使用してください。

我々は、開発中の主要な造血器官として胎盤を同定した。我々はその造血幹細胞（HSC）が生成され、ユニークな微環境のニッチの胎盤で展開されている両方とも発見。ここで、我々はマウス胎盤における造血幹細胞の分離と可視化に必要な実験手法を説明します。

造血幹細胞（HSC）は、個体の生涯を通じて自己複製し、すべての血系統の細胞型を生成する能力を備えている。...

こんにちは、Mikkolaです。私の研究室へようこそ。当研究室の主な目的は、造血幹細胞の発生について研究することです。私たちは胚発生において、胎盤が主要な造血器官であることを突き止め、造血幹細胞が胎盤内の独自の微小環境ニッチにおいて生成および増殖することを発見しました。したがって、胎盤は造血幹細胞の出現および初期拡大における供給源として極めて高い価値を持っています。本日は、胎盤からの造血幹細胞の分離、および独自の微小環境ニッチにおける造血幹細胞の可視化に必要な実験手法を、私の研究室のメンバーが解説します。こんにちは、UCLA分子細胞・発生生物学部のHannah Mola博士の研究室のChriss Gekaです。本日は、マウス胎盤の解剖方法と、胎児造血幹細胞のFACS解析に向けた胎盤組織の単一細胞懸濁液の調製方法について解説します。また、私はカトリーナ・ローズで、免疫組織化学染色に向けた胎盤組織の調製方法について解説します。それでは始めていきましょう。まず、妊娠した母動物から胚を分離する必要があります。動物は承認された手順に従って安楽死させます。本手順では、麻酔薬であるイソフルランの致死量を使用します。まず、腹部をエタノールで噴霧し、はさみで小さく切開します。両手で皮膚を剥がして腹部を露出し、ピンセットで腹膜を切開します。子宮角を持ち上げ、それぞれの遠位端をはさみで切り取って回収します。子宮角をPBSで満たしたペトリ皿に入れ、氷上に置きます。また、2本のピンセットで胎盤を分離する前に、PBSで数回洗浄することを忘れないでください。胚概念を取り囲む子宮内膜組織を慎重に剥がし始めます。これらの胚は、胎盤における造血幹細胞（HSC）がピークに達する発生段階である胚齢12.5日のものです。胚を穿刺したり、その他の構造的損傷を与えたりすると、その後の解剖手順が困難になるため注意してください。分離した概念をPBSを入れた氷上の新しいシャーレに移し、すべての概念が子宮内膜から取り出されるまでこの操作を続けてください。1つの概念体（conceptus）を、PBSを入れた新しいペトリ皿に移し、顕微鏡下に置きます。2本のピンセットを用いて、Gプラセンタから脱落膜（deidra）を剥がします。脱落膜細胞は干渉するため、可能な限り脱落膜を取り除いてください。単一細胞懸濁液およびフローサイトメトリーを用いて行います。最良の結果を得るためには、滑らかに連続的に剥離させる動作が推奨されます。なお、胚発生10.5日目（E 10.5）のような若齢の胚を扱う場合、外胚葉（deidra）が概念体全体を包み込んでいることに注意してください。E 12.5の胚とは異なり、E 10.5では造血幹細胞（HSCs）が胎盤内で出現し始めたばかりの状態です。E 10.5とE 12.5の胚では、大きさにかなりの差があることに注意してください。卵黄嚢と胎盤の接合部で卵黄嚢を切り離し、卵黄嚢と臍帯血管を胎盤から慎重に引き離します。胎盤のCHOプレートを損傷させないよう、特に初期胚を扱う際は細心の注意を払ってください。一方のピンセットで胎盤のCHOプレートを慎重に保持し、もう一方のピンセットで臍帯を保持します。臍帯とそれに付着している胚を、胎盤から離れるように移動させます。胎盤の端にある余分な巨細胞組織を除去します。単一細胞懸濁液の調製中に細胞の凝集を最小限に抑えるため、PBSおよび5% FCSを入れた15 ML Falconチューブなどの適切な容器に胎盤を回収し、氷上に置きます。解剖したすべての胎盤についてこの操作を行います。この時点で、in vitro培養や移植などのフローサイトメトリー機能解析用の単一細胞懸濁液の調製に進むか、あるいは後の免疫組織化学染色のための組織固定および固定凍結ブロック包埋に向けて胎盤全体を調製することができます。ここでは、FACS解析用に胎盤から単一細胞懸濁液を調製する方法を説明します。まず、10% FCSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むPBSで、0.1%コラゲナーゼ溶液を調製します。胎盤の量に応じて、適切な量のコラゲナーゼ溶液を添加してください。胎盤の体積の2倍の量、具体的には2～5 mLの間であることが推奨されます。5 mlシリンジに16ゲージの針を取り付け、コラゲナーゼ溶液と胎盤を針に通して3回繰り返し、組織を機械的に分散させます。同様の操作を8ゲージの針を用いて行います。45分間のインキュベーション後、サンプルを37 °C、5%CO2インキュベーターでさらに45分間インキュベートします。コラゲナーゼ処理による継代において、細胞溶液を20ゲージの針に通した後、コラゲナーゼによる合計1時間半のインキュベーションに続き、37°Cでさらに45分間インキュベートします。その後、細胞溶液を22ゲージおよび25ゲージの針にそれぞれ3回ずつ通します。次に、サンプルを新しい15 mL Falconチューブに取り付けた50 µmフィルターでろ過し、PBSに5% FCSを添加した溶液で洗浄し、4°Cで5分間、300 ×gで遠心分離します。これで、FACS解析に適した単一細胞懸濁液が得られます。ここでは、免疫組織化学染色のための胎盤組織の調製方法を説明します。胎盤組織の免疫組織化学染色を用いることで、胎盤の微小環境内における造血幹細胞の局在を特定することができます。各胚から胎盤を分離した後、直ちに冷えた1×PBSに入れます。通常、胚齢8.5日から11.5日の若い胎盤には96ウェルプレートが最適ですが、胚齢12.5日以降の成熟した胎盤には24ウェルプレートの方が便利です。各胎盤を、新しく解凍した4% PARALDEHYDEまたはPFAを満たした新しいウェルに移します（E 12.5日の胎盤の場合）。組織は手作業で新しいウェルに移動させます。一方、E 10.5日の胎盤の場合は、ピペットでPBSを慎重に除去し、PFAを添加してください。組織の齢や大きさに応じて、胎盤を4°Cで2〜4時間完全に浸漬させることが重要です。その後、組織を30% sucroseに移します。組織が非常に小さく脆弱な場合は、PFAを吸引し、直接sucroseを加えてください。この段階で、胎盤は溶液中に浮遊した状態になります。組織を4°Cで一晩静置してください。30% sucroseでの一晩の処理後、組織がウェルの底に沈んでいれば、適切に凍結保存準備が整ったことを示します。次に、sucrose溶液の半分を取り除き、同量のOCTで置き換えます。組織を4 °Cで1〜2時間静置します。これにより、OCTの浸透が促進されます。最後に、組織を100% OCTに移して1時間置き、その後、包埋を行います。プラスチック製の型に、適切な組織識別ラベルを貼ります。OCT溶液から組織を取り出し、円盤状の胎盤の臍帯側を下に向けて配置し、清潔なカミソリで注意深く切断して胎盤を半分に分けます。この際、均一に切断するために、圧力を緩める前に刃を戻しながら切るようにしてください。胎盤の造血幹細胞を後に視覚的に確認しやすい最適な方向にするため、胎盤を半分に切断します。次に、胎盤の半分を型に入れ、切断面が型の底面に接するように配置します。もう一方の半分についても、新しい型を用いて同様に操作します。E 10.5の胎盤の場合、同じ手法を用いて両方の半分を同一のモールドに入れることができます。モールドにOCTを注ぐ際、胎盤を適切な方向にとどめておくことが難しい場合があります。E 10.5の胎盤では、組織の半分をピンセットで保持することで、胎盤を所定の位置に固定してください。組織の半分をピンセットで保持し、もう半分をピンセットの外側に添えます。次に、E 12.5の場合と同様の手順で、OCT溶液をゆっくりと注ぎます。型にOCTが満たされたら、速やかに型をドライアイスの上に置きます。OCTが白く変化し、組織が急速凍結されます。モールドを小さなプラスチック袋に入れ、直ちに-80°Cのフリーザーで保存してください。ここでは、E 10.5の胎盤の代表的な切片を示します。切片には、画像下部に示されている絨毛膜板と、中央に示されている胎児と母体間の物質交換を促進する胎盤領域である胎盤迷路が含まれていることが重要です。この切片はCD 31抗体で染色されており、内皮が赤色に標識されています。茶色に示されている栄養膜細胞はサイトケラチンによって標識されています。迷路層には、赤色に標識された胎児血管と、茶色の栄養膜細胞によって裏打ちされた母体血腔の両方が存在しています。青色の細胞はCD 41陽性の初期造血幹・前駆細胞であり、これらが胎児の血管系に局在していることに注目してください。ここまで、胎盤組織を解剖して単一細胞懸濁液を調製する方法、およびフローサイトメトリーを用いて胎盤造血幹細胞を同定する方法について説明しました。また、免疫組織化学染色によって造血幹細胞を可視化するための胎盤組織切片の作製方法についても示しました。これらの手順を行う際は、いくつかの重要なパラメータに注意することが重要です。胎盤の解剖を行う際は、単一細胞懸濁液の調製に向けて高い細胞生存率を維持するため、迅速に作業し、胚と溶液を可能な限り低温に保つことが重要です。酵素処理前の機械的解離の程度と、酵素処理中のインキュベーション時間が、生存率と細胞の健全性に影響を与える最も重要な要因となります。最後に、免疫組織化学染色を行う際、過剰固定は一部の抗原において問題となる可能性があり、一方で固定不足は組織の破壊につながる可能性があります。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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