プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

こんにちは、私はミッコラで、私の研究室へようこそ。私たちの研究室では、造血幹細胞の発生について研究することを主な目的としています。胚発生の過程で、胎盤を主要な造血器官として同定し、造血幹細胞が胎盤内で特異的な微小環境ニッチで生成・増殖していることを発見しました。

このように、胎盤は、造血幹細胞の出現および初期増殖の際の供給源として非常に価値があります。本日は、私の研究室のメンバーが、胎盤から造血幹細胞を単離し、そのユニークな微小環境ニッチでHCSを可視化するために必要な実験技術を紹介します。こんにちは、UCLAの分子細胞および発生生物学部のハンナ・モラ博士の研究室のクリス・ゲカです。

今日は、マウス胎盤を解剖する方法と、胎児造血幹細胞のファックス分析のために胎盤組織の単一細胞懸濁液を準備する方法を紹介します。そして、私はカトリーナ・ローズで、免疫組織化学のための胎盤組織の作り方をお見せします。それでは始めましょう。

まず、胚を妊娠中の母から分離する必要があります。動物は承認された手順に従って安楽死させます。私たちの場合、致死量の麻酔薬であるイソフッ素を使用します。

まず、腹にエタノールをスプレーし、ハサミで小さく切開します。両手で皮膚をはがして腹部を露出させ、鉗子で腹膜を切り開きます。子宮角を拾い上げ、各遠位端にハサミを使用してそれらを集めます。

PBSで満たされたシャーレに子宮の角を入れ、氷の上に置きます。また、2つの鉗子で胎盤を分離する前に、PBSで数回洗うことを忘れないでください。胚の概念を囲む子宮内膜組織を慎重に剥がし始めます。

これらの胚は、造血幹細胞またはHSCが胎盤でピークに達する発生年齢である12.5日目の胚からのものです。胚に穴を開けたり、構造的な損傷を与えたりしないように注意する必要があります。これは、その後の解剖手順を複雑にするからです。分離された概念をPBSを使用して氷上の新しいペトロ皿に置き、すべての概念が子宮内膜から解放されるまで続けます。

1つの概念を新しいシャーレに移し、PBSを顕微鏡下に置きます。そして、2つの鉗子で、デイドラをG胎盤から剥がします。デイドラ細胞が干渉するので、できるだけ多くのデイドラを取り除きます。

シングルセル懸濁液とフローサイトメトリーを使用。最良の結果を得るには、滑らかで連続的なピーリング動作が推奨されます。注目すべきは、これらの胚の10.5日目またはE 10.5日目の胚のような若い胚を扱う場合、デイドラは全体の概念を取り囲むことです。

E 10.5のE 12.5胚とは異なり、HSCは胎盤内で出現し始めたばかりです。E 10.5 と E 12.5 の胚の間にはかなりのサイズの違いがあることに注目してください。2つの臓器の間の接合部で卵黄嚢を胎盤から切り取り、卵黄嚢とベリン血管を胎盤からそっと引き離します。

特に初期胚では、胎盤のチョイックプレートを乱さないように注意する必要があります。胎盤のCHOプレートを臍帯の1対の鉗子で慎重に保持し、別の鉗子で保持します。臍帯と付着した胚を胎盤から離して証明します。

胎盤の端にある余分な巨細胞組織を取り除く 単一細胞懸濁液の調製中の細胞凝集を最小限に抑えるために、PBSと5%FCSを含む15MLのFalconチューブなどの適切な容器に胎盤を採取し、氷の上に置きます。これを解剖したすべての胎盤に対して行います。この時点で、in vitro培養や移植などのフローサイトメトリー機能アッセイ用のシングルセル懸濁液の調製を進めるか、組織固定用の全プラセンタを調製し、最終的な免疫組織化学のために固定凍結ブロックを包埋することができます。

ここからは、ファックス分析のために胎盤からシングルセル懸濁液を生成する方法をご紹介します。まず、PBS中の0.1%コラゲナーゼ溶液を10%FCSおよび1%ペニシリンストレプトマイシン溶液で調製します。プラセンタに適切な量のコラゲナーゼ溶液を添加し、その量に応じて、プラセンタの体積の2倍、2〜5ミリリットルが推奨されます。

5 mLのシリンジに装着した16ゲージの針を使用して、コラゲナーゼ溶液と胎盤を針を通して3回包装することにより、破壊組織を機械的に破壊します。8ゲージの針で繰り返します。45分間のインキュベーション後、サンプルを摂氏37度の5%CO2インキュベーターに45分間置きます。

コラゲナーゼ継代では、細胞溶液を20ゲージの針に通し、コラゲナーゼ継代で合計1時間半インキュベーションした後、37度でさらに45分間インキュベートし、細胞溶液を22ゲージと25ゲージの針に通して各針で3回インキュベートします。次に、新しい15 MLファルコンチューブウォッシュに取り付けられた50マイクロメートルフィルターでサンプルをろ過し、PBSと5%FCSを併用し、摂氏4度で300 gで5分間遠心分離します。この時点で、FAX分析に適したシングルセル懸濁液が得られます。

免疫組織化学のための胎盤組織の作り方をお見せします。胎盤組織の免疫組織化学は、胎盤微小環境内の造血幹細胞を局在化するために使用することができます。各胚から胎盤を分離した直後に、それらは冷たい1つのXPBSに置かれます、通常96ウェルプレートは若い胎盤の胚の日8.5から11.5に最適ですが、古い胎盤E 12.5以上では、24ウェルプレートがより便利かもしれません。

各胎盤は、解凍したばかりの4%パラアルデヒドまたはPFAで満たされた新しいウェルに移されます。組織を手で新しいウェルに移動します。しかし、E 10.5プラセンタの場合は、PBSをピペットで慎重に取り外し、PFAを追加することができます。

胎盤を4°Cで2〜4時間完全に浸すことが重要です。これは、組織の年齢とサイズによって異なります。次に、組織を30%スクロースに移します。または、組織が非常に小さく壊れやすい場合は、PFAを吸引し、スクロースを直接追加します。

この段階では、胎盤は溶液中に浮遊します。組織を4°Cで一晩滞在させます.30%スクロースで一晩のステップの後、組織は最終的に井戸の底に沈むべきであり、適切な凍結保存を示します。次に、ショ糖溶液の半分を取り除き、ボリュームをOCTと交換します。

ティッシュを4°Cに1〜2時間戻します。これにより、OCTの浸透が容易になります。最後に、組織を100%OCTに1時間移し、その後、組織を埋め込むことができます。

プラスチック金型に適切な組織識別をラベル付けします。OCT溶液から組織を引き出し、臍帯側を下に向けて円盤状の胎盤を向け、きれいなカミソリの刃で慎重にスライスし、刃を後ろに動かすようにして、胎盤を半分に切ります。そして第四に、圧力を解放する前に、均一なカットを確保します。

胎盤は半分に切断され、胎盤造血幹細胞の後で視覚化するための最適な配向を実現します。次に、1つの胎盤の半分を型の底に置き、カットエッジを型の下部に接触させ、型の底面に接触させます。残りの半分について、新しい型で繰り返します。

E 10.5胎盤の場合、両方の半分を同じ手法を使用して同じ型に入れることができます。OCTを型に流し込むと、胎盤を適切な向きに保つのが難しくなることがあります。E 10.5胎盤用の鉗子で組織の半分を保持して、胎盤を所定の位置に固定します。

一方の組織を鉗子で保持し、もう一方の組織の半分を鉗子の外側に置きます。次に、E 12.5で説明したようにOCT溶液をゆっくりと注ぎます。型にOCTが充填されたら、型をすばやくドライアイスの上に置きます。

OCTは、ティッシュを瞬間凍結して白色に変わり、型を小さなビニール袋に入れて、すぐにマイナスDC冷凍庫に保管します。これは、E 10.5胎盤の代表的な切片です。画像の下部に示されている絨毛膜プレートと、中央に示されている胎児の母体交換を容易にする胎盤の領域である胎盤迷路をセクションに含めることが重要です。

この切片は、内皮を赤色にマークしたCD 31抗体で染色しました。茶色で示されている栄養膜は、サイトケラチンによって特徴付けられます。迷路には、赤でマークされた胎児の血管系血管と、茶色の栄養膜が並ぶ母体の血液空間の両方があります。

青色細胞はCD41陽性の新生造血幹であり、前駆細胞はそれらが胎児の血管系に局在していることに気づきます。ここでは、大量の胎盤の単一細胞懸濁液を解剖して調製する方法と、フローサイトメトリーによって胎盤造血幹細胞を同定する方法を紹介しました。また、免疫組織化学による造血幹細胞の可視化のために、胎盤組織の切片を調製する方法も紹介しました。

これらの手順を実行するときは、いくつかの重要なパラメーターに注意を払うことが重要です。胎盤解剖を行う際には、単一細胞懸濁液の調製のために高い細胞生存率を維持するために、迅速に作業し、胚と溶液をできるだけ良好に保つことが重要です。酵素処理前の機械的解離の程度と酵素処理中のインキュベーション時間は、生存率と細胞治癒に影響を与える最も重要な要因です。

そして最後に、免疫組織化学を行う場合、固定化が過剰になると一部の抗原に問題が生じる可能性があり、一方で、固定不足は組織の破壊につながる可能性があります。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。