薬用植物におけるトロパンアルカロイドの定量のための効率的かつ迅速なHPLC-QQQ-MS法
June 12th, 2026
本研究では、高性能液体クロマトグラフィーと三重四重極質量分析法(HPLC-QQ-MS)法を組み合わせたものを開発し、 Anisodus tanguticus中のトロパンアルカロイド(ヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミン)を同定・定量しました。この方法は薬用植物の高スループット分析において迅速かつ正確かつ信頼性が高いことが証明されました。
私たちはAnisodus tanguticusにおける3つの主要なトロパンアルカロイドを迅速に定量するためにHPLC-QQQ-MS法を開発しました。従来のHPLCはトロパンアルカロイドに対する感度を欠いています。この方法は高感度質量分析法を用いてこの問題を解決します。
まず、ヒヨスチアミン、アニソダミン臭化ドロマイド、スコポラミン臭化水素化合物の基準基準を正確に10.0ミリグラム計量します。それらを別の10ミリリットルのボリュームフラスコに入れます。各体積フラスコのマークラインにクロマトグラフィーグレードのメタノールを加えます。
標準物質を超音波処理で十分に溶解し、1.0ミリグラム/ミリリットル濃度の単一標準ストック溶液を準備します。その後、ストック溶液を茶色い試薬瓶に移し、暗闇で4度の温度で保存します。10マイクログラム/ミリリットルの混合標準中間液を調製するには、事前に準備された各ストック溶液を100マイクロリットルのピペットで10ミリリットルの体積フラスコに移します。
次に、マークラインにクロマトグラフィーグレードのメタノールを加えて溶液を希釈します。次に、新鮮なSophora flavescens素材を凍結乾燥させます。その後、高速グラインダーを使い、乾燥した材料を均質な粉末に粉砕します。
粉末を0.25ミリの標準テスト用ふるいにかけます。ふるいにかけた粉20ミリグラムを正確に計る。100ミリリットルの体積フラスコに移し、マークラインのすぐ下にクロマトグラフィーグレードのメタノールを加えます。
次に、室温で30分間超音波抽出を行います。その後、ボリュームフラスコを取り出し、室温で25度まで冷ます。100ミリリットルのマークラインにクロマトグラフィーグレードのメタノールを加え、渦を巻き込んで2分間混ざります。
次に、準備済み抽出物1ミリリットルを100ミリリットルの体積フラスコにピペットで移します。マーキングラインにメタノールを加えてください。よく振って十分に混ぜ、HPLC注入用の母液を得ます。
試料ろ過には、1ミリリットル使い捨ての針なしシリンジと0.22マイクロメートルの有機相微多孔膜を準備します。母液を1.2ミリリットル吸引して注射器に注入し、ゆっくりと膜を通して溶液をろ過します。ろ過液を内側にインサートのある2ミリリットルのサンプルバイアルに集め、キャップでしっかりと密封します。
超純水1000ミリリットルを測定して移動相Aを準備します。クロマトグラフィーグレードの甲酸を1.0ミリリットル加え、磁気攪拌器で10分間均一に混ざります。次に、追加処理なしにクロマトグラフィーグレードのメタノールを直接使用して移動相Bを準備します。
40キロヘルツでそれぞれ別の超音波脱ガスユニットを用いて15分間移動相AおよびBを脱ガスします。脱気された移動相を別々の溶媒ボトルにまとめ、HPLCシステムの対応するAラインとBラインに接続します。クロマトグラフィー分離にはC18カラムを使用します。
カラムをメタノールと水で80対20の比率で30分間、流量0.3ミリリットル毎分で平衡させます。コラムオーブンの温度を30度に設定し、10分前に予熱してください。次に、流量を毎分0.60ミリリットル、注入体積を2マイクロリットル、検出波長を210ナノメートルに設定します。
その後、提示条件で勾配洗脱プログラムを設定します。正イオン化モードで動作する電気噴霧イオン化源を備えた三重四重極質量分析計を用いて質量分析検出を行います。ネブライザー圧力を15ポンド毎平方インチ、キャピラリー電圧を4,000ボルト、ガス温度を300度、ガス流量を毎分11リットルに設定します。
次に、複数の反応監視イオンペアのパラメータを設定します。前駆体イオンを特定するには、MS2スキャンモードで個々の標準溶液を直接注入します。方法検証後、多重反応モニタリングモードでデータ取得を行います。
ここに示す各分析対象に対して、前駆体イオン、生成イオン遷移、フラグメンタ電圧、衝突エネルギーなどの最適化パラメータを使用します。定性的分析ソフトウェアを起動します。ファイルを選択し、データをインポートして収集したすべてのデータファイルをインポートします。
各抽出イオンクロマトグラムのターゲットピークの対称性と保持時間の一貫性を確認してください。定量モジュールでMRM遷移を選択します。各成分の前駆体イオン対と生成イオンペアを入力し、対応する抽出されたイオンクロマトグラムを抽出します。
定量分析のためにピーク面積を計算します。最適化されたHPLC条件下で、3つのターゲットトロパンアルカロイドは20分以内に成功して分離されました。スコポラミンとアニソダミンの分離度は8.67でした。
アニソダミンとヒヨスシアミンの分離率は11.58に達しましたが、すべての分解能値は基準分離基準1.5を有意に超えていました。すべての分析対象は濃度範囲で0.014〜0.320マイクログラム/ミリリットルで良好な線形性を示し、相関係数は0.99を超えました。平均回復率はスコポラミンが101.44%、アニソダミンが100.25%、ヒヨスチアミンが99.56%で、相対標準偏差はそれぞれ1.85%、2.35%、1.9%でした。
10個のAnisodus tanguticusサンプルから3つのトロパンアルカロイドを定量したところ、スコポラミン含有量はサンプル6で0.3667ミリグラム/グラム、サンプル7では1.0356ミリグラム/グラムの範囲でした。アニソダミンの含有量は、サンプル6で0.0269ミリグラム/グラム、サンプル10で0.3590ミリグラム/グラムの範囲でした。ヒヨスチアミン含有量は、サンプル2で0.2930ミリグラム/グラム、サンプル10で1.4989ミリグラム/グラムで、サンプル4、7、9、10でより高いレベルが観察されました。
このプロトコルにより、3つの主要なトロパンアルカロイドの迅速かつ正確な定量が可能です。主な課題は、正確な測定のために機器手順と標準化されたサンプル準備を確保することです。この方法は、Anisodus tanguticus中の他の代謝物の探査や定量にも拡張可能です。
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Overview
This study presents a robust analytical protocol for the rapid and accurate quantification of three major tropane alkaloids—hyoscyamine, anisodamine, and scopolamine—in Anisodus tanguticus, a key Tibetan medicinal plant. By employing high-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (HPLC-QQQ-MS), the method overcomes the sensitivity limitations of conventional HPLC and enables precise identification and quantification of these pharmacologically important compounds.
Key Study Components
Area of Science
- Analytical chemistry
- Phytochemistry
- Medicinal plant research
Background
- Anisodus tanguticus is valued for its tropane alkaloids, which have significant analgesic and sedative effects.
- The plant's chemical composition is complex, with many constituents lacking structural elucidation.
- Traditional HPLC methods struggle with sensitivity and specificity for tropane alkaloids.
- Accurate identification and quantification of these compounds are essential for medicinal use and quality control.
Purpose of Study
- To develop a sensitive and reliable HPLC-QQQ-MS method for quantifying hyoscyamine, anisodamine, and scopolamine in A. tanguticus.
- To validate the method's precision, accuracy, and applicability for high-throughput analysis.
- To provide a standardized workflow for sample preparation and instrumental analysis.
Methods Used
- Preparation of reference standards and plant extracts using methanol and ultrasonic treatment.
- Sample filtration with 0.22 μm membranes and chromatographic separation on a C18 column.
- Gradient elution with methanol and formic acid-modified water as mobile phases.
- Detection and quantification using triple quadrupole mass spectrometry in positive electrospray ionization mode and multiple reaction monitoring (MRM).
- Data analysis for peak identification, retention time consistency, and quantitative calculation of alkaloid content.
Main Results
- All three target alkaloids were baseline-separated within 20 minutes under optimized HPLC conditions.
- Resolution values between analytes significantly exceeded the baseline criterion (e.g., 8.67 and 11.58).
- Excellent linearity was observed for all analytes (correlation coefficients >0.99) across the tested concentration range.
- Mean recoveries were 99.56%–101.44% with low relative standard deviations (1.85%–2.35%).
- Quantitative analysis of 10 plant samples revealed variable alkaloid content, with hyoscyamine and scopolamine showing the highest concentrations in specific samples.
Conclusions
- The HPLC-QQQ-MS method is rapid, sensitive, and accurate for quantifying tropane alkaloids in A. tanguticus.
- The protocol ensures high reproducibility and is suitable for high-throughput applications.
- This approach can be extended to the analysis of other metabolites in A. tanguticus and similar medicinal plants.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
Preparation of Standard and Mixed Working Solutions
1:28
Sample Pretreatment
2:45
Sample Filtration and Storage
3:20
Preparation of Mobile Phases for HPLC
4:07
Setting of HPLC Conditions
4:53
MS Acquisition
5:58
Data Analysis
6:38
Results
8:41
Conclusion
