Name: 使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル 125 I標識アジド補綴グループ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ放射性ヨウ素標識金ナノ粒子の合成法。無銅クリック反応を用いて高収率・高純度で標識化し、PETやSPECTイメージング用プローブの開発に応用可能な放射化学技術を習得する。

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この研究は、大韓民国政府による資金提供を受けた韓国国立研究財団からの助成金(助成金番号2012M2B2B1055245および2012M2A2A6011335)と韓国原子力研究所のRI-Biomicsセンターによって支援されました。

注意：放射性ヨウ素の酸化形態は非常に揮発性であり、十分なリードシールドとリードバイアルで処理する必要があります。すべての放射化学的手順は風通し木炭濾過フード内で行われるべきであり、実験手順は、放射能検出装置によって監視される必要があります。 125 I標識アジドの合成のための化学物質と逆相カートリッジの調製<ol><li> 溶液中の試薬の調製 <ol><li> 150μlの無水エタノール中アジド前駆体（2）（ 図1）1mgを溶解させます。 注：アジド前駆体の詳細な合成手順は、（2）前報22で報告されました。 </li><li> 1×リン酸緩衝生理食塩水（pHは= 7.4）20μlに1mgのクロラミンTを溶解させます。 </li><li> 20μlのH 2 Oで2 mgのメタ重亜硫酸ナトリウムを溶解させます</li></ol></li><li> Preparaカートリッジの化<ol><li> 10ミリリットルのH 2 O、続いて10ミリリットル無水エタノールでTC18カートリッジを洗います空気とカートリッジのマトリックスを乾燥させないでください。 </li></ol></li></ol> 125 I標識アジド補欠分子族の2放射合成<ol><li> 前駆体の放射性ヨウ素化反応 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにアジド前駆体溶液（無水エタノールを150μl中1mg）および酢酸（10μl）を追加します。 </li><li>反応混合物に0.1 MのNaOH（50μL）の[125 I]のNaI 150 MBqのを追加します。 </li><li>クロラミンT溶液（1×リン酸緩衝生理食塩水の20μlの中で1 mg）を加え、反応混合物を含むマイクロチューブを閉じます。 </li><li>放射性ヨウ素化反応が完了するまで、15分間室温で反応混合物をインキュベートします。 </li><li>反応混合物にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（20μlのH 2 O中の2 mg）を加えます放射性ヨウ素化反応を停止します。 </li><li>粗生成物の0.2μLを撤回した後、溶液100μl（H 2 O / CH 3 CN、1：1）を用いて希釈し、HPLC分析のために。 注：すべてのHPLC実験のために、H 2 O（A溶媒）及び溶離剤としてアセトニトリル（溶媒B）を含有する0.1％ギ酸を含む0.1％ギ酸を使用します。 </li><li>逆相分析用無線-HPLCを（逆相C18カラムを用いて希釈し、粗生成物を分析;流速：1ml /分;溶離剤勾配：0-2分20％溶媒Bのため20〜80％溶媒B 2-22分、22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B;保持時間：16.4分）（ 図2）。 </li></ol></li><li> 分取HPLCで粗生成物の精製 注：このような注入器、カラム、検出器、コレクションバイアル、および流出物は収集された容器としてHPLC部品の周囲に十分な鉛遮蔽を提供します。 <ol><li>目を撤回HPLCバイアル中に反応混合物全体を電子。アセトニトリル（0.5ml）で反応管を洗浄し、同じ注射バイアルにリンスを追加します。 H 2 O（1mL）で回収した溶液を希釈します。 </li><li>取ラジオ-HPLC（逆相C18カラムを上に、粗生成物を注入し、流速：10ml /分;溶離液勾配：0-2分20％溶媒B、2-22分間の百分の20から80溶媒B、 22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B）。 </li><li>ガラス試験管において125 I標識アジド（1）（これらのHPLC条件下でのt Rは 17.8から18.8分である）（ 図2）を表す放射性ピークを集めます。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを使用して、画分の放射化学的収率を測定します。 </li><li>生成物の放射化学的純度を決定するための同一のHPLC条件を使用して分析ラジオHPLCに精製された生成物を注入します。 </li></ol></li><li> 製品の固相抽出 <ol><li> 40ミリリットルで、所望の生成物（1）を含む画分を希釈し、純粋なH 2 O </li><li>予め調整TC18カートリッジに希釈した溶液を加えます。 </li><li>追加の15ミリリットルのH 2 Oでカートリッジを洗浄</li><li>生成物を溶出（1）鉛シールドによって保護されている10-mlのガラスバイアルに2ミリリットルのアセトンでカートリッジ内に閉じ込められました。製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを用いて溶出し、製品の放射能を測定します。 注：ジメチルスルホキシド（DMSO）または無水エタノールは、また、カートリッジからの生成物の溶出のために使用することができます。放射能の約5〜10％、通常カートリッジに付着し、残りの放射性標識生成物が完全に有機溶媒の過剰量を用いて溶出することができません。 </li><li>窒素またはアルゴンガスの流れでアセトンを蒸発させます。 </li><li>再溶解させます次の放射性標識工程のためのDMSO（100〜200μl）を持つs​​idue。 </li></ol></li></ol> DBCO-基結合金ナノ粒子の3合成<ol><li> DBCO基含有ポリエチレングリコールと13-nmサイズの金ナノ粒子の表面修飾 <ol><li>既報24に従って、クエン酸ナトリウム安定化金ナノ粒子（3）（平均サイズ= 13 nm）を準備します。 </li><li> （10 nMの15 ml）をクエン酸で安定化した金ナノ粒子にTween 20を（1mMの1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で20分間この溶液を振ります。 </li><li> DBCO基含有ポリエチレングリコールチオール（平均分子量= 5,000、100μM1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で2時間のためのソリューションを振ります。 </li></ol></li><li> DBCO基変性金ナノ粒子の精製 <ol><li>精製DBCO基修飾金ナノ粒子（4）&lt;/連続的な遠心分離（11,400×gで、15分×3）によって&gt;強いです。 </li><li>上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。 </li></ol></li></ol> 4.銅系クリック反応を介したDBCO基修飾金ナノ粒子の放射性標識<ol><li> 125 I標識アジドを使用して、125 I標識した金ナノ粒子の合成（1） <ol><li>遠心分離（11,400×gで、15分）を使用してDBCO基修飾金ナノ粒子の濃縮液を用意し、2μMに金ナノ粒子の濃度を調整します。 </li><li> （2μM、50μL）（4）金ナノ粒子の懸濁液にDMSO（5μL）に（1）125 I標識アジドの4.1 MBqのを追加します。 </li><li> 60分間40℃で得られた反応混合物をインキュベートします。 </li><li>粗生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ共にそれを適用します薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートated。 </li><li>移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って（ 図3）放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、放射性標識反応を監視するためのスキャナを実行します。 </li></ol></li><li> 粗生成物の精製 <ol><li>遠心分離（11,400×gで15分間）によって125 I標識された金ナノ粒子（4）を含む反応混合物を精製します。 </li><li>上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。 </li><li>精製された生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ被覆TLCプレート上にそれを適用します。 </li><li>移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。 </li><li>放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、125 I標識ゴルの放射化学的収率および放射化学的純度を決定するためのスキャナを実行製造業者のプロトコルに従ってDナノ粒子（4）（ 図3）。 </li></ol></li></ol>

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<li>Jeon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Method+for+Iodine+Radioisotope+Labeling+of+Cyclooctyne-Containing+Molecules+using+Strain-Promoted+Copper-Free+Click+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction.</a> Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).</li>
<li>Choi, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Evaluation+of+an+125I-Labeled+Azide+Prosthetic+Group+for+Efficient+and+Bioorthogonal+Radiolabeling+of+Cyclooctyne-Group+Containing+Molecules+using+Copper-Free+Click+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Targeting+and+Imaging+Using+Cyclic+RGD-PEGylated+Gold+Nanoparticle+Probes+with+Directly+Conjugated+Iodine-125%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125.</a> Small. 7, 2052-2060 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

一般的に、精製された125 I標識アジド（1）の観察された放射化学収率は75±10％であった（n = 8）。放射性標識は、放射能の50から150 MBqので達成された、および放射化学的結果は非常に一貫しています。 [125 I] NaIを（T 1/2 = 59.4 d）の放射性ヨウ素化反応に使用した1ヶ月以上放射性崩壊を受け、1の放射化学的収率があることが観察された場合は、わずかに（53から65パーセント）減少しました。従って、[125 I] NaIを、それが生成されるとすぐに利用すること、または最適化された放射化学的収率を得るために実験室に送達されることが推奨されます。また、新たに調製したクロラミンT溶液は、所望の放射化学的収率を得るために、反応に使用されるべきです。 前駆体（2）は 、非常に疎水性であったため、150μlの無水エタノールは、1mgを溶解させるために追加する必...

アジドとシクロオクチンの間のひずみ促進銅フリークリック反応は、広範囲の生体分子、ナノ材料、および生体被験者1-7の効率的な生体直交標識に広く適用されています。この標識反応の優れた部位特異性と迅速な反応速度により、放射性標識トレーサーの合成にも使用されています。ペプチドおよび抗体を標的とするさまざまながんのin vitro標識、ならびに腫瘍8-13のin vivoプレターゲティングイメージングのために、いくつかの18のF標識アジドまたはDBCO補綴群が調製されています。これらの例に加えて、陽電子放出断層撮影(PET)イメージング研究14-16のためのナノ材料の金属-放射性同位元素標識にも同じ共役反応が適用された。
数十年にわたり、放射性ヨウ素は、PETイメージング(124I)、単一光子放出型コンピュータ断層撮影(SPECT)イメージング(123I、125I)、および甲状腺癌治療(131I)17-21を通じて、生物医学研究および臨床試験に使用されてきました。したがって、放射性ヨウ素の効率的な標識法は、分子イメージング研究、生体分子の臓器分布の解析、バイオマーカーの同定、医薬品開発など、さまざまな研究において基本的に重要です。銅フリーのクリック反応戦略は、放射性ヨウ素の標識に使用できます。しかし、この応用は、18のF標識生体分子22-23ほど広範囲に研究されていません。ここでは、DBCO基由来分子の放射性標識のための125I標識アジドの合成のための段階的なプロトコールを提供します。本報告の手順には、スタンニル化前駆体の放射性ヨウ素化、HPLCによる精製ステップ、および固相抽出が含まれます。また、125I標識アジドを用いて、DBCO基修飾13 nmサイズの金ナノ粒子の効率的な放射性標識を実証しています。このレポートの詳細なプロトコルは、合成化学者が放射性標識製品の合成のための新しい放射性標識法を理解するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>クロラミンT三水和物</td><td>Sigma</td><td>402869</td><td></td></tr><tr><td>[125I]NaI in aq.</td><td>NaOH Perkin-Elmer</td><td>NEZ033A010MC</td><td></td></tr><tr><td>Sodium metabisulfite&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9000</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma</td><td>251364</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 plus カートリッジ</td><td>Waters</td><td>WAT036800</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>金(III) 塩化</td>物 <td>Sigma</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DBCO PEG SH (MW 5,000)</td><td>NANOCS</td><td>PG2-DBTH-5k</td><td></td></tr><tr><td>TLC シリカゲル 60 F254</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical HPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity</td><td>型番</td></tr><tr><td>分取HPLC</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity</td><td>型番</td></tr><tr><td>Analytical C18 逆相カラム</td><td>Agilent</td><td>Zorbax Eclipse XDB-C18</td><td></td></tr><tr><td>分取 C18 逆相カラム</td><td>Agilent</td><td>PrepHT XDB-C18</td><td></td></tr><tr><td>ラジオTLCスキャナー</td><td>バイオスキャン</td><td>AR-2000</td><td>型式番号</td></tr><tr><td>放射性同位元素線量校正器</td><td>Capintec, Inc</td><td>CRC -25R 線量校正器</td><td>型式番号</td></tr></tbody></table>

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; i標識アジド補綴グループ

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

ここでは、125I標識アジド補綴基の放射合成と、銅フリークリック反応を用いたDBCO基官能基化金ナノ粒子の効率的な放射性標識への応用のための詳細なプロトコルを示します。スタンニル化前駆体(2)の放射性ヨウ素化は、[125I]NaIとクロラミンTを酸化剤として室温で15分間使用して行った。粗生成物のHPLC精製後、精製された125I標識アジド(1)は、高い放射化学的収率(75 ± 10%、n = 8)および優れた放射化学的純度(>99%)で得られた。放射性標識された13nmサイズの金ナノ粒子の合成のために、チオール化ポリエチレングリコールポリマーを使用してDBCO官能化金ナノ粒子(3)を調製しました。1と3の間の銅フリークリック反応により、125個のI標識金ナノ粒子(4)が得られ、放射性薄層クロマトグラフィー(radio-TLC)によって測定される放射性化学的収率が95%を超えました。これらの結果は、ひずみ促進銅フリークリック反応を用いた本放射性標識法が、DBCO基含有ナノ材料の効率的かつ簡便な放射性標識に有用であることを明確に示しています。

スタンニル化前駆体（2）の放射性ヨウ素化反応は、放射性標識生成物を提供するために15分間室温で[125 I] NaIを、酢酸、及びクロラミンTの150 MBqのを使用して実施した（1）。粗混合物を分取HPLC精製後、所望の生成物は、放射化学的収率の75±10％（N = 8）を得ました。分析用HPLCは、125 I標識産物の放射化学的純度は99％以上（ 図2）であり、生成物1の観察比放射能は40.7 MBqで/モルであることを明らかにしました。カートリッジを使用して精製された生成物を含む画分の固相抽出1のアセトン溶液を得ました。窒素またはアルゴンガス流を用いて、有機溶媒を蒸発させることができ、その後、残留物を次のSTEためにDMSO又は無水エタノールに再溶解することができますP。 <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

125 I標識アジドの合成と銅のないクリック反応を用いて、dibenzocyclooctyne（DBCO） -基コンジュゲート、13-nmサイズの金ナノ粒子の放射性標識のための詳細な手順が記載されています。

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

このプロトコルの全体的な目的は、歪み促進型銅フリークリック反応を用いて、放射性ヨウ素標識金ナノ粒子を効率的かつ迅速に合成する方法を提供することです。この手法は、放射性同位体標識体の合成や、PETまたはSPECTイメージング研究用の通常イメージングプローブなど、放射化学分野における重要な課題の解決に寄ってされます。この技術の主な利点は、アジドプロステティック基を用いることで、優れた放射化学的収率および放射化学的純度で、ヨウ素標識金粒子を効率的に合成できることです。放射能評価の手順を習得することは困難であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。このような手順には適切な設備と放射性標識の取り扱い経験が必要となります。本研究に合わせ、放射能研究担当のHa Eun Shimが手順の実演を行います。放射性ヨウ素化反応を行うために、前駆体溶液を1.5 mLチューブに加えます。室温で、前駆体溶液に10 µLの酢酸を加えます。次に、50 µLの0.1 M 水酸化ナトリウム溶液に溶解した150 MBqの iodine 125を反応混合物に加えます。クロラミンT溶液を加え、反応混合物が入ったマイクロ遠心チューブを密閉する。放射性ヨウ素標識反応が完了するまで、反応混合物を室温で15分間インキュベートする。その後、ピロ亜硫酸ナトリウム溶液を反応混合物に加え、放射性ヨウ素標識反応を停止させる。粗生成物を0.2 µL分量分取り出し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析用に、水で希釈した50%アセトニトリル100 µLで希釈します。希釈した粗生成物を、逆相分析用ラジオHPLCを用いて分析します。反応混合物全体をHPLCバイアルに移します。反応チューブを0.5 mLのアセトニトリルで洗浄し、その洗浄液を同じインジェクションバイアルに加えます。回収した溶液を1 mLの水で希釈します。分取HPLCを用いて粗生成物を精製するには、粗生成物を分取ラジオHPLCに注入してください。ヨウ素125標識アジドを示す放射能ピークをガラス試験管に回収します。製造元のプロトコルに従い、放射能ドーズキャリブレータを用いて分画の放射化学的収率を測定します。その後、精製した生成物を分析用放射能HPLCに注入し、同様のHPLC条件下で生成物の放射化学的純度を決定します。目的産物の固相抽出を行うため、目的産物を含む画分を40 mLの純水で希釈します。希釈した溶液を、プレコンディション済みのTC18カートリッジに加えます。さらに15 mLの水でカートリッジを洗浄します。カートリッジに捕捉された産物を2 mLのアセトンで溶出し、鉛遮蔽で保護された10 mLガラスバイアルに回収します。製造者のプロトコルに従い、放射能ドーズキャリブレーターを用いて溶出産物の放射能を測定します。アセトンを蒸発させた後、残渣を100から200 µLのDMSOで溶解し、次の放射標識ステップに使用します。テキストプロトコルに従って、DBCO基修飾金ナノ粒子の合成を行います。遠心分離を用いて、DBCO基修飾金ナノ粒子の濃縮溶液を調製します。そして、金ナノ粒子の濃度を2 µMに調整します。5 µLのDMSOに溶解した4.1 MBqのヨウ素125標識アジドを、2 µMの金ナノ粒子の50 µL懸濁液に加えます。得られた反応混合物を40 °Cで60分間インキュベートします。粗生成物から0.2 µLの分注量を採取し、シリカコート薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートにスポットします。移動相に酢酸エチルを用いてTLCプレートを展開します。TLCプレートをラジオTLCスキャナーに設置し、製造者のプロトコルに従ってスキャナーを走査し、放射性標識反応をモニタリングします。遠心分離により、ヨウ素125で標識された金ナノ粒子を含む反応混合物を精製します。上清をデカントし、金ナノ粒子ペレットを再懸濁するために純水を加えます。精製物から0.2 µLのアリコートを分注し、シリカコーティングしたTLCプレートにスポットします。移動相に酢酸エチルを用いてTLCプレートを展開します。TLCプレートをラジオTLCスキャナーにセットし、製造元のプロトコルに従ってスキャナーを動作させ、125I標識金ナノ粒子の放射化学的収率および放射化学的純度を決定します。ここでは、125I標識アジドプロステティック基の代表的な結果を示します。放射能線量校正装置を用いて、75%の放射化学的収率が決定されました。分析用ラジオHPLCの結果は、生成物の放射化学的純度が非常に優れていることを示しています。ここでは、ヨウ素125で標識した金ナノ粒子の代表的な結果を示します。ラジオTLC分析により、精製された金ナノ粒子の放射化学的収率および純度はともに95%以上であることが示されました。この手法を習得し、適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。本手法における標識化学は非常に効率的で簡便であるため、この技術の応用範囲は、核医学診断および治療を目的としたさまざまな分子プローブの調製にまで及びます。放射性ヨウ素を取り扱う作業は極めて危険であるため、本手順の実施に際しては、遮蔽用レンガや軽量靴の使用など、常に適切な予防策を講じてください。

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使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル

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