세포 계수는 세포 수 와 생존가능성을 결정하기 위한 많은 세포 기반 시도에서 중요한 단계입니다. 일반적으로, 계산의 목표는 알 수 없는 세포 농도의 견본이 추가 사용을 위해 희석되어야 하는 얼마나 이해한다는 것입니다. 세포를 계산하기위한 가장 일반적인 실험실 도구는 백혈계입니다.
대막계는 원래 혈액 세포를 계산하기 위해 만들어진 계수 도구입니다. 대마계의 중심에는 레이저 에칭 그리드를 찾을 수있는 두 개의 계산 챔버가 있습니다.
그리드는 9개의 주요 사분면으로 구성됩니다. 4개의 코너 사분면은 16개의 작은 사분면으로 더 나뉩니다. 중앙 사분면은 이 작은 사분면 의 25개로 나뉘며, 각각은 16개의 마이크로 사분면으로 더 나뉩니다.
각 챔버의 맨 끝에는 계산되는 셀 샘플이 분배되는 샘플 소개 포트가 있습니다.
카운팅 챔버의 양쪽에는 커버 슬립 장착 지지대가 있으며, 쿼츠 커버슬립은 일반적으로 카운팅 챔버 보다 약 0.1mm 높다.
각 대형 사각형의 면적은 1mm2이므로 각 대형 사각형에 포함된 부피는 0.1mm3 또는 ml의 1/10,000번째입니다.
계산하기 전에 잠시 에탄올과 김쩍이 있으면 덮개 슬립과 카운팅 챔버에서 보풀, 지문 또는 워터마크를 청소하고 건조시하십시오.
그런 다음 각 커버슬립 장착 지지대에 소량의 물을 조심스럽게 추가하면 물의 표면 장력은 커버슬립을 제자리에 고정합니다.
이제 셀 서스펜션을 부드럽게 삼각하거나 파이펫을 위아래로 세리세워 세포 덩어리를 빼냅니다. 마이크로파이프를 사용하여 서스펜션의 약 10 μl을 흡인한 다음 시료와 함께 도입 포트 중 하나를 로드합니다. 용액은 모세관 동작에 의해 카운팅 챔버에 그려지고 전체 그리드를 커버해야합니다.
세포가 침전되는 동안 목표를 선택합니다. 그런 다음 바닥에 대치계를 적재합니다.
다음 현미경의 밑에 세포를 봅니다. 각 큰 사분면에 5개 미만의 세포가 있는 경우 샘플을 다시 회전하고 더 작은 부피로 펠릿을 다시 중단해야 할 수 있습니다. 세포가 서로 겹치거나 서로 쉽게 구별하기에 너무 조밀한 경우 더 많은 양의 용액으로 샘플을 희석해야 할 수 있습니다. 세포를 희석하는 요인을 추적하십시오. 나중에 계산에 필요합니다.
이제 셀을 계산할 시간입니다!
앞서 이야기했듯이, 카운팅 챔버는 레이저 에칭 그리드로 덮여 있습니다. 사분면의 선은 계산중인 셀을 더 쉽게 추적할 수 있도록 합니다. 샘플의 셀 밀도에 따라 계산할 크기 사분면을 선택합니다. 예를 들어 셀 수가 적은 경우 코너 사분면 중 하나에 있는 모든 셀을 계산합니다. 중간 양의 셀이 있는 샘플의 경우 16개의 더 작은 사분면 중 하나를 선택합니다. 세포의 매우 높은 밀도가있는 경우, 중 하나에 세포를 계산 25 중앙 사분면. 어떤 사분면이나 셀 샘플의 밀도에 관계없이 퀀런트당 적어도 20-50개의 셀을 계산합니다.
모든 세포가 사분면 내에 깔끔하게 떨어지는 것은 아닙니다. 위쪽과 왼쪽 선을 터치하는 셀을 계산할 수 있지만 아래쪽 또는 오른쪽 선을 터치하는 셀을 무시할 수 있습니다. 가장 정확한 수를 얻으려면 셀 카운터를 사용하여 세포를 추적하고 동일한 크기의 4 사분면에서 셀 수의 평균을 취하십시오.
1ml 부피의 세포 수를 계산하기 위해, 앞서 언급했듯이 그리드의 각 큰 사각형은 ml의 1/10,000이기 때문에 10,000으로 계산된 셀 수를 곱합니다. 이러한 더 큰 사분면 중 하나를 계산한 경우 이 숫자 1을 곱하기만 하면 됩니다. 코너 사분면 중 하나에 작은 사각형 중 하나를 계산한 경우 이 숫자를 16으로 곱합니다. 25개의 중앙 사분면 중 하나에 있는 모든 셀을 계산한 경우 이 숫자를 25로 곱합니다. 패시요트미터를 로드하기 전에 세포 현탁액을 희석하는 일이 발생하면 희석 계수를 곱해야 합니다.
이어서, 이 샘플의 1 ml에서 세포의 수를 계산하기 위해, 우리는 샘플의 1 ml에 5 x 106 세포의 총을 얻기 위해 104 및 25에 의해이 중앙 사분면에 있는 20 세포를 곱할 것입니다.
이제 샘플의 1ml에 있는 세포의 총 수를 알고 있기 때문에, 우리는 우리의 해결책의 총 부피로 이 수를 곱할 필요가 있습니다. 예를 들어, 1 ml에 5 x 106 세포가 있는 경우 2 ml에 총 1 x 107 셀이 있습니다.
그런 다음 셀의 잘못 계산, 고르지 않은 분포 또는 파이프팅 오류에서 오류를 방지하기 위해 챔버의 다른 쪽을 로드하고 셀 샘플을 두 번째로 계산합니다.
현미경의 밑에 세포를 세는 것은 또한 견본에 있는 세포의 생존을 평가하기 위하여 좋은 시간입니다. 중요한 얼룩인 Trypan blue는 종종 이 목적을 위해 막종계에 로드되기 전에 샘플과 혼합됩니다.
살아있는 세포는 그들의 막을 통해 허용하는 무슨에 관하여 아주 선택적이기 때문에 살아있는 세포는 이 염료를 제외합니다. 그러나 죽은 세포에는 그대로 막이 없기 때문에 트라이판 블루가 통과하여 세포질을 얼룩지게 합니다.
셀 샘플의 생존 가능성을 확인하려면 셀 서스펜션의 알리쿼트를 트라이팬 블루로 희석한 다음 일반 셀 샘플처럼 trypan 파란색 염색 샘플을 로드합니다. 상 대조에 따라, 살아있는 세포는 밝고 황금으로 나타나고 계산되어야 합니다; 둔하고 죽은 파란색 셀은 계산하지 마십시오.
이전과 같은 셀 수를 계산하면 이번에는 trypan 블루 희석 계수로 최종 숫자를 곱합니다. 따라서 원래 대표 샘플이 trypan blue에서 먼저 희석되었다면, 샘플에 있는 총 1x108 셀에 대해 1:10 트라이팬 블루 희석으로 총 셀 수를 곱했을 것입니다.
계산이 끝나면 커버슬립을 청소하고 챔버를 세는 것을 기억하십시오!
이제 세포 카운팅 프로, 특정 실험에서 얼마나 많은 세포를 알아야 할 수도 있는 몇 가지 이유에 대해 이야기 해 봅시다.
정상 또는 실험 조직에서 세포를 격리 한 후, 얼마나 많은 세포를 회복했는지 아는 것이 중요합니다. 여기에서 조사자는 얼마나 많은 비장, 또는 비장 세포가 이 마우스 비장에서 격리되었는지 알고 싶을 것입니다.
두 개의 다른 세포 집단이 어떻게 반응하는지 보기 위하여 실험을 능력을 발휘하는 때, B와 T 세포를 가진 이 공동 배양 실험에서 같이, 어떻게 혼합하고 있는지 아는 것이 중요합니다.
다른 많은 유형의 세포 기반 에세이에 대해 얼마나 많은 세포가 있는지 알고 싶을 것입니다. 여기서 ELISPOT 분석은 인간 유두종 바이러스에 대응하여 염증성 단백질인 IFNγ를 분비할 샘플에서 세포의 수를 결정하기 위해 설정되고 있다.
mRNA를 추출해야 하는 실험을 수행할 때 관심 있는 세포에서 추출하거나 격리해야 하는 실험을 수행할 때, 실험을 위해 충분한 양의 mRNA를 획득하기 위해 얼마나 많은 통화로 시작하고 있는지 아는 것이 중요합니다.
패혈계는 세포를 계산하기 위한 저렴하고 상대적으로 사용하기 쉬운 도구이지만 지루할 수 있으며 인간의 실수에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.
Scepter 핸드헬드 자동 카운터는 이름에서 알 수 있듯이, 패혈계에 비해 카운팅 정확도가 향상되고 셀 샘플에서 세포의 크기와 부피를 모두 구별할 수 있는 휴대용 계수 장치입니다.
TC10 자동 셀 카운터는 셀 수와 생존 가능성을 모두 평가하고, 샘플의 총 셀 수를 자동으로 계산하며, 셀도 판독 화면에서 볼 수 있도록 합니다.
당신은 방금 세포 계산에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오에서 우리는 검토: 어떤 백월계는, 세포를 계산하고 세포 생존가능성을 결정하는 방법, 그리고 세포를 계산해야 할 수도 있는 몇몇 다른 이유. 보고 주셔서 감사하고 푸른 세포를 계산하지 기억!
