Overview
וידאו זה מתאר שיטה להסיר מכנית את ממברנות chorion ו vitelline מן ביציות בוגרת קבוע בעבר Drosophila. הפרוטוקול המוצג מציג הדגמה מפורטת של ההליך המניב ביציות התואמות לפלורסנט בשב"כ.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך פרקינס וביקל, באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה סיטו (FISH) כדי לפקח על מצב לכידות הזרוע בפרומטאפאז ומטאפאזה I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. הסרת כוריונים וקרומי ויטלין
שים לב: ראו איור 1 לקבלת כלים הדרושים.
- הפרד ביציות בשלב מאוחר
- הוסיפו 1 מ"ל PBSBTx לצלחת ניתוח רדודה. השתמש P200 עם קצה מצופה BSA להעביר שחלות קבועות (ב ~ 150 μL) לתוך המנה הרדודה. פיפט שחלות למעלה ולמטה עם קצה פיפטה מצופה BSA כדי לעקור את הביציות הבוגרות מן הביציות פחות בוגרת.
- כאשר ביציות בשלב מאוחר מופרדות מספיק, להעביר את כל הרקמה לצינור microfuge μL 500. הסר נוזל עודף עם פיפטה פסטר משך, משאיר על 150 - 200 μL בצינור. חזור על סעיף 1.1 עבור הגנוטיפים הנותרים.
- היכונו לגלגול
- מרטיבים מראש צלחת באר עמוקה עם 200 μL של PBSBTx. מכסים ומניחים בצד. השג 3 שקופיות זכוכית חלבית והגדר שקופית #3 הצידה. משפשפים בעדינות את אזורי הזכוכית הקפואה של השקופיות #1 #2 יחד. יש לשטוף אותם במים שעברו דה-יון כדי להסיר שברי זכוכית ולהתייבש בניגוב חד פעמי.
- ציפוי האזורים הקפואים של שקופיות #1 #2 עם PBSBTx על ידי הוספת 50 μL של PBSBTx לשקופית אחת ושפשוף אזור זה עם השקופית השנייה. מוציאים נוזלים עם מגבון חד פעמי.
- מקם את השקופיות תחת מיקרוסקופ מנתח בתצורה המוצגת באיור 2A. שמור על האזורים הקפואים של השקופיות #1 ועל #2 בקשר, כאשר #3 שקופיות תומכות #2 שקופיות.
- גלגל ביציות; להבטיח כי כיוון הגלגול הוא תמיד בקו ישר ולעולם לא בתנועה מעגלית.
- לפני עצה P200 פיפטה PBSBTx ולפזר את ביציות בצינור microfuge על ידי pipetting למעלה ולמטה. העבר 50 μL של נוזל המכיל ביציות למרכז החלק זכוכית חלבית של שקופית #1. הרם #2 שקופיות כדי לעשות זאת.
- יש להנמיך את #2 השקופית באיטיות עד שמתח פני השטח של הנוזל ייצור חותם בין שני אזורי הזכוכית הקפואה. צריך להיות מספיק נוזלים כדי לכסות את האזור הקפוא אבל אף אחד לא צריך להיות מחלחל החוצה. אם הנוזל עולה על גדותיו, השתמש בפיפט פסטר מושך כדי להסיר נוזל עודף.
- החזק את השקופית התחתונה (#1) במקומה ביד אחת והשתמש ביד השנייה כדי להזיז את השקופית העליונה (#2) קדימה ואחורה בכיוון אופקי, תוך שמירה על רמת החלקה #2 ונתמכת בשקופית #3. בצעו תחת מיקרוסקופ להדמיה קלה של תנועות ביציות והתקדמות.
שים לב: תנועה זו תיצור חיכוך ולגרום ביציות "להתגלגל" ולאבד את chorions שלהם. יש להשתמש בלחץ מינימלי ותנועות צריכות להיות קצרות ומהירות. - לאחר מספר תנועות בכיוון האופקי, שנו מעט את זווית התנועה (איור 2B). במרווחים מרובים, הגדל זווית זו בהדרגה ל- 90° עד שתנועת השקופית העליונה (#2) תגדל בניצב לכיוון ההתחלה (איור 2B). שים לב כי chorions ריק יהיה גלוי בנוזל ביציות חסר chorions יופיע ארוך יותר ודק יותר.
- חזור על שלבים 1.3.3 - 1.3.4 על 7 - 10 פעמים עד הפתרון הופך להיות מעונן מעט. להפסיק לגלגל כאשר רוב ביציות (75 - 85%) נראה שאיבדו את הקרומים הויטליניים שלהם.
שים לב: קצה מחודד ייחודי נראה לעתים קרובות על ביציות חסרות ממברנות ויטלין. ממברנות ויטלין קשה יותר להסיר מאשר chorions. לחץ אור עשוי להיות מופעל על השקופית העליונה (שקופית #2) תוך גלגול כדי להשיג הסרה של ממברנות vitelline. ניסיון להסיר ממברנות ויטלין מכל ביציות לעתים קרובות גורם להרס של ביציות אחרות. - הרם בעדינות את השקופית העליונה (#2), וגרור את אחת מפינותיה למרכז האזור הקפוא של השקופית התחתונה (#1) כך שיציתות מגולגלות יצטברו במרכז האזור הקפוא. יש לשטוף ביציות משתי השקופיות עם PBSBTx לתוך צלחת הבאר העמוקה המכילה PBSBTx.
- נקה מגלשות #1 #2 עם מים דקים במיוחד, יבש עם ניגוב חד פעמי ואיפוס. חזור על שלבים 1.3.1 - 1.3.6 עד שכל ביציות של אותו גנוטיפ התגלגלו. זה בדרך כלל דורש 3 - 4 סיבובים של גלגול לכל גנוטיפ.
- הסר פסולת לאחר גלגול
- הוסף 1 מ"ל PBSBTx לצינור חרוט 15 מ"ל. מערבבים את הנוזל כדי לצפות את דפנות הצינור.
- באמצעות PBSBTx מצופה P1000 פיפטה קצה, להעביר את ביציות מגולגל מצלחת באר עמוק לצינור חרוט המכיל 1 מ"ל של PBSBTx. הוסף 2 מ"ל נוספים של PBSBTx לצינור חרוט המכיל את ביציות.
- תן ביציות להתחיל להתיישב לתחתית, ולאחר מכן להסיר את העליון 2 מ"ל של פתרון המכיל פסולת (chorions, vitellines, וכו ')עם P1000 ולהשליך. במידת הצורך, החזיקו את הצינור החרוטי על רקע כהה כדי לראות את ביציות האטומות בעודן שוקעות.
- הוסף 2 מ"ל נוספים של PBSBTx ל ביציות, וחזור על שלב 1.4.3. חזור על 1.4.3. בסך הכל 3 סיבובים של הסרת פסולת.
- באמצעות קצה פיפטה מצופה PBSBTx, העבר ביציות בחזרה לצינור המיקרופוגה המקורי של 500 μL. 20 - 25 נקבות צריך להניב כ 50 μL של ביציות בוגרת מגולגל.
- חזור על סעיף 4 עבור הגנוטיפים הנותרים באמצעות שקופיות חלביות טריות, צלחת באר עמוקה נקייה, וצינור חרוט חדש לכל גנוטיפ.
- אם יש צורך באחסון, העבירו ביציות ל-PBS 1x עם 0.1% TritionX-100 וחנו לילה ב-4°C. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ כי פורמלדהיד crosslinking יכול להיות הפוך על ידי חומרי ניקוי שאינם יוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: כלי ציטולוגיה. כלים המשמשים בפרוטוקול: (1) זוג מלקחיים (#5 דומונט); (2) מחט טונגסטן; (3) צלחת באר עמוקה עם כיסוי; (4) צלחת ניתוח זכוכית רדודה; (5) משך פיפט פסטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סידור ותנועה של שקופיות לגלגול ביציות. (א) דיאגרמה של השקופית המוגדרת לגלגול ביציות כמתואר בפרוטוקול. האזור הכהה יותר מציין את חלק הזכוכית הקפואה של השקופית. (ב) כיוון וקטורים לגלישה #2 במהלך גלגול ביציות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9" Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| Kimwipes | Various | disposable wipes |
