Korozyon ve Vitelline Membran Mekanik Kaldırma: Drosophila Oositleri Doğrudan Gözleme Hazırlama Yöntemi

Overview

Bu video, daha önce sabitlenmiş olgun Drosophila oositlerinden korozyon ve vitellin zarlarını mekanik olarak çıkarmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, floresan in situ hibridizasyon testleriyle uyumlu oositler sağlayan prosedürün ayrıntılı bir gösterimini göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Perkins ve Bickel'den bir alıntıdır, Prometaphase ve Metafaz I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp'tekiKol UyumUnun Durumunu İzlemek için Floresan Yerinde Hibridizasyon (FISH) Kullanarak . (2017).

1. Chorions ve Vitelline Membranlarının Çıkarılması

NOT: Gerekli araçlar için Şekil 1'e bakın.

1. Geç evre oositleri ayır
   1. Sığ bir diseksiyon kabına 1 mL PBSBTx ekleyin. Sabit yumurtalıkları (~150 μL olarak) sığ kaba aktarmak için BSA kaplamalı uçlu bir P200 kullanın. Pipet yumurtalıkları, olgun oositleri daha az olgun oositlerden çıkarmak için BSA kaplı pipet ucu ile yukarı ve aşağı.
   2. Geç evre oositler yeterince ayrıldığında, tüm dokuyu 500 μL mikrofuge tüpüne aktarın. Fazla sıvıyı çekilmiş bir Pasteur pipetle çıkarın ve tüpte yaklaşık 150 - 200 μL bırakın. Kalan genotipler için bölüm 1.1'i yineleyin.
2. Yuvarlanmaya hazırlanın
   1. 200 μL PBSBTx ile derin bir kuyu kabını önceden ıslatın ve bir kenara koyun. 3 buzlu cam slayt elde edin ve slaytı #3 kenara koyun. Slaytların buzlu cam bölgelerini #1 hafifçe ovalayın ve birbirine #2. Cam parçalarını çıkarmak için deiyonize suda durulayın ve tek kullanımlık bir mendille kurulayın.
   2. Bir slayda 50 μL PBSBTx ekleyerek ve bu bölgeyi diğer slaytla ovalayarak #1 ve #2 slaytların buzlu bölgelerini PBSBTx ile kaplayın. Sıvıyı tek kullanımlık bir mendille çıkarın.
   3. Şekil 2A'dagösterilen konfigürasyonda slaytları bir diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin. Slayt #3 destekleyici slayt #2 ile slaytların buzlu bölgelerini #1 ve #2 iletişim halinde tutun.
3. Rulo oositler; yuvarlanma yönünün her zaman düz bir çizgide olduğundan ve asla dairesel bir hareket olmadığından emin olun.
   1. PBSBTx'te bir P200 pipet ucu hazırlayın ve mikrop tüpündeki oositleri yukarı ve aşağı pipetleme ile dağıtın. Oosit içeren 50 μL sıvıyı slayt #1 buzlu cam kısmının ortasına aktarın. Bunu yapmak için slayt #2 kaldırın.
   2. Sıvının yüzey gerilimi iki buzlu cam bölgesi arasında bir sızdırmazlık oluşturana kadar #2 yavaşça kaydırın. Buzlu bölgeyi kaplayacak kadar sıvı olmalı, ancak hiçbiri dışarı sızmamalıdır. Sıvı taşıyorsa, fazla sıvıyı çıkarmak için çekilmiş bir Pasteur pipet kullanın.
   3. Alt slaydı (#1) bir elinizle yerinde tutun ve üst slaydı (#2) yatay bir yönde ileri geri hareket ettirmek için diğer elinizin altında tutun, slaydı #2 düzeyde tutun ve slayt #3 destekleyin. Oosit hareketlerinin ve ilerlemesinin kolay görselleştirilmesi için mikroskop altında gerçekleştirin.
      NOT: Bu hareket sürtünme yaratacak ve oositlerin "yuvarlanmasına" ve koroyonlarını kaybetmesine neden olacaktır. Minimum basınç kullanılmalı ve hareketler kısa ve hızlı olmalıdır.
   4. Yatay yönde birkaç hareket yaptıktan sonra, hareket açısını hafifçe değiştirin (Şekil 2B). Birden fazla artışta, üst slaytın hareketi (#2) başlangıç yönüne dik olana kadar bu açıyı kademeli olarak 90 ° 'ye çıkarın (Şekil 2B). Sıvıda boş konkordatoların görüleceğini ve korozyondan yoksun oositlerin daha uzun ve daha ince görüneceğini unutmayın.
   5. Çözelti hafif bulutlu hale gelene kadar 1.3.3 - 1.3.4 adımlarını yaklaşık 7 - 10 kez tekrarlayın. Oositlerin çoğunluğu (%75 - 85) olduğunda yuvarlanmayı durdurun Vitelline membranlarını kaybetmiş gibi görünüyor.
      NOT: Belirgin bir sivri uç genellikle vitelline zarlarından yoksun oositlerde görülebilir. Vitelline zarlarının çıkarılması koroyonlardan daha zordur. Vitelline membranlarının çıkarılmasını sağlamak için yuvarlanırken üst kaydırağa (slayt #2) ışık basıncı uygulanabilir. Vitelline membranlarını tüm oositlerden çıkarmaya çalışmak genellikle diğer oositlerin yok edilmesine neden olur.
   6. Üst slaydı (#2) yavaşça kaldırın, köşelerinden birini alt kaydırağın buzlu bölgesinin ortasına sürükleyin (#1), böylece yuvarlanmış oositler buzlu bölgenin merkezinde birikir. PBSBTx ile her iki slayttan da oositleri PBSBTx içeren derin kuyu kabına durulayın.
   7. #1 ve #2 slaytları ultra saf suyla temizleyin, tek kullanımlık mendille kurutun ve sıfırlayın. Aynı genotipin tüm oositleri yuvarlanana kadar 1.3.1 - 1.3.6 adımlarını yineleyin. Bu genellikle genotip başına 3 - 4 tur yuvarlanma gerektirir.
4. Yuvarlandıktan sonra enkazı kaldırma
   1. 15 mL konik tüpe 1 mL PBSBTx ekleyin. Tüpün kenarlarını kaplamak için sıvıyı döndürün.
   2. PBSBTx kaplı P1000 pipet ucu kullanarak, haddelenmiş oositleri derin kuyu kabından 1 mL PBSBTx içeren konik tüpe aktarın.
   3. Oositlerin dibe yerleşmeye başlamasına izin verin, ardından bir P1000 ile enkaz (koroyonlar, vitellinler vb.)içeren çözeltinin üst 2 mL'lik kısmını çıkarın ve atın. Gerekirse, opak oositleri batarken görmek için konik tüpü koyu bir arka plana doğru tutun.
   4. Oositlere ek bir 2 mL PBSBTx ekleyin ve 1.4.3 adımını yineleyin. 1.4.3'i tekrarlayın. toplam 3 tur enkaz kaldırma için.
   5. PBSBTx kaplı P1000 pipet ucu kullanarak, oositleri orijinal 500 μL mikro yakıt tüpüne geri aktarın. 20 - 25 dişi yaklaşık 50 μL haddelenmiş olgun oosit vermelidir.
5. Taze buzlu kaydıraklar, temiz bir derin kuyu kabı ve her genotip için yeni bir konik tüp kullanarak kalan genotipler için bölüm 4'ü tekrarlayın.
6. Depolama gerekirse, oositleri% 0,1 TritionX-100 ile 1x PBS'ye aktarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Formaldehit çapraz bağlama iyonik olmayan deterjanlarla tersine çevrilebildiğinden uzun süreli depolama önerilmez.

Representative Results

Şekil 1: Sitoloji araçları. Protokolde kullanılan araçlar: (1) bir çift yabanalaps (#5 Dumont); (2) tungsten iğnesi; (3) kapaklı derin kuyu yemeği; (4) sığ cam diseksiyon kabı; (5) pastör pipeti çekti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yuvarlanan oositler için slaytların düzenlenmesi ve hareketi. (A) protokolde açıklandığı gibi oositlerin yuvarlanması için ayarlanan slaydın diyagramı. Daha koyu alan, slaytın buzlu cam kısmını gösterir. (B) Oosit haddeleme sırasında kayma #2 için hareket vektörlerinin yönü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes