تغذية RNAi في الثقافة السائلة: طريقة عالية الإنتاجية لضرب التعبير الجيني في C. elegans

Overview

RNAi هو أداة وراثية قوية متاحة للباحثين C. elegans. يقدم هذا الفيديو طريقة لعلاج المزيد من الديدان مع RNAi من تغذية اللوحة باستخدام ظروف الثقافة السائلة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Groh وآخرون، طرق لدراسة التغيرات في تجميع البروتين المتأصل مع التقدم في السن في Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2017).

1. الثقافة السائلة للحيوانات النند أقل لجمع الحيوانات الصغيرة والمسنين تتعرض لRNAi استهداف جين من الفائدة

ملاحظة: استجابة بعض الجينات لRNAi يمكن أن تعتمد على درجة الحرارة كما وصفها سابقا. كبديل لRNAi ، يمكن دمج جين متحول في خلفية gon-2 (-).

1. إعداد البكتيريا للاستزراع السائل
   1. إعداد OP50 والبكتيريا RNAI (البكتيريا المنتجة للdsRNA المطلوب والبكتيريا مع ناقلات فارغة كمكافحة) عن طريق تلقيح 4 L LB المتوسطة مع 12 مل من الثقافة البكتيرية المعنية (إضافة تركيز نهائي من 50 ميكروغرام / مل كاربينسيلين و 1 MM IPTG إلى الثقافات البكتيرية RNAI) واحتضانها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 180 دورة في الدقيقة.
   2. في اليوم التالي حصاد الثقافات في 6700 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatants و resuspend كل بيليه في 60 مل الجليد الباردة S الوسائط القاعدية (100 mM NaCl، 50 mM فوسفات البوتاسيوم pH 6، أبقى على الجليد). احتفظ بالكريات الثلاثة التي أعيد إنفاقها (OP50، والتحكم في بكتيريا RNAi، وبكتيريا RNAi لجين الفائدة) عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة 1.2.
      ملاحظة: يمكن زراعة الديدان على RNAi من مرحلة L1 أو لتجنب عيوب النمو من المرحلة الأخيرة من اليرقات L4 (انظر الخطوة 1.2).
2. زراعة سائلة للعلاج مع RNAi بدءا من المرحلة الأخيرة من اليرقات L4
   1. إضافة وسائط القاعدية 200 مل S في قارورة ثقافة فرنباخ (قدرة 2800 مل). للحصول على حجم ثقافة نهائي قدره 300 مل (انظر 1.2.2.4) ، أضف 10 mM سيترات البوتاسيوم ، pH 6 ، محلول 3 مل من المعادن النزرة (5 مل من حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA)، 2.5 mM FeSO₄، 1 mM MnCl₂، 1 mM ZnSO₄، 0.1 mM CuSO₄, 3 م مغسو₄, 3 م م كاكل₂, 100 نانوغرام / مل كاربينديزيم, و 5 ميكروغرام / مل الكوليسترول). إغلاق القارورة مع غطاء المسمار غشاء. راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخازن المؤقتة.
   2. أخرج ال L1s من 25 درجة مئوية ونقلها إلى أنابيب 15 مل. الطرد المركزي في 1,900 x g لمدة 3 دقائق, إزالة supernatant, والعد L1s لكل 2 ميكرولتر. إضافة 500,000 L1s في قارورة الثقافة فرنباخ أعدت في الخطوة السابقة.
   3. أضف OP50 (من الخطوة 1.1) بشكل متناسب مع عدد الديدان. على سبيل المثال، ل 500،000 الديدان إضافة 60 مل OP50.
   4. ثقافة دودة كاملة مع القاعدية S ليصل إجمالي حجم إلى 300 مل. احتضان ثقافة الدودة حتى مرحلة L4 عند 25 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع 150 دورة في الدقيقة.
   5. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الديدان بحجم L4s البرية. لتغيير من OP50 إلى البكتيريا RNAi، وجمع الحيوانات في ستة أنابيب 50 مل، والسماح لهم الرواسب وإزالة supernatant. غسل L4s مع M9 لإزالة البكتيريا OP50 المتبقية: الطرد المركزي في 1900 × ز لمدة 3 دقائق، وإزالة supernatant ونقل جميع L4s في أنبوب واحد 50 مل. عد L4s لكل 5 ميكرولتر (تسع مرات على الأقل). هناك حاجة مرتين 50،000 L4s لجمع دودة الشباب ومرتين 100،000 L4s هناك حاجة لجمع الديدان القديمة.
   6. إعداد أربعة قوارير ثقافة فرنباخ كما هو موضح في 1.2.2.1. إضافة أيضا تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل كاربينسيلين و 1 M IPTG إلى كل قارورة.
   7. إضافة البكتيريا RNAi التحكم والبكتيريا RNAi لجين الفائدة (من الخطوة 1.1) بالتناسب مع عدد من الديدان: إضافة 7 مل من البكتيريا المعنية لكل قارورة للديدان الشباب و 14 مل لكل قارورة للديدان المسنين.
   8. إضافة 50،000 الديدان لكل قارورة لجمع دودة الشباب و 100،000 الديدان لكل قارورة لجمع دودة المسنين، واستكمال الثقافات مع القاعدية S لملء ما يصل إلى 300 مل. احتضان الثقافات دودة (أربعة في المجموع) في 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.

2. الحفاظ على الثقافات السائلة C. elegans

1. جمع دوريا aliquot من كل ثقافة السائل ومكان على شريحة زجاجية (بدلا من ذلك على لوحة أجار) للتحقق من عدم وجود تلوث. باستخدام مجهر تشريح، تحقق من مستويات الغذاء البكتيري في الثقافة وخاصة خلال مرحلة النمو. إعداد مقدما 2 L الثقافات للسيطرة على البكتيريا RNAi والبكتيريا RNAi لجين الفائدة كما هو موضح في الخطوة 1.1. إضافة هذه إلى الثقافات السائلة C. elegans إذا لزم الأمر والحفاظ على بقية في 4 درجة مئوية.
2. تحقق بشكل دوري من أن الحيوانات معقمة. غالبية الحيوانات لن يكون لها وند. اعتمادا على penetrance من طفرة غون-2، قد يكون البعض قد أجهض هياكل غدد الغدد التناسلية ولكن لا ينبغي ملاحظة أي مع البيض.

حل المخزون	مبلغ	التركيز النهائي	تعليقات / وصف
S القاعدية (ل500 مل: 5.9 غرام NaCl، 50 مل 1 م فوسفات البوتاسيوم pH 6)	200 مل		1 M فوسفات البوتاسيوم pH 6: ل 1 لتر: 129 غرام KH2PO4 أحادية، 52 غرام K2HPO4 اللامائية الديباسيتش
1 م البوتاسيوم سيترات pH 6 (ل 400 مل: 13.1 غرام من حمض الستريك أحادي الهيدروهيدرات، 134.4 غرام ثلاثي البوتاسيوم سيترات مونوهيدرات)	3 مل	10 mM
تتبع حل المعادن (ل 1 لتر: 1.86 غرام من حمض الإيثيليندامينتتراستيك (EDTA)، 0.69 غرام فيسو4 · 7 H2O, 0.2 غرام MnCl2 · 4 H2O, 0.29 غرام ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 غرام CuSO4 · 5 H2O)	3 مل		تخزين المخازن الحل في الظلام في 4 °C
1 م مغسو4 (500 مل: 123.3 غرام)	900 ميكرولتر	3 مليون متر
1 M CaCl2 (ل500 مل: 73.5 غرام)	900 ميكرولتر	3 مليون متر
200 ميكروغرام/مل كاربندازيم (ل 50 مل: 10 ملغ في الميثانول)	150 ميكرولتر	100 نانوغرام/مل
5 ملغم/مل كوليسترول (ل100 مل: 0.5 غرام في الإيثانول)	300 ميكرولتر	5 ميكروغرام/مل

الجدول 1 - الجداول

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]