RNAi-utfodring i flytande kultur: En hög genomströmningsmetod för att slå ner genuttryck i C. elegans

Overview

RNAi är ett kraftfullt genetiskt verktyg som är tillgängligt för C. elegans-forskare. Den här videon introducerar en metod för att behandla fler maskar med RNAi än tallriksmatning genom att använda flytande odlingsförhållanden.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Groh et al, Metoder för att studera förändringar i inneboende protein aggregering med ålder i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Flytande odling av gonadfria djur för att samla unga och åldrade djur som utsätts för RNAi och som riktar sig mot en gen av intresse

OBS: Svaret från vissa gener på RNAi kan vara temperaturberoende som tidigare beskrivits. Som ett alternativ till RNAi kan en mutant gen införlivas i gon-2(-) bakgrunden.

1. Beredning av bakterier för flytande odling
   1. Förbered OP50- och RNAi-bakterier (bakterier som producerar önskat dsRNA och bakterier med den tomma vektorn som kontroll) genom att inokulera 4 L LB-medium med 12 ml av respektive bakteriekultur (tillsätt en slutlig koncentration på 50 μg/mL karbenicillin och 1 mM IPTG till RNAi bakteriekulturer) och inkubera dem vid 37 °C över natten vid 180 varv/min.
   2. Nästa dag skörda kulturerna vid 6 700 x g i 10 min vid 4 °C. Ta bort supernatanterna och återanvänd varje pellet i 60 ml iskallt S basalmedia (100 mM NaCl, 50 mM kaliumfosfat pH 6, hålls på is). Håll de tre återanvända pelletsen (OP50, kontrollera RNAi-bakterier och RNAi-bakterier för den gen som är av intresse) vid 4 °C till steg 1.2.
      OBS: Maskar kan odlas på RNAi från L1-scenen eller för att undvika utvecklingsdefekter från det sista larvstadiet L4 (se steg 1.2).
2. Flytande kultur för behandling med RNAi med start i sista larvstadiet L4
   1. Tillsätt 200 ml basala S-medier i en Fernbach-odlingskolv (kapacitet 2 800 ml). För en slutlig odlingsvolym på 300 ml (se 1.2.2.4), tillsätt 10 mM kaliumcitrat, pH 6, 3 ml Spårmetalllösning (5 mM etylendiamintetraacetsyra (EDTA), 2,5 mM FeSO_4,1 mM MnCl_2,1 mM ZnSO_44,0,1 mM CuSO_4),3 mM MgSO_4,3 mM CaCl_2,100 ng/mL karbindazim och 5 μg/ml kolesterol). Stäng kolven med ett membranskruvlock. Se tabell 1 för recept på buffertar.
   2. Ta L1:an ur 25 °C och överför dem till 15 ml rör. Centrifugera vid 1 900 x g i 3 min, ta bort supernaten och räkna L1:orna per 2 μL. Lägg till 500 000 L1:or i Fernbachs odlingskolv som förberetts i föregående steg.
   3. Lägg till OP50 (från steg 1.1) proportionellt till antalet maskar. För 500 000 maskar lägger du till exempel till 60 ml OP50.
   4. Komplett maskkultur med S basal för att få den totala volymen till 300 ml. Inkubera maskkulturen tills L4-stadiet vid 25 °C i en skakande inkubator med 150 varv/min.
   5. Nästa dag bör maskarna vara storleken på vilda L4: or. För att byta från OP50 till RNAi-bakterier, samla djur i sex 50 ml-rör, låt dem sedimentera och ta bort supernatanten. Tvätta L4:an med M9 för att avlägsna kvarvarande OP50-bakterier: centrifug vid 1900 x g i 3 min, ta bort supernaten och överför alla L4:er till ett 50 ml-rör. Räkna L4:an per 5 μL (minst nio gånger). Två gånger behövs 50 000 L4:or för den unga masksamlingen och två gånger 100 000 L4 behövs för den åldrade masksamlingen.
   6. Förbered fyra Fernbach-odlingskolvar enligt beskrivningen i 1.2.2.1. Tillsätt också en slutlig koncentration på 50 μg/ml karbinicillin och 1 mM IPTG till varje kolv.
   7. Tillsätt kontroll RNAi-bakterier och RNAi-bakterier för den gen som är av intresse (från steg 1.1) proportionellt till antalet maskar: Tillsätt 7 ml av respektive bakterie per kolv för unga maskar och 14 ml per kolv för de åldrade maskarna.
   8. Tillsätt 50 000 maskar per kolv för den unga masksamlingen och 100 000 maskar per kolv för den åldrade masksamlingen och fyll kulturerna med S-basal för att fylla upp till 300 ml. Inkubera maskkulturerna (totalt fyra) vid 25 °C och 150 varv/min.

2. Underhåll av C. elegans flytande kulturer

1. Samla regelbundet en alikvot från varje flytande kultur och placera på en glasrutschbana (alternativt på en agarplatta) för att kontrollera att det inte finns några föroreningar. Använd ett dissekeringsmikroskop, kontrollera bakteriella matnivåer i kulturen, särskilt under tillväxtfasen. Förbered i förväg 2 L-kulturer av kontroll RNAi-bakterier och RNAi-bakterier för den gen av intresse som beskrivs i steg 1.1. Tillsätt dessa i C. elegans flytande kulturer om det behövs och håll resten vid 4 °C.
2. Kontrollera regelbundet att djuren är sterila. Majoriteten av djuren kommer inte att ha en gonad. Beroende på penetrance av gon-2 mutationen, vissa kan ha avbrutit gonadal strukturer men inga djur med ägg bör observeras.

Lagerlösning	Belopp	Slutlig koncentration	Kommentarer/Beskrivning
S basal (För 500 ml: 5,9 g NaCl, 50 ml 1 M kaliumfosfat pH 6)	200 ml		1 M Kaliumfosfat pH 6: För 1 L: 129 g KH2PO4 monobasiskt, 52 g K2HPO4 dibasisk vattenfri
1 M Kaliumcitrat pH 6 (För 400 ml: 13,1 g citronsyramonhydrat, 134,4 g trikaliumcitratmonhydrat)	3 ml	10 mM
Spåra metalllösning (För 1 L: 1,86 g etylendiamintetraacetsyra (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 H2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Förvara lagerlösningen i mörker vid 4 °C
1 M MgSO4 (För 500 ml: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (För 500 ml: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Karbaendazim (För 50 ml: 10 mg i metanol)	150 μL	100 ng/ml
5 mg/ml kolesterol (För 100 ml: 0,5 g i etanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabell 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]