Saggio di cattura delle prede: un metodo per studiare il comportamento di cattura delle prede della larva di Zebrafish

Overview

Questo video descrive il saggio di acquisizione delle prede. Il video discute il metodo per studiare il comportamento di cattura delle prede delle larve di zebrafish dopo l'ablazione laser di specifici neuroni.

Protocol

1. Valutazione delle conseguenze comportamentali a seguito dell'ablazione laser

1. Impostare un sistema di registrazione comportamentale costituito da uno stereoscopio dotato di una videocamera. Utilizzare una fotocamera con un software di acquisizione immagini appropriato, commerciale o su misura (Figura 1A).
2. Ottimizzare le condizioni di illuminazione in modo che il paramecium possa essere rilevato dall'elaborazione delle immagini. Ad esempio, utilizzare una luce LED bianca ad anello con un distanziale (Figura 1B).
   Nota: La distanza e l'angolo del LED influiscesull'aspetto del campione (cioè,luminoso su sfondo scuro o scuro su sfondo luminoso) e sono, quindi, fondamentali per una corretta elaborazione delle immagini. Determinare l'altezza migliore del distanziale (Figura 1C).
3. Posizionare una larva di zebrafish (recuperata dall'esperimento di ablazione laser descritto nella sezione 1) in una camera di registrazione comportamentale (che era attaccata a uno scivolo di vetro) con la guarnizione superiore originale rimossa(Figura 1D).
4. Raccogliere 50 paramecia sospese in acqua dal becher utilizzando una micropipetta e posizionarle nella camera di registrazione.
5. Posizionare un foglietto di copertura sopra la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia d'acqua sullo scivolo di copertura prima di posizionarlo sulla superficie dell'acqua della camera di registrazione per evitare di introdurre aria nella camera.
   Nota: In questo passaggio, un po 'd'acqua con paramecia trabocca dalla camera di registrazione. Il numero rimanente di paramecia nella camera di registrazione sarà di circa 30-40.
6. Posizionare la camera di registrazione (contenente una larva e una paramecia)nel sistema di illuminazione (Figura 1D).
7. Inizia la registrazione time-lapse a 10 fps per 11 min (6.600 fotogrammi).
8. (Facoltativo) Per ogni larva che è stata testata per il comportamento, osservare la fluorescenza delle aree laser-ablate mediante microscopia fluorescenteper confermare l'efficacia dellalaser-ablazione (cioè, assenza o numero significativamente ridotto di cellule fluorescenti nell'area irradiata al laser).
   Nota: Anche dopo l'irradiazione, alcune cellule fluorescenti possono ancora essere osservate a causa dell'insorgenza successiva dell'espressione genica Gal4 nelle cellule che si differenziano dopo l'ablazione.
9. Dopo aver registrato il comportamento della larva, per compensare la mancanza di uniformità in background, eseguire una divisione pixel per pixel di ogni fotogramma da un'immagine media nelle Fiji: fare clic su 'Processo', 'Calcolatrice immagine', 'Operazione: Dividi', 'risultato a 32 bit(float)' e 'OK'. Per creare un'immagine media, fare clic su 'Immagine', 'Stack', 'Progetto Z', 'Intensità media' e 'OK' (Figura 1E, F).
10. Contare il numero di paramecia rimaste nella camera facendo clic su 'Analizza', 'Analizza particelle', impostando un intervallo di area che copre tutta la paramecia,selezionando la casella di controllo 'Mostra:Maschere' e facendo clic su 'OK'. L'opzione 'Mostra:Maschere' fornirà un'immagine di paramecia estratta (Figura 1G), con un elenco del numero di particelle (paramecia) in ogni fotogramma.
11. Traccia il numero di paramecia rimaste nella camera di registrazione nel tempo. Poiché le stime del numero di paramecia sono rumorose, si consiglia di eseguire una media mobile su ogni punto in un intervallo di 600 fotogrammi (1 min) sul foglio di calcolo.

Representative Results

Figura 1. Test di cattura delle prede e dati rappresentativi nelle larve di zebrafish ablate al laser. (A) Sistema di registrazione comportamentale. Lo stereomicroscopio era dotato di una telecamera CMOS. Le immagini sono state acquisite utilizzando uno script personalizzato. (B) Componenti dell'impianto di illuminazione. Una carta di colore grigio, un diffusore di vetro, una luce ad anello LED bianca, un diffusore, un distanziale su misura (cartone) e un diffusore con un foro al centro. (C) Il sistema di illuminazione assemblato dalle parti indicate nella camera di registrazione B. (D) per il saggio di cattura delle prede. Una camera (diametro: 20 mm; profondità: 2,5 mm) è stata posizionata su uno scivolo di vetro. Il sigillo superiore originale della camera è stato staccato. Una copertina di vetro è stata messa sulla camera di registrazione. (E) Immagine grezza da una cornice del filmato registrato. (F) Fotogramma diviso (pixel per pixel) per un'immagine media in un filmato. Si noti che lo sfondo non uniforme nell'illuminazione può essere compensato da questa elaborazione delle immagini. (G) Paramecia estratta da un fotogramma utilizzando la funzione "Analisi delle particelle" nelle Figi. (H) Esempio di immagine nelle Figi con una soglia applicata. La paramecia appare luminosa, mentre gli occhi della larva zebrafish appaiono scuri e lo sfondo è grigio. I cambiamenti nelle posizionidegli occhi (cioè,angoli rispetto all'asse del corpo) possono essere calcolati, se necessario. (I) Dati sperimentali rappresentativi del consumo di paramecium in una larva di controllo (OB) olfattiva-bulbo-ablata e in una larva pretectum-ablata (PT). L'ablazione del Pretectum ha ridotto significativamente la capacità di caccia alle prede mentre l'ablazione olfattiva dei bulbi non l'ha influenzata.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging