Av Yakalama Tahlil: Zebra Balığı Larvalarının Av Yakalama Davranışını İncelemek İçin Bir Yöntem

Overview

Bu videoda av yakalama tahlili açıklanmaktadır. Video, belirli nöronların lazer ablasyonundan sonra zebra balığı larvalarının av yakalama davranışını inceleme yöntemini ele alıyor.

Protocol

1. Lazer Ablasyon Sonrasında Davranışsal Sonuçların Değerlendirilmesi

1. Video kamera ile donatılmış bir stereoskop içeren bir davranışsal kayıt sistemi kurun. Ticari veya özel yapım uygun bir görüntü alma yazılımına sahip bir kamera kullanın (Şekil 1A).
2. Parameciumun görüntü işleme ile algılanabilmesi için aydınlatma durumunu optimize edin. Örneğin, aralayıcılı bir halka beyaz LED ışığı kullanın (Şekil 1B).
   Not: LED'den uzaklık ve led açısı, örneğin görünümünü etkiler(yani,koyu arka planda parlak veya parlak arka planda koyu) ve bu nedenle başarılı görüntü işleme için kritik öneme sahiptir. Aralayıcının en iyi yüksekliğini belirleyin (Şekil 1C).
3. Bir zebra balığı larvasını (Bölüm 1'de açıklanan lazer-ablasyon deneyinden kurtarıldı) orijinal üst mühür çıkarılmış bir davranış kayıt odasına (cam slayda bağlı) yerleştirin (Şekil 1D).
4. Bir mikropipette kullanarak beherden suda asılı 50 paramecia toplayın ve kayıt odasına yerleştirin.
5. Kayıt odasının üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Odaya hava sokmamak için kayıt odasının su yüzeyine yerleştirmeden önce kapak kaymasına küçük bir damla su koyun.
   Not: Bu adımda, paramecia ile bir miktar su kayıt odasından taşacaktır. Kayıt odasında kalan paramecia sayısı yaklaşık 30-40 olacaktır.
6. Kayıt odasını (larva ve parameciaiçeren) aydınlatma sistemine yerleştirin (Şekil 1D).
7. Zaman atlamalı kaydı 11 dakika (6.600 kare) boyunca 10 fps'de başlatın.
8. (İsteğe bağlı) Davranış açısından test edilen her larva için, lazer ışınlanan bölgedeki floresan hücrelerin etkinliğini(yani,yokluk veya önemli ölçüde azaltılmış floresan hücre sayısı) doğrulamak için floresan mikroskopi ile lazerle emilen bölgelerin floresanını gözlemleyin.
   Not: Işınlamadan sonra bile, ablasyondan sonra farklılaşmış hücrelerde Gal4 gen ekspresyonunun daha sonra başlaması nedeniyle bazı floresan hücreler hala gözlemlenebilir.
9. Larvaların davranışını kaydettikten sonra, arka plandaki homojenlik eksikliğini telafi etmek için, Fiji'de her karenin ortalama bir görüntüye göre piksel piksel bölünmesini gerçekleştirin: 'İşlem', 'Görüntü Hesaplayıcısı', 'İşlem: Bölme', '32 bit(float)sonucu' ve 'Tamam'ı tıklayın. Ortalama bir görüntü yapmak için 'Resim', 'Yığınlar', 'Z-Project', 'Ortalama yoğunluk' ve 'Tamam'(Şekil 1E, F) öğelerinitıklatın.
10. 'Analiz Et', 'Parçacıkları Analiz Et'e tıklayarak, tüm paramecia'yı kapsayan bir alan aralığı ayarlayarak , 'Göster:Maskeler' onay kutusunu işaretleyerek ve 'Tamam'ı tıklatarak odada kalan parameciasayısını sayın. 'Göster:Maskeler' seçeneği, her karedeki parçacık sayısının ( paramecia ) bir listesini içeren ayıklanmış birparameciagörüntüsü (Şekil 1G) sağlayacaktır.
11. Zaman içinde kayıt odasında kalan paramecia sayısını çizin. Paramesi sayısının tahminleri gürültülü olduğundan, elektronik tabloda 600 kare (1 dk) aralığında her noktada hareketli bir ortalama gerçekleştirmenizi öneririz.

Representative Results

Şekil 1. Lazerle ablated zebra balığı larvalarında test ve temsili verileri avla. (A) Davranışsal kayıt sistemi. Stereomikroskop bir CMOS kamera ile donatılmıştı. Görüntüler özel yapım bir komut dosyası kullanılarak elde edildi. (B) Aydınlatma sisteminin bileşenleri. Gri renkli bir kağıt, cam difüzör, beyaz LED halka ışığı, difüzör, özel yapım bir aralayıcı (karton) ve merkezinde bir delik bulunan difüzör. (C) Av yakalama tahlil için B. (D) Kayıt odasında gösterilen parçalardan monte edilen aydınlatma sistemi. Cam bir kaydırağın üzerine bir oda (çap: 20 mm; derinlik: 2,5 mm) yerleştirildi. Odanın orijinal üst mührü soyulmuş. Kayıt odasına bir cam kapak konuldu. (E) Kaydedilen filmin bir karesinden ham görüntü. (F) Bir filmdeki ortalama görüntüye bölünmüş bir kare (piksel piksel). Aydınlatmadaki tekdüze olmayan arka planın bu görüntü işleme ile telafi edilebileceğini unutmayın. (G) Paramecia, Fiji'deki "Parçacık Analizi" işlevini kullanarak bir çerçeveden çıkarılır. (H) Fiji'de uygulanan eşiğe sahip görüntü örneği. Paramecia parlak görünürken, zebra balığı larvalarının gözleri koyu görünür ve arka plan gridir. Gerekirse göz pozisyonlarındaki değişiklikler(yanivücut eksenine göre açılar) hesaplanabilir. (I) Koku alma ampulü ablated kontrol larvasında (OB) ve pretektum ablated larvada (PT) paramecium tüketiminin temsili deneysel verileri. Pretektum ablasyon, koku alma ampulü ablasyonu onu etkilemezken av avlama yeteneğini önemli ölçüde azalttı.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging