Summary
유전자 조작의 시간적 및 공간적 해상도는 그들이 교란 수있는 생물 학적 현상의 스펙트럼을 결정합니다. 여기 temporally과 공간 개별 사용
Abstract
생체내의 electroporation에 C. 분들을 포함하여, 개발 배아의 특정 지역에 유전자 표현 plasmids, RNAi 시약 및 morpholino 안티 센스의 oligonucleotides를 전달하기위한 강력한 방법입니다 엘레간스, 병아리, Xenopus, zebrafish, 및 마우스 1. zebrafish에서 생체내의 electroporation 이러한 시약 2-7의 전달을 위해 우수한 공간과 시간적 해상도를 가질 표시되었습니다. 그것이 개발의 특정 단계에서 다음과 시약의 설립을 허용하기 때문에이 방법의 시간적 해상도가 중요합니다. electroporated 벡터의 표현 6 시간 7 시간 때문에 발생합니다 또한,이 방법은 유전자 변형 접근법보다 시의 적절합니다. 단일 셀 2, 6을 대상으로했을 때 공간 해상도가 매우 정확하게 할 수 있지만, 그것은 조직이나 구조 내에서 특정 세포 인구에 시약을 통합하는 것이 바람직합니다. 여러 개의 세포를 대상으로하면, 생체내의 electroporation에있는 배 (胚)의 특정 지역에 배달을위한 효율적입니다 있지만, 특히 개발 신경계 내에서 그것은 전적으로 공간 이산 electroporation을 통해 특정 세포 유형을 대상으로 어렵습니다. 또는 확장기 트랩 형질 전환 라인 transgenes 8 우수한 세포 유형의 특정 표현을 제공합니다. 여기 우리는 특별히 zebrafish 후각 망울의 뉴런을 개발 대상으로 생체내 electroporation 7, 9 공간 분리와 유전자 변형 Gal4 기반 향상제 트랩 라인 8 결합한 방법을 설명합니다. 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 (이전 GA80_9)는 확장기 트랩 라인 이전에 hindbrain 포함한 개발 두뇌의 여러 지역에서 zebrafish에 의해 mCherry의 중재의 대상으로 유전자 변형 표현을 표시 최적화 Gal4 (KalTA4) transcriptional 활성제를 8 설명 소뇌, forebrain 및 후각 망울. 후각 망울, 여러 Gal4 구속력 사이트 (UAS)의 통제하에 GFP의 코딩 순서와 플라스미드에 구체적으로 GFP 발현을 대상으로하는 것은 24~28시간 후 수정 (HPF)에서 forebrain의 앞쪽에 끝에 electroporated되었습니다. 이 방법은 forebrain의 여러 지역에 플라스미드 DNA을 포함하지만, GFP 발현은 transgenically KalTA4 전사 인자를 표현 세포 유도합니다. 따라서 GA080_9 유전자 변형 라인을 사용하여,이 방법은 개발 후각 망울에서 독점적으로 GFP 발현되었다. 이전 후각 망울 10 승모판 세포에 대해 설명한이 방법을 통해 대상 GFP 표현 세포는 전형적인 axonal 전망을 보여주었다. 이 방법은 공간과 temporally 이산 손실의 기능을 분석하는 방법을 제공하는 짧은 헤어핀 RNA 간섭의 표현 plasmids 등 다른 시약의 타겟 배달을 위해 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. 유전자 변형 배아
- 여기 transposon - 중재 향상제 트랩 방식 8 만든 zebrafish의 유전자 변형 라인을 사용하고 있습니다. KalTA4, Gal4 transcriptional 활성제의 zebrafish 최적화된 버전 및 적색 형광 단백질 mCherry : 유전자 변형 삽입은 두 코딩 시퀀스를 포함하고 있습니다. 내생 향상제 시퀀스 제어하에이 유전자 변형 카세트을 표현 형질 zebrafish의 확장기 트랩 방식 수율 라인. 따라서, 특정 향상제 시퀀스의 신원에 따라 KalTA4 및 mCherry 두 표현은 개발 두뇌의 특정 지역에 지역화된 것입니다. 잇 (Gal4TA4, UAS : zic4 mCherry)에 우리가 여기서 사용하는 hzm5 라인 표현이 여기에 특히 중요, hindbrain, forebrain, 여러 사이트에 지역화된 있으며, 후각 망울 8 (또한 그림 1 참조). . 표현의 패턴, 그리고 게놈 내에서 카세트의 지방화 언급 한대로, transgenes는 (참고 zic4 모터 8 지배하에있을 것으로 예측 아르 http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimaging / lines_distel / 주 )..
- 성인 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) 유전자 변형 삽입에 대한 heterozygous hzm5 생선은 일반적으로 약 50 % 자손에게 유전자 변형 선도, WT (AB) 물고기와 성관계를하고 있습니다. (형질 자식의 높은 비율, 두 heterozygotes는 성관계를 할 수 있습니다.)
- 색소 형성을 차단하고 형광 이미징을 촉진, 6-8 HPF 100 μm의 N - phenylthiourea (PTU) 시작과 함께 유전자 변형 배아를 치료하기 위해서는.
2. 장착 배아
- 24-28 HPF에서 PTU없이 계란 물을 배아를 전송할 수 있습니다. 형광 현미경을 사용하여 mCherry 표현으로 유전자 변형 배아를 식별합니다. 좋은 집게를 사용하여 유전자 변형 배아에서 chorionic 멤브레인를 제거합니다. 4 : 전송 배아는 electroporation 버퍼 플러스 0.02 % tricaine [180 MM NaCl, 5 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH를 7.2 Electroporation 버퍼]에 들어있는 페트리 접시에 자신의 chorion에서 해방. 마취 2 분 장착 단계로 진행하기 전에 적용을 허용합니다.
- 솔루션을 microwaving 후 34-37 ° C 배양기에 솔루션을 배치하여 electroporation 버퍼 플러스 tricaine에서 낮은 용해 포인트 아가로 오스의 0.5 % 용액을 준비합니다. 아가로 오스 솔루션의 온도가 equilibrated되면, 60mm 페트리 접시의 중심에 아가로 오스 솔루션의 큰 방울 (~ 500 μl)을 놓으십시오. 아가로 오스의 드롭 6-8 anesthetized 배아를 추가합니다.
- 좋은 포셉 (또는 컷 microloader의 pipet 팁의 미세 종료)를 사용하여 위치를 그들이 모두 같은 방향으로 향하게하고 수직 연속으로 정렬하는 등 배아. 아가로 오스를 응고하고, 위치에 배아를 트랩하기 위해 얼음로부터 2-3 밀리 큰 페트리 접시에 요리를 놓으십시오.
- 아가로 오스가 확정되면 솔루션이 완전히 경화 아가로 오스 드롭을 커버 있도록, electroporation 버퍼 플러스 tricaine와 함께 요리를 홍수.
3. 플라스미드 DNA 표현의 마이크로 주입
- MIDI 또는 맥시 - 준비 플라스미드 격리 키트 (예 : Qiagen)를 사용하여 플라스미드 GFP 표현을 준비합니다. 0.5 μg / 멸균 물 속에 μl 플러스 0.03 % 페놀 레드의 최종 농도에 플라스미드를 일시 중지합니다. 후각 망울 대상으로 실험이 여기에 설명된 위해, 우리는 여러 Gal4 구속력 사이트 (14 탠덤 UAS 시퀀스 및 기초 생선 발기인, E1b)의 통제하에 EGFP의 코딩 순서와 플라스미드 표현을 사용하고 있습니다. transgenically KalTA4 전사 인자를 표현이 플라스미드만이 세포를 사용하면 GFP를 표현하는 수있을 것이다, 그러므로, GFP의 목표 표현을 중재.
참고 : 여기에 우리가 개발하고 두뇌의 다른 지역을 타겟팅에 대해 적용되어야 DNA를 주사의 시각화를위한 페놀 레드를 사용하는만큼이 지역이 심실에서 액세스할 수 있습니다. 형광 가시화를 필요로 다른 세포 유형의 타겟팅에 대해, Bodipy 또는 Quantam 점 염료는 잠재적으로 형광등 조명 아래에 주사를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. - Microinjection의 pipettes은 중 수평 및 수직 피펫 풀러를 사용하여 조작하실 수 있습니다. 열 및 풀 강도 설정 풀러, 가열 요소의 유형의 종류에 따라 다릅니다, 유리 모세관 튜브의 종류 것입니다.
서터 P - 30 수직 풀러를 사용하여, 필라멘트와 함께 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 모세관 유리 긴 테이퍼, 날카로운 pipettes을 생산하는 980의 열 설정과 960의 풀 무력을 사용 [서터 악기 # BF100 - 78 - 10]. 이러한 설정으로 뽑았 Microinjetion의 pipettes은 봉인하고 주입하기 전에 다시 고장난해야합니다. - 사출 피펫으로 DNA 플라스미드 솔루션 1-2 μl를 추가하는 microloader의 피펫 팁을 사용합니다.
- 마운트 및압력 분사 시스템 피펫 홀더에 로드된 피펫을 확보.
- 압력 펄스가 빨간색 DNA 솔루션의 부풀 릴리스를 생산까지 미세 집게로 로드된 피펫 다시 휴식. 또는, 팁은 빠르게 변할, 접힌 실험실 Kimwipe를 관통하여 다시 고장 수 있습니다.
참고 : 사출 pipettes가 처음에 봉인되고 수동으로 다시 깨진해야하기 때문에, 끝 크기 및 사출 량이 변수입니다. 이상적인 사출 pipettes 완전히 24 HPF의 배아 (40 PSI 100 MS 분사 펄스)의 개발 forebrain의 뇌실을 채우기 위해 3-5 분사 펄스를 필요로한다. - 이러한 것을 DNA가 인접 강제하고, 후각 망울을 형성 운명 두뇌의 지역에 intercalated있는 개발 두뇌의 심실에 플라스미드 DNA 솔루션을 주사. 후각 망울은 forebrain의 뇌실의 가장 앞쪽에 벽에 세포에서 파생됩니다. 따라서, 피펫은 개발 두뇌의 앞쪽에 끝 방향으로 가리 키는지 등 심실에 주입 피펫을 삽입하여, 압력 분사는 DNA에와 미래의 후각 망울에 인접한를 강요합니다. 빨간색 염료가 forebrain의 뇌실의 앞쪽에 끝에 명확하게 볼 수 있습니다까지 DNA를 주사. DNA는 DNA를 diluting 즉시 보급하기 시작하기 때문에, 그것은 주사 후 가능한 빨리 electroporation 단계 (예를 들어, 10 초 이내)으로 진행하는 것이 중요합니다.
4. Electroporation
- Electroporation은 그라스 플래티넘 subdermal 전극 (그라스 기술 # E2)로 만든 자기 만들어진 전극을 사용하여 수행됩니다. 전극은 휴대용 프로브에 연결된, 그리고 백금 전극 사이의 최종 거리는 1mm (건설에 대한 자세한 내용은 9 참조)해야합니다. 스퀘어 - 웨이브 electroporation 펄스는 그라스 SD - 9 자극기 (그라스 기술, 모델은 SD - 9)에 전극을 연결하여 생성됩니다.
- 70 볼트에서 단일, 5 MS의 electroporation 펄스를 생성하기 위해 SD - 9 자극기를 설정합니다. 부정적인 전극은 배아 머리에 후부있는 동안 긍정적인 전극은, 배 (胚)의 앞쪽에 엔드에 인접한 위치는 그러한 전극을 위치. 수동으로 ~ 1 초 각 펄스를 분리, SD - 9 자극기의 단일 모드 스위치를 사용하여 ~ 7-8 electroporation의 펄스를 시작합니다. 적절한 전압은 태아의 나이 및 사용 전압 소스에 따라 다릅니다. 이전 배아가 electroporation 7 시작 높은 전압을 필요로하는 반면 젊은 배아는 낮은 전압 배아 손상을 방지해야합니다.
- 배아는 아가로 오스로부터 우리를 자유롭게하기 전에 electroporation 후 적어도 10 분 복구할 수 있습니다.
- 좋은 집게를 사용하여 자신 배아와 실제 접촉을 피하면서 부드럽게 태아의 개요를 추적하여 아가로 오스의 배아 무료입니다.
- 일단 해방된 (PTU와 함께 필요한 경우) 계란 물을 배아를 반환합니다. 28에서 그들을 유지 ° C들은 GFP 발현을 위해 몇 군데 될 때까지.
5. 이미징 장착 배아
- 계란 물 플러스 PTU에서 계란 물을 더한 0.02 % tricaine에 배아를 전송합니다. 마취에 대한 몇 분은 설치 단계를 계속하기 전에 적용을 허용합니다.
- 솔루션을 microwaving 후 34-37 ° C 배양기에 솔루션을 배치하여 계란 물을 플러스 tricaine에서 낮은 용해 포인트 아가로 오스의 0.5 % 용액을 준비합니다. 아가로 오스 솔루션의 온도가 equilibrated되면, 35mm 페트리 접시의 중심에 아가로 오스 솔루션의 큰 방울 (~ 300 μl)을 놓으십시오. 아가로 오스의 드롭 한 anesthetized 배아를 추가합니다.
- 좋은 포셉 (또는 컷 microloader의 pipet 팁의 미세 종료)를 사용하여 위치를 그들이 가능 직립 현미경 (거꾸로 스코프가 다른 배아 지오메 트리를 필요와 개발 두뇌의 지느러미보기를 시각화 수 있도록, 직립하는 등 배아 아래에서 시각화을 허용하는 다른 요리,)는 12을 참조하십시오. 얼음로부터 2-3 밀리 큰 페트리 접시에 접시를 배치하여 아가로 오스를 응고. 고급 집게로 다시 오리 엔테이션 가능성이 배아는쪽으로 넘어하지 않도록하기 위해 응고하는 동안 필요합니다.
- 아가로 오스가 확정되면, 홍수 계란 물 플러스 tricaine 함께 그릇이 솔루션은 완전히 경화 아가로 오스 드롭을 커버 있도록.
6. 대표 결과 :
GFP 발현이 electroporation 후 6시간 빠르면 관찰 될 수 있지만, 여기는 4 일 대상 세포의 neurite 구조가 충분히 개발 이러한 electroporation 후 배아의 이미지를 보여주는있다. 잇은 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 유전자 변형 향상제 트랩 라인 hindbrain에 mCherry의 제정 표현 (및 KalTA4)를 표시 소뇌, forebrain, 그리고 오일 이후의 수정 (에서 태아의 후각 망울 그림 1A와 1C). 타겟 electroporation (위에서 설명한 것처럼), 개발 후각 망울의 세포 (그림의 1B, 1D, 그리고 1E)에 제한 표시 GFP 발현 플라스미드에 의해 통합 UAS - GFP 발현 있었 배아. 전용 전지 transgenically - 표현 KalTA4 전사 인자하면이 UAS - GFP 플라스미드의 표현을 활성화 할 수 있습니다. 비 - 유전자 변형 배아에 플라스미드이 정관은 감지 GFP 발현을 초래할하지 않습니다. 그러므로, 그것은 UAS - GFP 및 개발 후각 망울의 세포에서 GFP의 독점적인 표현에 이르게 KalTA4 드라이버화된 유전자 변형 표현의 대상 electroporation의 결합 동작입니다. GFP - 표현 세포가 후각 망울 승모판 세포 (그림 1B와 1D) 10 전형적인 axonal 전망을 보여줍니다. 축삭의 계획을 시각화하기 위해 그림 1B와 1D의 이미지는 세포 기관의 지방이 잘 과다 노출된 것과 같은 높은 수준의 노출했다. 노출의 낮은 수준 (그림 1E)는 GFP를 표현하는 세포 기관은 실제로 후각 망울 (.; 회색 라인은 후각 망울의 경계를 표시 그림 1C와 1E을 비교)에 지역화된 것을 보여줍니다.
그림 1. 5 DPF의 zebrafish 배아의 후각 망울에서 GFP 발현을 타겟. 잇 (zic4 : Gal4TA4, UAS : mCherry) hzm5 유전자 변형 향상제 트랩 라인, hindbrain, 소뇌, forebrain 및 후각 망울 (A와 C, mCherry 형광은 빨간색으로 표시)에 mCherry의 제정 표현을 표시합니다. mCherry의이 표현은 유전자 변형 Gal4 표현에 의해 중재됩니다. 28 HPF에서 UAS - GFP 발현 벡터와 함께 electroporated되었습니다 배아는에서와 같이 녹색으로 표시된 대상 GFP의 오일 후 수정에서 후각 망울 (B, D로 표현하고, E, GFP 형광. 동일한 배아를 표시하고 C). 하단에있는 낮은 노출 이미지 (E)는 GFP 표현은 후각 망울의 세포 기관으로 제한됩니다 보여줍니다. 회색 라인은 후각 망울의 경계를 나타냅니다. 명시야 (그레이 스케일), 녹색 형광 (녹색), 그리고 적색 형광 (적색) 이미지는 모든 올림푸스 BX60 형광 현미경으로 데리고 있었다.
Discussion
여기서 우리는 개발 후각 망울에서 세포의 특정 인구에 electroporated transgene 표현을 대상으로 확장기 트랩 Gal4 유전자 변형 라인을 활용하여 zebrafish의 생체내의 electroporation 방법에 설명합니다. 이러한 접근 방식은 확장기 트랩 유전자 변형 라인 8 시까지 중재 세포 유형 특정 표현과 생체내의 electroporation 7의 탁월한 시간적 해상도를 결합한 제품입니다. 여기에 비록 우리는 생체내의 electroporation에 후각 망울의 목표를 설명해야 개발 신경계 2-7의 다른 지역을 대상으로 사용할 수 있으며, 확장기 트랩 라인은 다양한 특정 세포 유형이나 조직에 Gal4 타겟팅 표현 사용할 수 있습니다 8, 11. 물론,이 electroporation 기술 또한 LexA 또는 Tet 시스템을 13, 14, 15와 같은 다른 combinatioral 유전 접근법에 적합해야합니다. electroporation의 가장 큰 장점은 적당한 Gal4 라인을 사용할 수있는 점을 감안할 때 추가적인 유전자 변형 라인을 만들 필요가 없다는 것입니다. 이것은 6 개월을 절약할 수 있습니다.
생체내의 electroporation에 신경 시스템 개발의 특정 단계에 관심 7 뭐든지에서 뉴런과 엽 성의 전구 물질로 oligonucleotides의 설립을 허용합니다. 그것이 이전의 발달 단계에서 필수적인 기능을 대상으로 유전자 문제를 회피 할 수 있기 때문에 시간적 해상도 손실의 기능 분석에 특히 유리합니다. 우리가 여기서 설명하는 방법도 RNAi의 oligonucleotides 또는 구성 및 morpholino 안티 - 감각 oligonucleotides 4, 7 포함한 손실 기능 시약을 통합하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 지배 - 부정적인 단백질 발현 plasmids 또는 짧은 헤어핀 RNAi의 plasmids과 같은 플라스미드 기반의 시약은 또한 정확한 세포 유형 특정 표현을 우리는 GFP 표현 보시려면 여기를 보여준 수있게 Gal4 UAS의 통제하에 둘 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 존 혼 (; R15MH083221 NIMH)에 NIH R15 지역 교부금을 통해 투자되었다.
Materials
Reagents:
Equipment:
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