Inriktning luktbulben nervceller som använder kombinerade In Vivo Elektroporation och Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Summary

Den tidsmässiga och geografiska genetiska manipulationer bestämmer spektrum av biologiska fenomen som de kan störa. Här använder vi tidsmässigt och rumsligt diskreta

Abstract

In vivo elektroporering är en kraftfull metod för att leverera plasmider DNA uttryck, RNAi reagens och morpholino anti-sense oligonukleotider till vissa regioner för att utveckla embryon, inklusive C. elegans, fågelunge, Xenopus, zebrafisk och mus ^1. I zebrafisk har in vivo-elektroporering visat sig ha goda rumsliga och tidsmässiga upplösningen för leverans av dessa reagenser ^2-7. Den temporala upplösningen i denna metod är viktigt eftersom det möjliggör införlivandet av dessa reagenser i vissa stadier i utvecklingen. Dessutom, eftersom uttryck från electroporated vektorer sker inom 6 timmar ^7, är denna metod snabbare än transgena metoder. Medan den rumsliga upplösningen kan vara mycket exakt när du riktar en enda cell ^{2, 6,} är det ofta bättre att införliva reagens i en specifik cell befolkning inom en vävnad eller struktur. När du riktar flera celler in vivo elektroporering är effektiv för leverans till en viss region av embryot, men särskilt inom utvecklingen av nervsystemet, är det svårt att rikta specifika celltyper enbart genom rumsligt diskreta elektroporation. Alternativt, förstärkare fälla transgena linjerna erbjuder utmärkt celltyp specifika uttryck för transgener ^8. Här beskriver vi en metod som kombinerar transgena Gal4-baserad förstärkare fällan linjer ⁸ med spatialt diskret in vivo elektroporering ^{7, 9} att särskilt inrikta utveckla nervceller i zebrafisk luktbulben. ET (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 (tidigare GA80_9) förstärkare trap linje som beskrivs tidigare ^8, visar riktade transgena uttryck mCherry förmedlas av en sebrafisk optimerad Gal4 (KalTA4) transkriptionell aktivator i flera regioner i den växande hjärnan, inklusive hindbrain, lillhjärnan, framhjärnan och luktbulben. Om du vill rikta GFP uttryck specifikt till luktbulben, en plasmid med kodning sekvens av GFP under kontroll av flera Gal4 bindningsställen (UAS) var electroporated i främre änden av framhjärnan på 24-28 timmar efter befruktning (HPF). Även om denna metod innehåller plasmid-DNA i flera regioner i framhjärnan är GFP uttryck bara induceras i celler transgenically uttrycka KalTA4 transkriptionsfaktor. Således, genom att använda GA080_9 transgena linjen ledde detta sätt att GFP uttryck uteslutande i utvecklingsländer luktbulben. GFP-innehållande celler riktade genom denna metod visade typiska axonal prognoser, som tidigare beskrivits för mitralceller av luktbulben ^10. Denna metod kan också användas för målstyrning av andra reagenser inklusive kortfristiga hårnål RNA-plasmider interferens uttryck, vilket skulle ge en metod för rumsligt och tidsmässigt diskreta förlust-av-funktion analys.

Protocol

1. Transgena embryon

1. Här är vi med hjälp av en transgen linje av zebrafisk skapas genom transposon-medierad förstärkare fällan metod ^8. De transgena in inkluderar två kodande sekvenser: KalTA4, en zebrafisk-optimerad version av Gal4 transkriptionell aktivator, och den röda fluorescerande proteinet, mCherry. Den förstärkare fällan metod ger rader av transgena zebrafisk som uttrycker denna transgena kassett under kontroll av en endogen förstärkare sekvens. Således, beroende på vem av de särskilda förstärkare sekvensen, är uttryck för både KalTA4 och mCherry lokaliserade till specifika områden i den växande hjärnan. För Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 linje som vi använder här, är uttryck lokaliserad till flera platser i hindbrain, framhjärnan, och av särskild betydelse här, luktbulben ⁸ (se även figur 1.) . Med tanke på detta mönster av uttryck och lokalisering av kassetten inom genomet, är transgenerna förutspås vara under kontroll av zic4 promotor ⁸ (se även http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroradiologiska / lines_distel / main .).
2. Vuxen Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 fisk heterozygot för transgena in är oftast parad med WT (AB) fisk, vilket leder till ca 50% transgen avkomma. (För en högre andel transgena avkommor kan två heterozygoter att paras.)
3. För att blockera pigment och för att underlätta fluorescerande bildbehandling, behandla transgena embryon med 100 mikroM N-phenylthiourea (PTU) med början vid 6-8 HPF.

2. Montering embryon

1. Vid 24-28 HPF, överföra embryon till ägg vatten utan PTU. Identifiera transgena embryon genom uttryck av mCherry med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Ta bort chorionic membranet från transgena embryon med fin pincett. Överför embryon befrias från sina chorion till en petriskål med elektroporation buffert plus 0,02% tricaine [elektroporation Buffer: 180 mM NaCl, 5 mm KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mm HEPES, pH 7,2] ^4. Låt 2 minuter för bedövningen ska börja gälla innan du fortsätter med monteringen steg.
2. Bered en 0,5% lösning med låg smältpunkt agaros i elektroporering buffert plus tricaine av mikrovågsugnen lösningen och sedan placera lösningen i ett 34-37 ° C inkubator. När temperaturen på agaroslösningen har ekvilibrerats, placera en stor droppe (~ 500 l) av agaroslösningen till mitten av en 60 mm petriskål. Lägg 6-8 sövda embryon till denna droppe agaros.
3. Med fin pincett (eller den fina ändar skär tips microloader pipett), placera embryon så att de alla är vända åt samma håll och anpassas i en vertikal rad. För att stelna Agar, och fånga de embryon på plats, placera skålen på en stor petriskål med 2-3 mm is.
4. När agarosen stelnat, översvämning skålen med elektroporation buffert plus tricaine, se till att lösningen helt täcker stelnat agarosen droppe.

3. Mikroinjektion av DNA uttryck plasmid

1. Förbered GFP uttrycket plasmiden med hjälp av en midi-eller maxi-prep plasmid isolering kit (t.ex. Qiagen). Häng plasmiden till en slutlig koncentration av 0,5 mikrogram / l i sterilt vatten plus 0,03% fenolrött. För luktbulben riktade experiment som beskrivs här använder vi ett uttryck plasmid med kodande sekvens EGFP under kontroll av flera Gal4 bindningsställen (14 tandem UAS sekvenser och de basala fisk promotor, E1b). Med hjälp av denna plasmid, endast celler transgenically uttrycka KalTA4 transkriptionsfaktor kommer att kunna uttrycka GFP, alltså, förmedla riktade uttryck av GFP.
   Obs: Här använder vi fenolrött för visualisering av DNA-injektioner, som bör gälla för att rikta andra regioner i den växande hjärnan, så länge som regionen kan nås från ventriklarna. För inriktning av andra celltyper som kräver fluorescerande visualisering, kunde Bodipy eller Quantam Dot färgämnen potentiellt användas för att visualisera injektioner med fluorescerande belysning.
2. Mikroinjektion pipetter kan tillverkas med antingen en horisontell eller vertikal pipett avdragare. Värme och pull-styrkan Inställningarna varierar beroende på vilken typ av avdragare, typ av värmeelement, och vilken typ av glas kapillärrör.
   Med hjälp av en Sutter P-30 vertikala avdragare, använd ett värmeläge på 980 och en pull-kraft 960 för att producera långa, avsmalnande, vass pipetter från tunnväggiga borosilikat kapillär glas med glödtrådar [Sutter Instrument # BF100-78-10]. Microinjetion pipetter dras med dessa inställningar är förseglade och måste brytas tillbaka innan injektion.
3. Använd ett tips microloader pipett för att lägga till 1-2 l DNA-plasmid lösning till injektion pipett.
4. Montera ochsäkra den laddade pipetten i trycket insprutningssystemet pipett hållare.
5. Break tillbaka lastade pipetten med fin pincett tills tryckpulser producera pustade ut den röda DNA-lösningen. Alternativt kan tips brytas upp genom att snabbt tränga in ett nedsänkt, vikt laboratorium Kimwipe.
   OBS: Eftersom injektionen pipetter initialt förseglade och måste manuellt bruten rygg, spets storlek och injektionsvolymen är variabel. Idealisk injektion pipetter bör kräva 3-5 insprutningspulser att helt fylla utvecklingsländerna framhjärnan kammare 24 HPF embryon (100 ms insprutningspulser vid 40 psi).
6. Injicera plasmid-DNA lösningen i ventriklarna i den växande hjärnan så att DNA tvingas intill, och intercalated in, den region av hjärnan är avsedda att bilda luktbulben. Luktbulben härrör från celler i de främre väggen i framhjärnan ventrikeln. Således, genom att sätta in injektion pipetten i ventriklarna så att pipetten är riktad mot den främre änden av den växande hjärnan tvingar trycket injektion av DNA i och intill den blivande luktbulben. Injicera DNA tills röd färg syns tydligt i den främre änden av framhjärnan ventrikeln. Eftersom DNA börjar sprida omedelbart, utspädning av DNA, är det viktigt att gå vidare till elektroporation steg så snart som möjligt efter injektion (t ex inom 10 sek).

4. Elektroporation

1. Elektroporation utförs med hjälp av egentillverkade elektroder tillverkade av subdermal Grass platina elektroder (Grass Technology # E2). Elektroderna är kopplade till en handhållen givare, och den slutliga avståndet mellan platina elektroder ska vara 1 mm (för detaljer om konstruktion se ^9). Square-våg elektroporation pulser produceras genom att ansluta elektroder till en Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, modell SD-9).
2. Ställ in SD-9 stimulator för att producera singel, 5 ms elektroporation pulser på 70 volt. Placera elektroderna så att den positiva elektroden är placerad i anslutning till främre änden av embryot, medan den negativa elektroden är posteriort om embryot huvudet. Manuellt initiera ~ 7-8 elektroporation pulser med single-mode knappen på SD-9 stimulator, mellan varje puls med ~ 1 sek. Lämpliga spänningar varierar beroende på åldern på embryon och spänningskälla används. Yngre embryon kräver lägre spänning för att undvika att embryot skadas, medan äldre embryon kräver högre spänning att inleda elektroporation ^7.
3. Låt embryon att återhämta sig i minst 10 min efter elektroporation innan befria dem från agarosen.
4. Med fin pincett, utan embryon från agarosen genom att försiktigt spåra konturerna av embryon och samtidigt undvika själva kontakt med embryona själva.
5. När befriade du tillbaka de embryon som ägget vatten (med PTU om det behövs). Håll dem vid 28 ° C tills de ska avbildas för GFP uttryck.

5. Montering embryon för bildbehandling

1. Överför embryon från ägg vatten plus PTU mot ägg vatten plus 0,02% tricaine. Låt flera minuter för bedövningen ska börja gälla innan du fortsätter med monteringen steg.
2. Bered en 0,5% lösning med låg smältpunkt agaros i ägget vatten plus tricaine av mikrovågsugnen lösningen och sedan placera lösningen i ett 34-37 ° C inkubator. När temperaturen på agaroslösningen har ekvilibrerats, placera en stor droppe (~ 300 l) av agaroslösningen till mitten av en 35 mm petriskål. Lägg till en sövda embryo till denna droppe agaros.
3. Med fin pincett (eller den fina ändar skär tips microloader pipett), placera embryon så att de är i upprätt läge, vilket gör det möjligt att visualisera en rygg bild av utvecklingen av hjärnan med en upprätt mikroskop (inverterad oscilloskop kommer att kräva en annan embryo geometri, och en annan maträtt så visualisering underifrån, se ^12). Stelna agarosen genom att placera skålen på en stor petriskål med 2-3 mm is. Omorientering med fin pincett kommer sannolikt att krävas under solidifiering för att säkerställa att embryot inte faller över på sin sida.
4. När agarosen stelnat, översvämning skålen med ägg vatten plus tricaine säkerställer att lösningen helt täcker stelnat agarosen droppe.

6. Representativa resultat:

Även om GFP uttryck kan observeras så tidigt som sex timmar efter elektroporation, är vi här visar bilder från ett embryo 4 dagar efter elektroporation så att neurite struktur målceller tillräckligt utvecklat. ET (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgena förstärkare trap line visar konstitutivt uttryck av mCherry (och KalTA4) i hindbrain, lillhjärnan, framhjärnan och luktbulben med embryon till 5 dagar efter befruktningen (Fig. 1A och 1C). Embryon som har haft en UAS-GFP uttryck plasmid som införlivats genom riktade elektroporation (enligt ovan), visar GFP uttryck som är begränsad till cellerna i utvecklingsländerna luktbulben (Fig. 1B, 1D och 1E). Endast celler transgenically-uttrycker KalTA4 transkriptionsfaktor kan aktivera uttryck från denna UAS-GFP plasmid. Införlivandet av denna plasmid till icke-transgena embryon inte leder till någon påvisbar GFP uttryck. Det är alltså den kombinerade effekten av riktade elektroporering av UAS-GFP och lokal transgena uttryck för KalTA4 drivrutin som leder till exklusiva uttryck av GFP i celler av utvecklingsländerna luktbulben. GFP-uttryckande celler visar typiska axonal projektioner av luktbulben mitralceller (bild 1B och 1D) ^10. För att visualisera Axon prognoser, hade bilder i figur 1B och 1D att exponeras vid höga nivåer så att regionen cellen kroppar var väl överexponerade. En lägre exponering (Fig. 1E) visar att cellen organ uttrycker GFP verkligen är lokaliserade till luktbulben (jämför figur 1C och 1E,. Grå linjen markerar gränsen till luktbulben).

Figur 1. Riktade GFP uttryck i luktbulben av en 5 DPF zebrafisk embryo. ET (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgena förstärkare trap line, visar konstitutivt uttryck av mCherry i hindbrain, lillhjärnan, framhjärnan och luktloben (A och C, mCherry fluorescens visas i rött). Detta uttryck för mCherry medieras av transgena Gal4-uttryck. Embryon som har electroporated med en UAS-GFP uttryck vektor på 28 HPF, visa riktade GFP uttryck i luktloben på 5 dagar efter befruktningen (B, D och E, GFP fluorescens visas i grönt. Samma embryo som i A och C). En lägre exponering bild i botten (E) visar att GFP uttryck är begränsad till cell organ luktbulben. Den grå linjen visar gräns luktbulben. Ljusa fält (gråskala), grön fluorescens (grön), och röd fluorescens (röd) bilder var alla tar med en Olympus BX60 fluorescensmikroskop.

Discussion

Här har vi beskrivit en in vivo-elektroporering metod i zebrafisk som utnyttjar en förstärkare fälla Gal4 transgena linje att rikta uttryck för electroporated transgenen till en viss population av celler i utvecklingsländerna luktbulben. Detta synsätt kombinerar utmärkt temporala upplösningen i in vivo-elektroporering ⁷ med celltyp specifika uttryck medierad av förstärkare fälla transgena linjerna ^8. Även här har vi beskrivit inriktningen på luktbulben, in vivo-elektroporering kan användas för att rikta andra regioner i att utveckla nervsystemet ^2-7 och förstärkare fälla linjer finns med riktade uttryck Gal4 i många olika specifika celltyper eller vävnader ^{8, 11.} Naturligtvis bör detta elektroporation tekniken även lämplig för andra combinatioral genetiska tillvägagångssätt, t.ex. Lexa eller Tet-system ^{13, 14, 15.} En stor fördel med elektroporation är att det inte finns behov av att göra ytterligare transgena linjerna med tanke på att en lämplig Gal4-line är tillgänglig. Detta sparar sex månader.

In vivo elektroporering möjliggör införlivandet av oligonukleotider i nervceller och deras prekursorer oavsett på vilken specifik skede av nervsystemet utveckling är av intresse ^7. Denna temporala upplösningen är särskilt fördelaktigt för förlust-av-funktion analys eftersom det kan kringgå problem med inriktning på gener som har viktiga funktioner i tidigare utvecklingsstadier. Den metod vi beskriver här kan också användas för att införliva förlust-av-funktionen reagenser inklusive RNAi oligonukleotider eller konstruerar och morpholino anti-sense oligonukleotider ^{4, 7.} Plasmid-driven reagens som dominant-negativa plasmider proteinuttryck eller kort hårnål RNAi plasmider kan också placeras under kontroll av en Gal4 UAS, gör det möjligt att exakt celltyp specifika uttryck vi har visat här för uttryck av GFP.

Materials

Reagents: Agarose, low-melting-point (Sigma, A9414) Plasmid midi- or maxi-prep kit (e.g. Qiagen, #12643] Phenol red (Sigma, P3532) Equipment: Capillary glass with filament; ID = 0.78 mm; OD = 1.0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10) Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Model SD-9) Grass platinum subdermal electrodes, straight needle (Grass Technology, #E2) Micro-loader pipette tips (Eppendorf, #X22703R) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30)