En kvantitativ metod för analys av kromosom-replikering timing beskrivs. Metoden utnyttjar BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerande<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) för att bedöma replikering tidpunkten för däggdjur kromosomer. Denna teknik möjliggör direkt jämförelse av omarrangerade och un-ordnas kromosomer i samma cell.
Däggdjurs-DNA-replikation initieras vid flera ställen längs kromosomer vid olika tidpunkter under S-fasen, efter en tidsmässig replikering program. Specifikationen av replikering timing tros vara en dynamisk process regleras av vävnads-specifika och utvecklande ledtrådar som är lyhörda för epigenetiska modifieringar. Dock fortfarande de mekanismer som reglerar var och när DNA-replikation initierar längs kromosomer dåligt kända. Homologa kromosomer replikeras oftast synkront, men det finns viktiga undantag från denna regel. Till exempel i kvinnliga däggdjursceller en av de två X-kromosomer blir sen replikera genom en process som kallas X inaktivering 1. Tillsammans med denna fördröjning i replikering timing, uppskattas till 2-3 timmar, blir majoriteten av gener transkriptionellt tystas på en X-kromosom. Dessutom reglerar en diskret cis-verkande lokuset, känd som X inaktivering centrum, denna inaktivering X, inbegripet the induktion av fördröjd replikering timing på hela inaktiva X-kromosomen. Dessutom har vissa kromosom omdisponeringar som finns i cancerceller och celler som exponeras för joniserande strålning visa en signifikant fördröjning i replikering tidpunkten för> 3 timmar som påverkar hela kromosom 2,3. Senaste arbete från vår labb visar att avbrott i diskreta cis-agerande autosomalt loci resulterar i en extremt sent replikera fenotyp som påverkar hela kromosom 4. Ytterligare "kromosom tekniska" studier visar att vissa kromosom omflyttningar påverkar många olika kromosomer resulterar i denna onormala replikering-timing fenotyp, vilket tyder på att alla däggdjur kromosomer innehåller diskreta cis-verkande loci som styr korrekt replikering tidpunkten för enskilda kromosomer 5.
Här presenterar vi en metod för kvantitativ analys av kromosom-replikering timing kombinerat med fluorescent in situ hybridisering. Dettametod möjliggör en direkt jämförelse av replikering timing mellan homologa kromosomer inom samma cell, och anpassades från 6. Dessutom tillåter denna metod för otvetydig identifiering av kromosomala rearrangemang som korrelerar med förändringar i replikering timing som påverkar hela kromosomen. Denna metod har fördelar jämfört med nyutvecklade hög genomströmning mikro-array eller sekvensering protokoll som inte kan skilja mellan homologa alleler som finns på omarrangerade och un-ordnas kromosomer. Dessutom, eftersom den här beskrivna metoden utvärderar enskilda celler, kan man upptäcka förändringar i kromosom-replikering timing på kromosomala rearrangemang som är närvarande i endast en bråkdel av cellerna i en population.
Beredningen av kromosom sprider är ett kritiskt steg för att framgångsrikt replikering-timing analys som beskrivits här. Införandet av en Colcemid förbehandlingssteg före hypoton behandling kan hjälpa frekvens och spridning av mitotiska celler. Vi utsätter typiskt celler till colcemdi för 1-3 timmar före skörd och användning Colcemid vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. Emellertid kan införande av ett kolcemid förbehandlingssteg ändra längden på G2 och följaktligen kan förändra den skenbara r…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Cancer Institute, CA131967.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |