에 신약 표현형을 평가 초파리 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

여기에 설명 된 분석의 특이성은 도파민 뉴런 ^3의 특정 표현을 달성하기 위해 티로신 수산화 효소 유전자의 조절 서열을 이용 GAL4 플라이 라인의 사용에 의존하고 있습니다. 티로신 수산화 효소는 도파민 합성의 첫 번째 및 속도 제한 단계를 촉매. 생체 내에서 DA의 뉴런 (예 ^6을 참조)을 식별 할 수있는 좋은 후보 TH하는 도파민의과 성인 플라이 뇌 중복의 TH 면역 반응. 또한, THGal4의 발현 패턴 도파 탈 카르복시 화 효소 유전자의 조절 서열을 포함하고 DA 뉴런에서뿐만 아니라 유전자 발현을 드라이브 같은 DdcGal4 다른 GAL4 라인보다 더 구체적이고, 또한 ³ glial 세포의 serotoninergic 뉴런 집합에 .

Feany 및 벤더 (2000)은 최초의 PD 링크 된 인간 α-synuclein의 유전자의 팬의 연결을 표현 역의 진보적 인 손실을 가속 관찰초파리 rtle에 의한 부정 geotaxis 동작. 우리는 expressionof α-synuclein의 유전자 ^10를 구동하는 DA-신경 세포의 특정 THGal4 줄을 사용하여 유사한 결과를 관찰하고이에 NRF2 통로의 신경 역할을 연구하기 위해이 기능을 읽기 중 사용한 PD ¹⁴ 초파리 모델. 여기에 설명 된 특정 분석은 ^{2와 3에서} 적응됩니다.

초파리 뇌 (예 : ^{11 7} 참조) 공 촛점 현미경에 의해 뇌 전체 마운트에 시각화 할 수있는 적어도 5 개의 다른 클러스터에 배치 100 개 이상의 DA 뉴런 (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3)가 포함되어 있습니다. 그러나 연령에 따라 신경 변성이 PD 연결된 유전자가 변이 된 곳에 파리에서 관찰 / 인간의 질병을 모델로 과발현이며 나이 ^{9, 11과} 초파리 뇌의 감소에있는 DA의 뉴런의 수 있는지 여부를 아직 논란이있다5. DA 신경 세포에서 인간의 α-synuclein의 발현은 영향을 가지고 있으며, 따라서, PD를위한 모델로 사용하고있다. 여기에서 우리는 DA의 뉴런은 세포 마커로 TH를 사용하여 마운트 전체 뇌의 계산에 대한 분석을 설명합니다. 이 분석은 ^{13, 10에서} 적응하고있다.

1. 놀람에 의한 부정 Geotaxis의 분석

1. 원하는 유전자형의 파리를 선택, 그들을 20-30의 동물 동료의 그룹 무작위, 성별로 구분하고 2-3 일마다 새로운 음식 유리 병에 그들을 플립, 시험 비행의 각 집합 (즉, 연령 일치 동료, 하나의 집단 / 유전자형) 일주일에 한 번 이상.
2. 부정적인 geotaxis 테스트하기 전에 삼십 분, CO _2와 함께 파리를 마취와 두 개의 빈 음식 유리 병 (재료 표 참조) (실 치수 투명 테이프로 자신의 구멍에 결합하여 만든 사전 - 라벨 투명 플라스틱 튜브에 배치 : 19cm X 2.85 cm). 우리의 분석에서 우리는 일반적으로 25 파리 / 튜브를 사용합니다.
   참고. 마취에서 회복 시간이 몇 시간 몇 분에서 변경 될 수 있습니다 (예 : O / N) 및 테스트 특정 유전자형에 최적화되어야한다.
3. 수직 계면에 압지 테이프 종이에 서로 다른 높이를 (1 - 20에서 cm) 표시전자, 벤치 수직.
4. 종이의 앞에 튜브를 넣 관은 모든 정렬되어야하고 정확한 높이 측정을 할 수 있도록 용지에 가능한 닫아야합니다.
5. 대 (피펫 팁 상자 등)에 종이 20-30cm의 거리에서, 관 앞에 디지털 카메라 ( "특수 장비"표 참조) 배치 "영화"옵션을 선택하고 시작 기록;이 시점에서 당신은 또한 연속적인 시험 사이의 시간을 추적하기 위해 타이머를 시작합니다.
6. 파리가 몇 초 (예 : 10 초)의 튜브를 눌러 튜브의 바닥에서 수집 할 수 있습니다. 이 단계는 전체 실험을하는 동안 (즉, 같은 기간, 같은 힘, 같은 연산자) 지속적으로 수행해야합니다.
7. 10 초 동안 디지털 카메라로 녹화 파리 '운동.
8. 한 분 간격으로 단계 1.5-1.7 열네 번 반복합니다.
9. 데이터 분석 :
   1. 위에있는 파리의 수를 계산기록 영화의 육안 검사로 10 초 후에 2 센티미터 마크입니다.
      참고 : 우리의 분석 조건에서 비행 '부정적인 geotaxis 동작이 깜짝 놀라게 한 후 마지막으로 처음 10 초 이상하지 않은 (즉 파리는 그 놀라운 후 모든 방향으로 10 초를 움직이기 시작). 최소 거리는 2cm가이 시간 창에서 제어 파리 (THGal4 드라이버를 표현 즉, 1 주 이전 파리, 그림 1의 전설 참조) 올랐다. 따라서, 우리는 다양한 연령과 행동을 개시 한 후 유전자형 10 초를의 파리의 등반 활동을 분석하기위한 참고 자료로 2cm 마크를 사용했습니다. 이러한 매개 변수는 (다른 유전 적 배경 또는 실험실 조건 예 때문에) 테스트 파리의 동작의 차이점을 설명하기 위해 조정이 필요할 수 있습니다. 우리의 분석 조건에서, 모든 유전자형이 테스트는 컨트롤 유전자형의 파리 유사 더 수행 또는 알 수 있습니다.
   2. 열 다섯의 결과의 평균을시험.
   3. 튜브 (= % 등반 활동)에서 파리의 총 수의 백분율로 표현 평균적으로, 반복 수 (N) 각 유전자형 테스트를 독립적 인 동료의 숫자로 주어진다
   4. 시간이 지남에 따라 서로 다른 유전자형 사이의 통계적 유의성을 평가합니다. 이것은, 학생의 t 시험 (두 개의 유전자형을 비교하는 경우) 또는 GraphPad (GraphPad 소프트웨어, Inc.La 졸라 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 Bonferroni 사후 검사 (다중 비교를 수행 할 때) 다음 2 방향 ANOVA 분석을 수행 할 수 있습니다 CA, USA).

주의

우리는 RT에서와 동일한 조명 조건 하에서, 동일한 시간에 모든 분석을 수행 할 수 있습니다. 12 시간 / 다크 라이트 사이클 환경에서 파리를 유지 파리 '전위의 행동에 circadian 리듬의 효과를 통제하는 것이 좋습니다.

2. 티로신 수산화 효소의 면역 형광전체 뇌 마운트의 분석

솔루션 및 버퍼

정착액 솔루션 : 인산 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 (PBS) 완충 식염수

버퍼 세척 : PBS의 0.1 %를 트리톤 X-100

0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.5, 0.15 M NaCl을 0.1 % 트리톤 X-100와 0.5 % BSA : 버퍼를 차단

설치 미디어 : Mowiol-DABCO (할로 E, 레인 디, 항체 - 실험실 설명서, 콜드 스프링 하버 연구소 출판부, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 미국, 10:418 (1988에 설명 된 프로토콜) 참조)

순서

1. 표피 왁스를 제거하기 위해 약 1 분간 70 % 에탄올로 가득 해부 접시에 파리를 넣습니다.
2. 전송 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 또 다른 해부 접시에 날아간다.
3. 뇌를 해부 :
   1. 복부 측면까지 (: 제거 날개와 다리 옵션)와 함께 파리를 놓습니다.
   2. 몸에서 떨어져 머리를 당겨 : 하나를 사용하는 집게의 집합뇌의 손상을 방지하기 위해 눈 아래 표피에 유지하기 위해 신체 다른 하나 만요
   3. 코를 제거합니다.
   4. 코를 제거한 후 열려있는 왼쪽 슬릿의 반대편에 머리 표피에 보유하고 두뇌가 머리 캡슐에서 제거 될 때까지 반대 방향으로 잡아 당깁니다.
   5. 뇌에서 모든 표피를 제거합니다.
   6. 모든 공기 채워진 기관 조직을 제거, 이것은 다음의 부화 단계에서 부동의 두뇌를 방지 할 수 있습니다.
4. P-200 피펫 팁의 끝 떨어져 몇 mm를 잘라 0.1 % 트리톤 X-100/PBS 용액으로 평형
5. 제조 된 P-200 피펫 팁 사용 4 % PFA / PBS의 0.5 ML로 가득 0.5 ML 에펜 도르프 튜브에 두뇌를 전송하고 절개가 완료 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
6. 20 분 동안 RT에서 머리를 고정 : 랙 에펜 도르프 튜브를 넣고 nutator에 선반을 배치하여 부드러운 회전을 적용합니다.
7. 정착액을 제거P-1000 마이크로 피펫을 사용하여, 0.1 % 트리톤 X-100/PBS 0.5 mL를 반전하여 혼합을 추가하고 1 분 동안 품어 보자, 한번만 세척 단계를 반복합니다.
8. 두 번째 세척에서 버퍼를 제거하고, 0.1 % 트리톤 X-100/PBS의 0.5 ML를 추가하고 20 분 동안 RT에서 부화하자,이 단계를 두 번 반복합니다.
9. 세척 버퍼를 제거하고 두뇌 RT에서 1 시간 동안 (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.5, 0.15 M NaCl을 0.1 % 트리톤 X-100와 0.5 % BSA) 차단 버퍼에 품어 보자.
10. 4 두 가지 일 ° C, 부드러운 회전 (단계 2.6. 참조), 차단 솔루션 안티 TH 항체의 1:100 희석 ( "특정 시약의 표"참조) 두뇌를 품어.
11. 단계 2.7을 세척 반복합니다. 2.8 ..
12. 부드러운 회전, 4 ° C에서 이틀 동안, 차 antibodyin 차단 솔루션의 1:200 희석 두뇌 평형.
13. 단계 2.7을 세척 반복합니다. 2.8 ..
14. 그림 2a에 도시 된 바와 같이 장착 슬라이드를 준비
    1. 체크인 yyyy 2 커버 유리 (24 X 60mm, 아니. 1.5)의 설치 미디어의 X 25 μL 상품 가격이 할인되었습니다.
    2. 장소에 설치 매체 슬라이드의 중간에 간격을두고 건조하게 두 개의 덮개 유리 (크기 18 X 18mm, 아니. 2).
    참고.의 공 초점 현미경의 무대에 샘플 홀더를 확인합니다. 당신은 끝 하나 (매니큐어와 테이프 사용)에 22 X 22mm 1.5 커버 유리를 부착하여 커버 유리에게 25 X 75mm 슬라이드의 같은 크기를 만들 수 있습니다.
15. 세척 버퍼를 제거, 설치 미디어의 50 μl를 추가하고 두뇌가 위아래로 pipetting에 의해 그것과 평형 할 수 있습니다.
16. 컷 P-200 피펫 팁 (단계 2.4 참조) 두 coverslips를 사이의 공간에서 슬라이드에 두뇌를 전송하고 아무 coverslip에 그들을 커버를 사용. 1.5 (그림 2A 참조; 방향에 슬라이드 두뇌 ⁷ 참조).
    참고 : 시료는 전방과 포스 모두 시각화 할 수 있도록 두 개의 덮개 유리 사이에 장착되어뇌의 rior 쪽.
17. 모든 공기를 제거 한 구석에서 피펫; 설치 미디어 커버 유리 사이의 전체 공간을 채우기 건조하고 매니큐어와 씰 할 수 있습니다.
18. 공 촛점 현미경을 사용하여 1.0 μm의 스텝 크기 (Drosophila의 성인 뇌의 도파민 클러스터의 해부학 적 식별을위한 ^{7 참조)} Z-축을 따라 광 섹션의 시리즈를 취득 특정 클러스터에있는 도파민 신경 세포의 수를 평가합니다.

우리는 분석이 PD (14)의 초파리 모델에서의 응력 보호 NRF2 통로의 역할을 연구하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 이 모델은 TH GAL4 드라이버 2, 10를 사용하여 DA 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 유전자의 발현에 의존합니다.

그림 1은 TH GAL4 드라이버의 통제하에 서로 다른 형질 전환 유전자를 표현하는 남성 파리의 놀람에 의한 부정 geotaxis (등산) 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 모든 유전자형은 시간이 지남에 따라 전위의 활동의 감소를 나타내고 테스트하지만, PD-링크, 인간 α-synuclein의 유전자가 나이 대조군 파리에 상대적으로 빠른 속도로 하락 (혼자 TH GAL4 드라이버)를 전시 표현 항공사 또는 공동 표현을 날아 NRF2 DNA 바인딩 파트너 MAF-S. 비슷한 결과는 여성 파리에서 관찰되었다.

그림 2는 TH 면역 기반 DA에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다신경 세포가 계산됩니다. 그림 범례에 설명을 4 주 오래 된 남성 파리에서 두뇌에 PPL1 뉴런의 수에 다른 유전 적 배경의 영향은 정량화되어 있습니다. α-synuclein의 표현 파리에서 두뇌에 PPL1 뉴런의 작지만 상당한 손실을 확인할 수 있습니다.

그림 1. 표시된 유전자형의 놀람에 의한 부정 geotaxis 분석. 코호트 연령 일치하는 파리는 한 주 간격으로 전위의 활동을 위해 테스트되었습니다. 등산 활동은 병을 터치 한 후 2cm 마크 10 초 이상 파리의 수를 계산하고 유리 병에 들어있는 파리의 총 수의 백분율로이 값을 표현하여 계산되었다. 데이터의 의미 표시 ± 20 ~ 30 파리의 5 개의 독립적 인 동료의 SEM 사진. 중요성은 Bonferroni 사후 검사 (P <0.05)과 양방향 ANOVA로 평가되었다. 차이TH 사이, α-Synflies 및 테스트 다른 세 가지 유전자형의 파리 4, 5 주에 중요했습니다.

그림 2. TH에 면역하여 DA 뉴런의 검출 및 계산합니다. A. 흐름 다이어그램은 뇌의 슬라이드를 준비하기위한 프로토콜을 설명. 각 단계에 대한 자세한 설명 텍스트를 참조하십시오. 전체 뇌 마운트 (오른쪽 hemibrain, 후방 뷰)의 B. 대표 현미경은 TH에 대한 면역 염색. 공 촛점 Z-시리즈 이미지의 집합 (1,024 X 1,024의 형식 라이카 SP2 공 촛점 현미경, 40X 오일 목적 (N / A 1.25), 프레임 평균 2, 스텝 크기가 1 ㎛와 인수의 최대 투사로 컴파일 )이 표시. PPL1 DA 신경 세포 클러스터의 위치가 강조 표시됩니다. C. 대표 열매는DA 뉴런 LTS는 TH 면역 염색을 사용하여 얻은 계산합니다. PPL1 클러스터에있는 신경 세포의 수는 각 각 공 촛점 Z 시리즈. N의 이미지를 각각의 유전자형을 분석 독립적 인 샘플의 수를 나타냅니다를 검사하여 평가 하였다. 데이터 수단 ± SEM의 의의는 학생의 t 시험 (* P <0.05)으로 평가 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

유전자형 '사기꾼', THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS - 동기 유휴 문자'THGal4, UAS
- αSynuclein / +; THGal4, UAS - αSynuclein / +; 'UAS-MAF-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α 동기 유휴 / UAS-MAF-S', THGal4, UAS - αSynuclein / UASMaf-S, THGal4, UAS - αSynuclein /는 +, 'KEAP1 EY5'THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5, 'UAS-α Syn/keap1 EY5'THGal4, UAS - αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.

[바론 등의 재현. 2011) "질병 모델 및 메커니즘"의 "오픈 액세스"정책에 동의합니다.]

우리는 우리가 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.