Summary
यहाँ हम में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स की उम्र पर निर्भर neurodegeneration के अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है कि दो assays का वर्णन
Abstract
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर तंत्रिका तंत्र में उम्र बढ़ने और रोग अपक्षयी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है. एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में उड़ान भरने का लाभ अपने आनुवंशिक शिक्षणीयता, लघु जीवन काल और निरीक्षण और मात्रात्मक जटिल व्यवहार का विश्लेषण करने की संभावना भी शामिल है. ड्रोसोफिला मस्तिष्क के विशिष्ट neuronal आबादी में बीमारी से जुड़ी जीनों की अभिव्यक्ति, पार्किंसंस और अल्जाइमर के रूप में 5 मानव neurodegenerative रोगों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स उम्र बढ़ने मानव मस्तिष्क में सबसे कमजोर neuronal आबादी के बीच में हैं. पार्किंसंस रोग में (पीडी), सबसे आम neurodegenerative आंदोलन विकार, डीए न्यूरॉन्स के त्वरित नुकसान हरकत समारोह में एक प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय गिरावट की ओर जाता है. उम्र और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के संपर्क के अलावा, महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स की हानि कोडिंग में विशिष्ट परिवर्तन द्वारा exacerbated हैकई जीनों की या प्रमोटर क्षेत्रों. ऐसे पीडी जुड़े alleles की पहचान विवो में डीए न्यूरॉन्स की neurodegeneration के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला के उपयोग के लिए प्रायोगिक आधार प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला डीए न्यूरॉन्स स्मरण दिलाता मानव रोग की कुछ सुविधाओं, डीए न्यूरॉन्स की जैसे प्रगतिशील हानि और गिरावट हरकत समारोह 2 में पीडी से जुड़े मानव α-synuclein जीन की अभिव्यक्ति. तदनुसार, इस मॉडल को सफलतापूर्वक पीडी 8 में संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
पूरे वयस्क मस्तिष्क की डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis प्रतिक्रिया और tyrosine hydroxylase immunostaining के आधार पर एक चढ़ाई परख डीए न्यूरॉन्स की संख्या पर नजर रखने के लिए mounts: यहाँ हम सामान्यतः ड्रोसोफिला में डीए न्यूरॉन्स की उम्र पर निर्भर neurodegeneration के अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि दो assays का वर्णन अलग अलग उम्र में. दोनों ही मामलों में, यूएएस टी के vivo अभिव्यक्ति मेंडीए न्यूरॉन्स में विशेष रूप से ransgenes एक tyrosine hydroxylase (HI) प्रमोटर-Gal4 चालक लाइन 3, 10 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
Introduction
यहाँ वर्णित assays की विशिष्टता डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 3 में विशिष्ट अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए tyrosine hydroxylase जीन की विनियामक दृश्यों कारनामे जो एक Gal4 मक्खी लाइन के उपयोग पर निर्भर करता है. Tyrosine hydroxylase डोपामाइन संश्लेषण में पहला और दर सीमित कदम catalyses. Vivo में डीए न्यूरॉन्स (उदाहरण 6 देखें) की पहचान करने के लिए एक अच्छे उम्मीदवार वें बनाने डोपामाइन की कि, साथ वयस्क मक्खी मस्तिष्क ओव्हरलॅप में वें immunoreactivity. इसके अलावा, THGal4 की अभिव्यक्ति पैटर्न रासायनिक पदार्थ decarboxylase जीन से विनियामक दृश्यों में शामिल है और डीए न्यूरॉन्स में न केवल ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति ड्राइव जो ऐसे DdcGal4 के रूप में अन्य Gal4 लाइनों, की तुलना में अधिक विशिष्ट है, लेकिन यह भी 3 glial कोशिकाओं की serotoninergic न्यूरॉन्स और सबसेट में .
Feany और शराबी (2000) पहली पीडी से जुड़े मानव α-synuclein जीन की अखिल neuronal अभिव्यक्ति स्टेशन के प्रगतिशील हानि accelerates कि मनायाड्रोसोफिला में rtle प्रेरित नकारात्मक geotaxis व्यवहार. हम expressionof एक α-synuclein transgene 10 ड्राइव करने के लिए डीए न्यूरॉन विशिष्ट THGal4 लाइन का उपयोग इसी तरह के परिणाम मनाया और इस में NRF2 मार्ग के neuroprotective भूमिका का अध्ययन करने के लिए यह कार्यात्मक पढ़ने के लिए बाहर का इस्तेमाल किया है पीडी 14 की ड्रोसोफिला मॉडल. यहाँ वर्णित विशिष्ट परख 2 और 3 से अनुकूलित है.
ड्रोसोफिला मस्तिष्क (उदाहरण के 11 और 7 के लिए देखें) confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरे मस्तिष्क आरोह में देखे जा सकते हैं जो कम से कम 5 अलग अलग समूहों में व्यवस्था की 100 से अधिक डीए न्यूरॉन्स, (PPL1, PPL2, पाल, PPM1 / 2, PPM3) शामिल हैं. हालांकि, उम्र पर निर्भर neurodegeneration के पीडी से जुड़े जीन उत्परिवर्तित गया है जहां मक्खियों में मनाया / मानव रोगों मॉडल के overexpressed है, यह उम्र 9, 11 के साथ ड्रोसोफिला मस्तिष्क गिरावट में डीए न्यूरॉन्स की संख्या है या नहीं, अभी भी विवादास्पद है5. डीए न्यूरॉन्स में मानव α-synuclein का अभिव्यक्ति ऐसी एक प्रभाव है और, इसलिए, पीडी के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हम डीए न्यूरॉन्स एक सेल मार्कर के रूप में वें का उपयोग कर माउंट पूरे मस्तिष्क में गिनती के लिए एक परख का वर्णन है. यह परख 13 और 10 से रूपांतरित किया गया है.
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Protocol
1. डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis परख
- वांछित जीनोटाइप की मक्खियों का चयन करें, उन्हें 20-30 पशुओं के साथियों में समूह बेतरतीब ढंग से, लिंग के आधार पर उन्हें अलग और हर 2-3 दिन नए खाद्य शीशियों में उन्हें फ्लिप, परीक्षण मक्खियों के प्रत्येक सेट (यानी उम्र से मिलान साथियों, एक पलटन / जीनोटाइप) एक सप्ताह में एक बार कम से कम.
- नकारात्मक geotaxis परीक्षण से पहले तीस मिनट, सीओ 2 के साथ मक्खियों anesthetize और दो खाली भोजन शीशियों (सामग्री तालिका देखें) (चैम्बर आयाम स्पष्ट टेप के साथ अपने उद्घाटन में शामिल हो गए के साथ किए गए पूर्व लेबल स्पष्ट प्लास्टिक की ट्यूब में उन्हें जगह: 19 सेमी x 2.85 सेमी). हमारे assays में हम आम तौर पर 25 मक्खियों / ट्यूब का उपयोग करें.
नोट. संज्ञाहरण से वसूली समय कई घंटे कुछ मिनट से अलग किया जा सकता है (जैसे हे / एन) और परीक्षण विशिष्ट जीनोटाइप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. - एक ऊर्ध्वाधर surfac पर सोख्ता कागज और टेप कागज के एक टुकड़े पर अलग अलग ऊंचाई (1 से 20 सेमी से) मार्कई, पीठ को सीधा.
- कागज के सामने ट्यूबों रखें: ट्यूबों सभी गठबंधन हो सकता है और के रूप में सही ऊंचाई माप अनुमति देने के लिए कागज के रूप में संभव बंद हो जाना चाहिए.
- एक स्टैंड (एक विंदुक टिप बॉक्स जैसे) पर, कागज से 20-30 सेमी की दूरी पर, ट्यूब के सामने डिजिटल कैमरा ("विशेष उपकरण" टेबल देखें) प्लेस, "फिल्म 'विकल्प का चयन करें और शुरू रिकॉर्डिंग, इस समय आप भी लगातार परीक्षणों के बीच समय का ट्रैक रखने के लिए एक टाइमर शुरू कर देना चाहिए.
- मक्खियों कुछ सेकंड (उदाहरण के लिए 10 सेकंड) के लिए ट्यूब दोहन द्वारा ट्यूब के नीचे एकत्र करने की अनुमति दें. यह कदम पूरे प्रयोग के दौरान (यानी एक ही अवधि, एक ही शक्ति, एक ही ऑपरेटर) लगातार प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- 10 सेकंड के लिए डिजिटल कैमरा के साथ रिकॉर्ड मक्खियों 'आंदोलनों.
- एक मिनट के अंतराल पर कदम 1.5-1.7 चौदह बार दोहराएँ.
- डेटा का विश्लेषण:
- ऊपर हैं कि मक्खियों की संख्या की गणनादर्ज की फिल्मों के दृश्य निरीक्षण से 10 सेकंड के बाद 2 सेमी निशान.
नोट: हमारी परख की स्थिति में मक्खियों 'नकारात्मक geotaxis व्यवहार चौंकाने के बाद पिछले पहले 10 सेकंड से परे नहीं किया है (यानी मक्खियों उन्हें चौंकाने के बाद सभी दिशाओं में 10 सेकंड बढ़ शुरू कर दिया). न्यूनतम दूरी 2 सेमी था इस समय खिड़की में नियंत्रण मक्खियों (THGal4 ड्राइवर व्यक्त यानी 1 सप्ताह पुराने मक्खियों, चित्रा 1 की कथा देखें) द्वारा चढ़ गए. इस प्रकार, हम अलग अलग उम्र और व्यवहार की शुरुआत के बाद जीनोटाइप 10 सेकंड की मक्खियों की चढ़ाई गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए एक संदर्भ के रूप में 2 सेमी निशान का इस्तेमाल किया. इन मानकों (अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि या प्रयोगशाला परिस्थितियों के लिए उदाहरण के लिए कारण) परीक्षण मक्खियों के व्यवहार में अंतर के लिए खाते में एडजस्ट करने की आवश्यकता हो सकती. हमारे परख की स्थिति में, सभी जीनोटाइप परीक्षण नियंत्रण जीनोटाइप की मक्खियों की तरह ही खराब प्रदर्शन किया या उस पर ध्यान दें. - पंद्रह से परिणाम का औसत लोपरीक्षणों.
- ट्यूब (=% चढ़ाई गतिविधि) में मक्खियों की कुल संख्या का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त औसत; दोहराता की संख्या (एन) प्रत्येक जीनोटाइप के लिए परीक्षण स्वतंत्र साथियों की संख्या से दिया जाता है
- समय के साथ अलग जीनोटाइप के बीच सांख्यिकीय महत्व का आकलन करें. यह एक छात्र के टी परीक्षण (दो जीनोटाइप तुलना करते समय) या ऐसे GraphPad (GraphPad सॉफ्टवेयर, Inc.La जोला के रूप में वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग Bonferroni बाद अस्थायी परीक्षण (एकाधिक तुलना की जाती है) के बाद एक 2 तरह से एनोवा विश्लेषण के साथ पूरा किया जा सकता है सीए, संयुक्त राज्य अमरीका).
- ऊपर हैं कि मक्खियों की संख्या की गणनादर्ज की फिल्मों के दृश्य निरीक्षण से 10 सेकंड के बाद 2 सेमी निशान.
नोट
हम आरटी पर और एक ही प्रकाश परिस्थितियों में, दिन के एक ही समय में हमारे सभी assays के प्रदर्शन. एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र वातावरण में मक्खियों को ध्यान में रखते हुए 'मक्खियों हरकत व्यवहार पर circadian लय के प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए सलाह दी जाती है.
2. Tyrosine hydroxylase इम्यूनोफ्लोरेसेंसपूरे मस्तिष्क माउंट की परख
समाधान और buffers
लगानेवाला समाधान: फॉस्फेट में 4% paraformaldehyde (पीएफए) खारा (पीबीएस) buffered
बफर धोने: पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100
0.1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.5, 0.15 एम NaCl, 0.1% ट्राइटन X-100 और 0.5% बीएसए: बफर अवरुद्ध
बढ़ते मीडिया: Mowiol-DABCO (हार्लो ई, लेन डी., एंटीबॉडी एक प्रयोगशाला मैनुअल, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रयोगशालाओं प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका, 10:418 (1988 में वर्णित प्रोटोकॉल देखें))
प्रक्रिया
- छल्ली मोम को दूर करने के बारे में 1 मिनट के लिए 70% EtOH से भरी एक विच्छेदन पकवान में मक्खियों रखो.
- स्थानांतरण ठंडा पीबीएस के साथ भरा एक और विच्छेदन पकवान के लिए मक्खियों.
- मस्तिष्क काटना:
- उदर पक्ष (: हटायें पंख और पैरों वैकल्पिक) के साथ उड़ रखें.
- शरीर से दूर सिर खींचो: एक का उपयोग करने के लिए संदंश का सेटमस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए आंखों के नीचे छल्ली पर पकड़ शरीर और एक दूसरे पर पकड़
- सूंड निकालें.
- सूंड को हटाने के बाद खुला छोड़ दिया भट्ठा के विपरीत दिशा में सिर छल्ली को पकड़ो और मस्तिष्क सिर कैप्सूल से हटा दिया जाता है जब तक विपरीत दिशाओं में खींच.
- दिमाग से सभी छल्ली निकालें.
- सब हवा से भरे सांस की नली ऊतक निकालें, यह निम्न ऊष्मायन चरणों के दौरान फ्लोटिंग से मस्तिष्क को रोकने जाएगा.
- एक पी 200 पिपेट टिप टिप बंद कुछ मिलीमीटर कट और एक 0.1% ट्राइटन X-100/PBS समाधान के साथ इसे संतुलित करना
- तैयार पी 200 विंदुक टिप का उपयोग करना, 4% पीएफए / पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर से भरा एक 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को दिमाग हस्तांतरण और विच्छेदन के पूर्ण होने तक बर्फ पर रहते हैं.
- 20 मिनट के लिए आरटी पर दिमाग फिक्स: एक रैक पर Eppendorf ट्यूब डालने और एक nutator पर रैक रखकर एक सज्जन रोटेशन लागू होते हैं.
- लगानेवाला निकालेंएक पी -1000 सूक्ष्म पिपेट का उपयोग, 0.1% ट्राइटन X-100/PBS के 0.5 मिलीलीटर, उलटा द्वारा मिश्रण जोड़ें और 1 मिनट के लिए सेते चलो, एक बार इस धोने कदम दोहराएँ.
- दूसरे धोने से बफर निकालें, 0.1% ट्राइटन X-100/PBS के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते चलो, यह कदम दो बार दोहराएँ.
- धोने बफर निकालें और दिमाग आरटी पर 1 घंटे के लिए (0.1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.5, 0.15 एम NaCl, 0.1% ट्राइटन X-100 और 0.5% बीएसए) अवरुद्ध बफर में सेते करते हैं.
- 4 में दो दिन, डिग्री सेल्सियस, कोमल रोटेशन के साथ (कदम 2.6. देखें) के लिए, अवरुद्ध समाधान में विरोधी वें एंटीबॉडी का एक 1:100 कमजोर पड़ने ("विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका" देखें) के साथ दिमाग को सेते हैं.
- कदम 2.7 धोने दोहराएँ. और 2.8 ..
- कोमल रोटेशन के साथ, 4 डिग्री सेल्सियस पर, दो दिन के लिए, माध्यमिक antibodyin अवरुद्ध समाधान का एक 1:200 कमजोर पड़ने के साथ दिमाग को संतुलित करना.
- कदम 2.7 धोने दोहराएँ. और 2.8 ..
- चित्रा 2A में सचित्र के रूप में बढ़ते स्लाइड तैयार:
- एकडीडी 2 एक गिलास को कवर (24 x 60 मिमी, नहीं. 1.5) को बढ़ते मीडिया की एक्स 25 μl बूँदें.
- प्लेस बढ़ते मीडिया स्लाइड के बीच में एक खाई जा रही है और सूख जाने पर दो कवर चश्मे (आकार 18 x 18 मिमी, नहीं. 2).
- धोने बफर निकालें, बढ़ते मीडिया के 50 μl जोड़ने और दिमाग नीचे pipetting और ने इसके साथ संतुलित करने की अनुमति देते हैं.
- एक कट पी 200 पिपेट टिप (2.4 कदम देखें) दो coverslips के बीच की जगह में स्लाइड करने के लिए दिमाग के हस्तांतरण और कोई एक coverslip के साथ उन्हें कवर का उपयोग करना. 1.5 (2A चित्रा देखो, पूरबी के लिए स्लाइड पर दिमाग 7 देखें).
नोट: नमूने पूर्वकाल और डाकख़ाने दोनों के दृश्य की अनुमति देने के लिए दो कवर चश्मे के बीच बढ़ रहे हैंमस्तिष्क की rior ओर. - सब हवा निकालने के लिए एक कोने से पिपेट, बढ़ते मीडिया के साथ कवर चश्मे के बीच पूरे स्थान को भरने के शुष्क और नेल पॉलिश के साथ सील करते हैं.
- एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर एक 1.0 माइक्रोन कदम आकार (ड्रोसोफिला वयस्क मस्तिष्क में डोपामिनर्जिक समूहों की शारीरिक पहचान के लिए 7 देखें) के साथ z-अक्ष साथ ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला के अधिग्रहण के एक विशिष्ट समूह में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की संख्या का आकलन करने के लिए.
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Representative Results
हम assays के पीडी 14 की एक ड्रोसोफिला मॉडल में तनाव सुरक्षात्मक NRF2 मार्ग की भूमिका का अध्ययन करने के लिए यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है. यह मॉडल एक वें Gal4 चालक 2, 10 का उपयोग करते हुए डीए न्यूरॉन्स में मानव α-synuclein जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है.
चित्रा 1 वें Gal4 चालक के नियंत्रण के तहत विभिन्न transgenes व्यक्त पुरुष मक्खियों में एक डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis (चढ़ाई) परख के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है. सभी जीनोटाइप समय के साथ हरकत गतिविधि में गिरावट दिखा रहे हैं परीक्षण किया है, लेकिन, पीडी से जुड़े, मानव α-synuclein transgene उम्र मिलान नियंत्रण मक्खियों के सापेक्ष एक त्वरित गिरावट (अकेले वें Gal4 ड्राइवर) प्रदर्शन व्यक्त मक्खियों या सह व्यक्त मक्खियों NRF2 डीएनए बाध्यकारी साथी मैफ एस. इसी तरह के परिणाम मादा मक्खियों में मनाया गया.
चित्रा 2 एक वें immunofluorescence आधारित महंगाई भत्ते के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता हैन्यूरॉन गिनती. आंकड़ा कथा में वर्णित के रूप में 4 सप्ताह पुराने नर मक्खियों से दिमाग में PPL1 न्यूरॉन्स की संख्या पर विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव मात्रा निर्धारित है. Α-synuclein व्यक्त मक्खियों से दिमाग में PPL1 न्यूरॉन्स की छोटी लेकिन महत्वपूर्ण नुकसान की सूचना.
चित्रा 1. संकेत जीनोटाइप का डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis परख. साथियों उम्र से मिलान मक्खियों एक सप्ताह के अंतराल पर हरकत गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया. चढ़ाई गतिविधि शीशी दोहन के बाद 2 सेमी निशान 10 सेकंड से ऊपर मक्खियों की संख्या की गणना और शीशी में निहित मक्खियों की कुल संख्या का एक प्रतिशत के रूप में यह मूल्य व्यक्त द्वारा गणना की गई. डेटा का मतलब दिखाने ± 20-30 मक्खियों के पांच स्वतंत्र साथियों के sem. महत्व Bonferroni बाद अस्थायी परीक्षण (पी <0.05) के साथ एक दो तरह से एनोवा के साथ मूल्यांकन किया गया था. अंतरवें के बीच, α-Synflies और परीक्षण अन्य तीन जीनोटाइप की मक्खियों 4 और 5 सप्ताह में महत्वपूर्ण था.
चित्रा 2. वें immunofluorescence द्वारा डीए न्यूरॉन्स की पहचान और गिनती. ए प्रवाह आरेख मस्तिष्क स्लाइड तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल को दर्शाता हुआ. हर कदम के एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें. एक पूरे मस्तिष्क माउंट (सही hemibrain, पीछे दृश्य) के बी प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ वें लिए immunostained. कोंफोकल Z-श्रृंखला छवियों का एक सेट (एक 1024 x 1024 प्रारूप में एक Leica SP2 के confocal खुर्दबीन, 40X तेल उद्देश्य (एन / ए 1.25), फ्रेम औसत 2, कदम आकार 1 माइक्रोन, साथ हासिल कर लिया और एक अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में संकलित किया गया ) दिखाया. PPL1 डीए न्यूरॉन क्लस्टर की स्थिति पर प्रकाश डाला है. सी. प्रतिनिधि resuडीए न्यूरॉन के लिए लीटर वें immunostaining का उपयोग कर प्राप्त मायने रखता है. PPL1 क्लस्टर में न्यूरॉन्स की संख्या व्यक्तिगत प्रत्येक कोंफोकल Z-श्रृंखला. एन की छवियों प्रत्येक जीनोटाइप के लिए विश्लेषण स्वतंत्र नमूनों की संख्या का प्रतिनिधित्व निरीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था. डाटा साधन हैं ± SEM महत्व छात्र टी परीक्षण (* पी <0.05) के साथ मूल्यांकन किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
जीनोटाइप: 'चोर', THGal4 / +, THGal4 / +, 'यूएएस सिन', THGal4, यूएएस
-ΑSynuclein / +, THGal4, यूएएस αSynuclein / +, 'यूएएस मैफ एस', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +, 'यूएएस α सिन / यूएएस मैफ एस', THGal4, यूएएस αSynuclein / UASMaf-S है; THGal4, यूएएस αSynuclein / +, 'keap1 EY5', THGal4 / +, THGal4/keap1 EY5, 'यूएएस α Syn/keap1 EY5', THGal4, यूएएस αSynuclein / +, टीHGal4, यूएएस -αSynuclein/keap1 EY5.
[Barone एट अल से Reproduced. 2011) "रोग मॉडल और तंत्र" के "ओपन एक्सेस 'की नीति के साथ समझौते में.]
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Discussion
assays के विभिन्न रोग से जुड़े आनुवंशिक पृष्ठभूमि (5 में समीक्षा) में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने में डीए न्यूरॉन्स के रखरखाव में रास्ते या छोटे यौगिकों संकेत, विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान यहाँ वर्णित है.
ड्रोसोफिला की डराना प्रेरित नकारात्मक geotaxis व्यवहार बड़े पैमाने पर विशेष रूप से पीडी से जुड़े म्यूटेशन की उपस्थिति में विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, में डीए न्यूरॉन्स की कार्यक्षमता के लिए पढ़ने के लिए बाहर एक कार्यात्मक रूप में इस्तेमाल किया गया है. विभिन्न अध्ययनों के बीच कुछ विसंगतियों (एक अधिक विस्तृत चर्चा के लिए 12 देखें) मनाया गया है. ये कम से कम प्रत्येक ट्यूब में परीक्षण मक्खियों की संख्या (मक्खियों 'पलटन बनाम एकल मक्खी), सीओ के बाद वसूली के समय 2 की मध्यस्थता संज्ञाहरण और लगातार की संख्या सहित विभिन्न परख सेट अप और शर्तों के हिस्से में जिम्मेदार ठहराया गया है परीक्षण (डी के उदाहरण के रूप में 4 और 11 देखेंfferent परख सेट अप). इसलिए यह इस तरह के मापदंडों के लिए नियंत्रित करने के लिए उचित हो सकता है और यदि आवश्यक हो, विशिष्ट परख आवश्यकताओं के लिए उन्हें अनुकूलित कर सकते हैं.
वें immunostaining / confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा डीए न्यूरॉन्स की मात्रा का ठहराव THGal4 संचालित GFP अभिव्यक्ति और GFP प्रतिदीप्ति / confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा डीए न्यूरॉन्स की पहचान के आधार पर विधि के साथ इस्तेमाल किया गया है. दो तरीकों मामलों के बहुमत में तुलनीय परिणाम दे, यह डीए न्यूरॉन्स की कार्यात्मक राज्य के प्रति संवेदनशील है के रूप में हालांकि, सामान्य रूप में, वें immunostaining तकनीक हमें और अन्य जांचकर्ताओं द्वारा पसंद किया जाता है. एक अधिक विस्तृत तुलना के लिए 11 और 10 देखें. इस परख [एक उदाहरण के रूप में 1 देखें] मक्खी सिर homogenates में डोपामाइन के स्तर को मापने के द्वारा पूरित किया जा सकता है.
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Disclosures
हम कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए तकनीकी सहायता और Gerasimos पी. Sykiotis के लिए, मक्खी शेयरों के लिए क्रिस्टीन Sommers लियो Pallanck धन्यवाद. इस काम एमसीबी को एनआईएच प्रशिक्षण अनुदान T32CA009363 द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
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