Summary
Her beskriver vi to analyser, som er blevet oprettet for at studere aldersafhængig neurodegeneration af dopaminerge (DA) neuroner i
Abstract
Drosophila melanogaster er en værdifuld model organisme for at studere aldring og patologiske degenerative processer i nervesystemet. Fordelene ved fluen som et eksperimentelt system omfatter dens genetiske sporbarhed, kort levetid og mulighed for at observere og kvantitativt analysere komplekse adfærd. Udtrykket for sygdom-bundne gener i specifikke neuronale populationer af Drosophila hjernen, kan bruges til at modellere humane neurodegenerative sygdomme som Parkinsons og Alzheimers 5..
Dopaminerge (DA) neuroner er blandt de mest sårbare neuronale populationer i den aldrende menneskelige hjerne. Ved Parkinsons sygdom (PD), den mest almindelige neurodegenerative bevægelsesforstyrrelser, fremskyndet tab af DA neuroner fører til en progressiv og irreversibel nedgang i lokomotorisk funktion. Ud over alder og udsættelse for miljøgifte, er tab af DA neuroner forværres af specifikke mutationer i kodningeneller promotorområder flere gener. Identifikation af sådanne PD-associerede alleler giver den eksperimentelle grundlag for brug af Drosophila som en model til at studere neurodegeneration af DA-neuroner in vivo. For eksempel. Ekspressionen af PD-bundet human α-synuclein genet i Drosophila DA neuroner rekapitulerer nogle funktioner i den menneskelige sygdomme, fx fremadskridende tab af DA neuroner og faldende bevægeapparatet funktion 2 Følgelig har denne model er blevet anvendt med succes til at identificere potentielle terapeutiske mål i PD 8..
Her beskriver vi to assays, der almindeligvis er blevet anvendt til at studere aldersafhængig neurodegeneration af DA neuroner i Drosophila: en klatring assay baseret på startle-inducerede negativ geotaxis respons og tyrosinhydroxylase immunfarvning af hele den voksne hjerne monteringer at overvåge antallet af DA neuroner på forskellige alderstrin. I begge tilfælde in vivo ekspression af UAS transgenes specifikt i DA neuroner kan opnås ved anvendelse af et tyrosin hydroxylase (TH)-promotor-Gal4 driver linie 3, 10.
Introduction
Specificiteten af assays beskrevet her bygger på anvendelsen af en Gal4 fluelinen som udnytter de regulatoriske sekvenser af tyrosinhydroxylase-genet for at opnå specifik ekspression i dopaminerge neuroner 3. Tyrosinhydroxylase katalyserer den første og hastighedsbegrænsende trin i dopaminsyntese. TH immunreaktivitet i den voksne flyve hjernen overlapper dopamin, hvilket TH en god kandidat til at identificere DA neuroner in vivo (se eksempel 6). Desuden ekspressionsmønsteret af THGal4 er mere specifik end andre Gal4 linjer såsom DdcGal4, som indeholder regulatoriske sekvenser fra dopadecarboxylase genet og driver transgen ekspression ikke kun i DA neuroner, men også i serotonerge neuroner og delsæt af gliaceller 3 .
Feany og Bender (2000) først observeret, at pan-neuronal udtryk for PD-bundet human α-synuclein genet accelererer fremadskridende tab af startle-induceret negative geotaxis adfærd i Drosophila. Vi har observeret lignende resultater ved hjælp af DA-neuron specifik THGal4 linje at drive expressionof en α-synuclein transgen 10 og brugt dette funktionelle udlæsning at studere neuroprotektive rolle Nrf2 vej i denne Drosophila model af PD 14.. Den specifikke assay beskrives her er tilpasset fra 2. og 3..
Drosophila Hjernen indeholder mere end 100 DA neuroner, arrangeret i mindst 5 forskellige klynger (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), der kan visualiseres i hele hjernen mounts ved konfokal mikroskopi (se for eksempel 11 og 7). Det er stadig kontroversielt, hvorvidt antallet af DA neuroner i Drosophila hjernen falder med alderen 9, 11, men er aldersafhængig neurodegeneration observeret i fluer hvor PD-bundne gener er blevet muteret / overudtrykt at modellere menneskelige sygdomme5.. Den ekspression af human α-synuclein i DA neuroner har en sådan virkning, og dermed er blevet brugt som model for PD. Her beskriver vi en analyse for DA neuroner tælle i hele hjernen mounts bruger TH som en celle markør. Denne analyse er blevet tilpasset fra 13 og 10..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Startle-induceret Negativ Geotaxis Assay
- Vælg fluer i den ønskede genotype, adskille dem efter køn, tilfældigt gruppere dem i kohorter af 20-30 dyr og vend dem i nye fødevarer hætteglas hver 2-3 dage, test hvert sæt af fluer (dvs. aldersmatchede kohorter, en kohorte / genotype) mindst en gang om ugen.
- Tredive minutter før den negative geotaxis test, bedøver fluerne med CO 2 og placere dem i præ-mærkede klare plastrør lavet med to tomme fødevarer hætteglas (se Materialer Table) tiltrådte ved deres åbninger med klar tape (kammer dimensioner: 19 cm x 2,85 cm). I vores analyser, vi bruger typisk 25 fluer / rør.
Bemærk. Genetableringstiden fra anæstesi kan varieres fra få minutter til adskillige timer (f.eks O / N) og bør optimeres for den særlige testede genotyper. - Markere forskellige højder (fra 1 til 20 cm) på et stykke trækpapir og tape papir på en lodret overflade, vinkelret på bænken.
- Anbring glassene foran papiret: rørene bør være alle afstemt og så tæt som muligt på papiret til nøjagtig måle højden.
- Anbring digitalkamera (se "Special Equipment" Table) foran rørene, i en afstand af 20-30 cm fra papiret, på et stativ (fx en pipettespids boks), vælg "film" valgmulighed, og start optagelsen på dette tidspunkt bør du også starte en timer til at holde styr på tiden mellem på hinanden følgende forsøg.
- Lad fluerne samles på bunden af glasset ved at banke på glasset for få sekunder (f.eks 10 sek). Dette trin skal udføres konsekvent (dvs. samme varighed, samme styrke, samme operatør) i hele forsøget.
- Optag fluer bevægelser med det digitale kamera til 10 sek.
- Gentag trin 1.5-1.7 fjorten gange på én-minutters intervaller.
- Analysere data:
- Tæl antallet af fluer, der ligger over2 cm mærket efter 10 sek ved visuel inspektion af de optagne film.
Bemærk: I vores assaybetingelserne fluerne 'negative geotaxis adfærd ikke sidste ud over de første 10 sek efter opsigtsvækkende (dvs. fluer begyndte at bevæge sig i alle retninger 10 sek efter overraskende dem). Den mindste afstand besteget af kontrol fluer (dvs. en uge gamle fluer udtrykker THGal4 driver, se legenden figur 1) i denne tid vinduet var 2 cm. Således har vi brugt 2 cm varemærke som en reference for at analysere de klatring aktiviteter af fluer i forskellige aldre og genotyper 10 sek efter indledningen af den opførsel. Disse parametre kan kræve en justering for at tage højde for forskelle i adfærden af de testede fluer (for eksempel på grund af forskellige genetiske baggrunde eller laboratoriebetingelser). Bemærk at vores assaybetingelser testet alle genotyper udføres værre eller lignende til fluerne i kontrolgruppen genotype. - Tag gennemsnittet af resultaterne fra de femtenforsøg.
- Hurtig gennemsnit som en procentdel af det samlede antal fluer i røret (=% klatring aktivitet), antallet af gentagelser (N) er givet ved det antal uafhængige kohorter testet for hver genotype
- Vurdere statistisk signifikans mellem forskellige genotyper over tid. Dette kan opnås med en Students t-test (når man sammenligner to genotyper) eller en 2-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test (ved udførelse multiple sammenligninger) anvendelse af kommercielle software såsom GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).
- Tæl antallet af fluer, der ligger over2 cm mærket efter 10 sek ved visuel inspektion af de optagne film.
Bemærk
Vi udfører alle vores analyser på samme tidspunkt af dagen, ved stuetemperatur og under samme lysforhold. Holde fluer i et 12 timers lys / mørke-cyklus miljø er tilrådeligt at kontrollere for effekten af døgnrytmen på fluer locomotor adfærd.
2.. Tyrosinhydroxylase ImmunofluorescensAssay af hele hjernen Mounts
Løsninger og buffere
Fikseringsopløsning: 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand (PBS)
Vaskebuffer: 0,1% Triton X-100 i PBS
Blokerende buffer: 0,1 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 og 0,5% BSA
Montering medier: Mowiol-Dabco (se protokollen beskrevet i Harlow E Lane D., Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))
Procedure
- Put fluer i en dissektion fad fyldt med 70% EtOH i omkring 1 min for at fjerne neglebånd voks.
- Overførsel flyver til et andet dissektion fad fyldt med iskold PBS.
- Dissekere hjernen:
- Placer flyve med den ventrale side op (ekstraudstyr: Fjern vinger og ben).
- Træk hovedet væk fra kroppen: Brug et sæt af tang tilhold på kroppen og en anden til at holde på neglebånd under øjet at undgå at beskadige hjernen
- Fjern snabel.
- Hold på hovedet neglebånd på modstående sider af slidsen efterladt åbne efter fjernelse proboscis og trække i modsatte retninger, indtil hjernen fjernes fra hovedet kapsel.
- Fjern alle kutikula fra hjernen.
- Fjerne alle luftfyldte trakeal væv, hvilket vil forhindre hjernen i at flyde i de følgende inkubations trin.
- Skær et par millimeter ud spidsen af en P-200 pipettespids og tempereres det med en 0,1% Triton X-100/PBS opløsning
- Det klargjorte P-200 pipettespids, hjernerne overføres til en 0,5 ml Eppendorf-rør fyldt med 0,5 ml 4% PFA / PBS og holde på is indtil dissektion er fuldført.
- Fastgør hjerner ved stuetemperatur i 20 min: anvende en blid rotation ved at sætte Eppendorf-rør på et stativ og placere stativet på en nutator.
- Fjern fiksativved hjælp af en P-1000 micro pipette tilsættes 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, blandes ved at vende og lad inkuberes i 1 min; gentage dette vasketrin gang.
- Fjern buffer fra den anden vask, tilsættes 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS og lad inkuber ved stuetemperatur i 20 min; gentage dette trin to gange.
- Fjern vaskebufferen og lad hjernerne inkuberes i blokerende buffer (0,1 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 og 0,5% BSA) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber hjerner med en 1:100 fortynding af anti-TH-antistof (se "Tabel over specifikke reagenser") i blokerende opløsning, i to dage, ved 4 ° C, med blid rotation (se trin 2.6.).
- Gentag vasketrin 2.7. og 2.8 ..
- Ækvilibrer hjernerne med en 1:200 fortynding af sekundært antibodyin blokerende opløsning, i to dage ved 4 ° C med forsigtig rotation.
- Gentag vasketrin 2.7. og 2.8 ..
- Forbered montering dias som illustreret i figur 2A:
- Add 2 x 25 ul dråber montering medier til et dækglas (24 x 60 mm, no. 1.5).
- Place to dækglas (størrelse 18 x 18 mm, no. 2) på de voksende medier forlader et hul i midten af diaset og lad tørre.
- Fjern vaskepuffer tilsættes 50 ul montering medier og tillade hjerner at ækvilibrere med det ved at pipettere op og ned.
- Brug et snit P-200 pipettespidsen (se trin 2.4) overføre hjerner til objektglasset i rummet mellem de to dækglas og dække dem med et dækglas nej. 1.5 (se figur 2A, at orientere hjerner på diaset se 7).
Bemærk: prøverne er monteret mellem to dækglas for at tillade visualisering af både den forreste og posterior side af hjernen. - Fylde hele rummet mellem dækglasset med monteringstilbehør medierne pipette fra et hjørne for at fjerne al luft, lad tørre og tætning med neglelak.
- Til at vurdere antallet af dopaminerge neuroner i en bestemt klynge erhverve en serie af optiske sektioner langs z-aksen med en 1,0 um trin-størrelse ved hjælp af et konfokalt mikroskop (for anatomiske identifikation af dopaminerge klynger i Drosophila voksne hjerne se 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brugt assayene beskrevet her at undersøge den rolle, stress beskyttende Nrf2 vej i en Drosophila model af PD 14.. Denne model bygger på ekspressionen af det humane α-synuclein genet i DA neuroner ved hjælp af en TH Gal4 driver 2, 10.
Figur 1 viser et repræsentativt resultat af et startle-inducerede negative geotaxis (klatring) assay i mandlige fluer udtrykker forskellige transgener under kontrol af TH Gal4 driveren. Alle genotyper testede udviser en nedgang i bevægelsesaktiviteten over tid, men flyver udtrykker PD-forbundet, human α-synuclein transgen udviser en hurtigere tilbagegang i forhold til samme alderskategori kontrol fluer (TH Gal4 driver alene) eller fluer co-udtrykker Nrf2 DNA bindingspartner Maf-S. Lignende resultater blev observeret hos kvindelige fluer.
Figur 2 illustrerer et repræsentativt resultat for en TH immunfluorescens-baseret DAneuron tælle. Virkningen af forskellige genetiske baggrunde på antallet af PPL1 neuroner i hjerner fra 4 uger gamle mandlige fluer er kvantificeret som beskrevet i figurteksten. Bemærk det lille, men signifikant tab af PPL1 neuroner i hjernen mod fluer udtrykker α-synuclein.
Figur 1. Startle-induceret negativ geotaxis assay. Kohorter af aldersmatchede fluer for de anførte genotyper blev testet for lokomotorisk aktivitet i en uges mellemrum. Klatring aktivitet blev beregnet ved at tælle antallet af fluer over 2 cm mærket 10 sek efter at banke hætteglasset og udtrykke denne værdi som en procentdel af det samlede antal fluer indeholdt i hætteglasset. Data viser betyder ± SEM af fem uafhængige kohorter af 20-30 fluer. Signifikans blev vurderet med en to-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test (P <0,05). Forskellenmellem TH, var α-Synflies og fluer fra de andre tre testede genotyper signifikant på 4 og 5 uger.
Figur 2. Påvisning og optælling af DA neuroner ved TH immunofluorescens. A. Flow diagram, der illustrerer protokollen for at forberede hjernen dias. For en mere detaljeret beskrivelse af hvert trin se teksten. B. Repræsentant mikrograf af en hel hjerne mount (højre hemibrain, posterior view) immunfarvet for TH. Et sæt af konfokal z-serie billeder blev erhvervet med en Leica SP2 konfokal mikroskop 40x olie mål (N / A 1.25), ramme gennemsnitligt 2, trin-størrelse 1 um, i en 1.024 x 1.024 format og opgjort som en maksimal projektion ( vist). Positionen af PPL1 DA neuron klynge er fremhævet. C. Repræsentant results for DA neuron tæller opnået under anvendelse TH immunfarvning. Antallet af neuroner i PPL1 klyngen blev vurderet ved at inspicere de enkelte billeder af hver enkelt konfokal z-serien. N repræsenterer antallet af selvstændige analyserede prøver for hver genotype. Dataene er middel ± SEM Betydning blev vurderet med Students t-test (* P <0,05). Klik her for at se større figur .
Genotyper: 'con', THGal4 / +; THGal4 / + «UAS-Syn ', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / + «UAS-Maf-S ', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +« UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / + «keap1 EY5 'THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5« UAS-α Syn/keap1 EY5' THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.
[Gengivet fra Barone et al. 2011) efter aftale med "Åben adgang" politik "sygdom modeller og mekanismer".]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assayene beskrevet her give en nyttig metode til at undersøge betydningen af specifikke gener, signalveje eller små forbindelser i vedligeholdelse af DA neuroner i aldring samt i forskellige sygdomme forbundne genetiske baggrunde (revideret i 5).
Den startle-induceret negative geotaxis adfærd Drosophila har været flittigt brugt som en funktionel læse-out for funktionaliteten af DA neuroner i forskellige genetiske baggrunde, især i tilstedeværelse af PD-linked mutationer. Visse uoverensstemmelser mellem de forskellige undersøgelser er blevet observeret (se 12 for en mere detaljeret diskussion). Disse er blevet tilskrevet i det mindste delvis til forskellige assay set-ups og betingelser, herunder antallet af fluer afprøvet i hvert rør (single flue versus fluer 'kohorte), tidspunktet for genopretning efter CO 2-medieret anæstesi og antallet af træk forsøg (se 4 og 11 som eksempler på different assay set-ups). Det kunne derfor være tilrådeligt at kontrollere for sådanne parametre, og om nødvendigt optimere dem til analyseinstruktioner krav.
Kvantificering af DA neuroner ved TH immunfarvning / konfokal mikroskopi er blevet brugt i flæng med den metode baseret på THGal4-driven GFP udtryk og identifikation af DA neuroner ved GFP-fluorescens / konfokal mikroskopi. De to metoder giver sammenlignelige resultater i de fleste tilfælde, men i almindelighed er TH immunfarvning teknik foretrækkes af os og andre forskere, da det er følsomt over for den funktionelle tilstand af DA neuroner. For en mere detaljeret sammenligning se 11 og 10.. Denne analyse kunne suppleres ved at måle dopamin niveauer i flyve hoveder homogenater [se 1 som et eksempel].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi erklærer, at vi ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Leo Pallanck for flyve aktier, Christine Sommers for teknisk assistance og Gerasimos P. Sykiotis for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af NIH træning tilskud T32CA009363 til MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
