Summary
Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte genereren
Abstract
Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte S. genereren typhimurium bacteriële kolonies groeien binnen tumoren.
We gegenereerde model xenograft tumoren bij muizen door subcutane injectie van een mens eierstokkanker cellijn, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
We getransformeerde verzwakte stammen van S. typhimurium bacteriën (ELH430: SL1344 PhoPQ-1) met een constitutief tot expressie luciferase (luxCDABE) plasmide voor visualisatie 2. Deze stammen specifiek koloniseren tumoren terwijl hoofdzaak niet-virulent blijven de muis 1.
Zodra meetbare tumoren werden vastgesteld, werden bacteriën intraveneus geïnjecteerd via de staartader met wisselende dosering. Tumor-gelokaliseerde werd bacteriële genexpressie in real tijd in de loop van 60 uur met eenin vivo imaging-systeem (IVIS). Op elk tijdspunt werden tumoren uitgesneden, gehomogeniseerd en uitgeplaat op bacteriële kolonies correlatie met genexpressiedata kwantificeren.
Tezamen zijn deze gegevens levert een kwantitatieve maat van de in vivo expressie en gen dynamiek van bacteriën groeien binnen tumoren.
Introduction
Synthetische biologie is veel vooruitgang geboekt de afgelopen tien jaar en is nu gepositioneerd om belangrijke problemen in de energie en gezondheid beïnvloeden. Echter, heeft uitbreiding in de klinische arena is vertraagd door bezorgdheid over de veiligheid en de afwezigheid van het ontwikkelen van ontwerpcriteria voor in vivo genetische circuits. Versnellen hoge impact medische toepassingen vereisen het gebruik van methoden die rechtstreeks interface met medische infrastructuur, genetische circuits die buiten het gecontroleerde laboratorium omgeving functioneren, en veilig en klinisch-aanvaarde microbiële gastheren.
Een aantal stammen werden onderzocht voor de behandeling van kanker vanwege hun vermogen om bij voorkeur groeien in tumoren. Deze zijn opgenomen C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum en S. typhimurium 3-8. S. typhimurium heeft bijzondere belangstelling opgewekt als ze de veiligheid en tolerantie zijn tentoongesteld in een aantal menselijke klinische proeven 9-12. Deze bacteri een aanvankelijk aangetoond dat anti-tumor effecten via stimulatie van het gastheerimmuunsysteem en uitputting van voedingsstoffen die voor kanker celstofwisseling. Productie van therapeutische lading werd later toegevoegd door genetische modificaties. Hoewel deze studies vormen belangrijke vooruitgang in het gebruik van bacteriën voor tumor therapie, hebben de meerderheid van de bestaande inspanningen zich op hoog niveau expressie die doorgaans resulteert in de levering van hoge doseringen, off-target effecten, en de ontwikkeling van resistentie tegen 13-16 .
Nu, kan synthetische biologie programmeerbare lading productie toevoegen door gebruik te maken van computer-ontworpen genetische circuits die geavanceerde detectie en levering 17-20 kan uitvoeren. Deze circuits worden ontworpen als systemen die tumor-specifieke stimuli en zelfregulering cargo productie nodig zin. Echter, het bestuderen van de functie van deze schakelingen in vivo tot nu toe uitdagend.
ve_content "> Aangezien plasmiden zijn gemeenschappelijk kader voor synthetische circuits beschrijven we een methode om de dynamiek van plasmide-gebaseerde genexpressie karakteriseren in vivo in een muismodel. Deze werkwijzen maken gebruik van time-lapse luminescentie beeldvorming en kwantitatieve meting van biodistributie. Samen deze benaderingen een kader voor het bestuderen plasmide-gebaseerde netwerken in vivo klinische toepassingen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Preparation
- Passage cellijnen met behulp van standaard celkweek technieken. In dit experiment gebruikten we OVCAR-8 cellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Kweek cellen een doel confluentie van 80-100%.
- Incubeer cellen met 5 ml trypsine gedurende 5 min, voeg 5 ml RPMI medium + FBS om trypsine te inactiveren.
- Oogst en tellen cellen op een hemocytometer. Resuspendeer in fenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 x 10 7 cellen / ml, of ongeveer 200 ul per kolf.
- Voeg 15% verminderde groeifactor Matrigel (BD Biosciences) en houd de celsuspensie op ijs tot implantatie.
2. Tumor Implantatie
- Verdoven van 4 weken oude vrouwelijke NCR / nu muizen met 3% isofluraan en wacht ongeveer 5 min tot diepe verdoving zorgen. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen.
- Laad de cellen (100 ul per tumor) in een 1 ml spuit en bevestig een 27 1/ 2 gauge naald.
- Voor elk van de twee bilaterale achterflank injectieplaatsen, til de huid met een tang om een tent te maken en te injecteren cellen aan de basis. Let er niet te diep door te dringen, het produceren van bloed. Gebruik een pincet om voorzichtig spuit te verwijderen zonder spatten.
- Monitor tumorgroei gedurende 10 - 20 dagen totdat een tumor diameter van 2-4 mm wordt bereikt.
3. Bacteriën Voorbereiding
- Start een nachtelijke kweek van bacteriën in 3 ml LB-medium + ampicilline uit een -80 C vriezer voorraad of gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we S. typhimurium stam ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
- In de ochtend, verdunnen de cultuur 1:100 in gefilterd LB en groeien tot OD600 0,4-0,6.
- Spin down en 3 keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer in een uiteindelijke OD600 van 0,1 (ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml).
4. Bacteriën Injectie
- Verdoven van het dier eend positie op zijn kant met de staart wijzend naar uw dominante hand. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen.
- Verwijden de staart ader met behulp van warm water of een warmtelamp.
- Laad de bacteriën (100 pi per muis) in een 1 ml spuit en buig het uiteinde iets minder dan 90 graden.
- Breng de spuit met de staart ader, dringen op een geringe diepte (mag geen weerstand voelen), en injecteer bacteriën. Observeer bloodflow verplaatsing voor een succesvolle injectie.
5. Muis Imaging
- Verdoven van dieren in de inductie kamer plaats dan elke muis op de imaging platform. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Behouden nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen tijdstippen zorgen.
- Afbeelding dieren met behulp van de IVIS Spectrum imaging-systeem (Remklauw Life Sciences). Als de beeldvorming meer dan 1 dier, plaats licht barrières tussen hen om cross-illu voorkomenminatie. Dieren moet eerst worden afgebeeld op de buikzijde naar lokalisatie van bacteriën te bevestigen.
- Afbeelding dieren dorsaal met IVIS elke 2 uur gedurende de duur van het experiment (36 uur). Genereer een tijdsverloop voor een bepaalde ROI.
6. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie
- Euthanaseren dieren met behulp van CO 2 en de plaats op de rug op een absorberende luier.
- Draai het dier de twee achterste flank subcutane tumoren bloot. Snijd de omringende huidweefsel te scheiden en te verwijderen van de tumoren. Houden van de tumor met een pincet, verwijder de huid met behulp van een omgekeerde schaar beweging. Wanneer de meerderheid van de huid is gescheiden, volledig te verwijderen van de tumor met een pincet.
- Plaats de organen in gewogen microcentrifugebuizen. Aangezien de massa van deze buizen aanzienlijk variëren is het belangrijk voor een pre-wegen van kwantitatieve resultaten.
7. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie
- Voor elk tijdstip, accijnzen en wegen van de tumoren.
- Voeg 500 ul PBS + 15% glycerol en homogeniseren met behulp van een Tissue-Tearor (BioSpec). Spoel de homogenisator 3 maal met ethanol tussen de monsters.
- Genereer seriële verdunningen en plaat voor bacteriële kolonie tellen. Tot op het bord meerdere verdunningen op een enkele plaat gebruik pre-coupes platen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol, zijn we in staat om gegevens over de in vivo groei en gen dynamiek expressie van tumor gerichte bacteriën genereren. De algehele werkstroom wordt samengevat in figuur 1.
In de eerste fase, het injecteren we bacteriën (groen) en het dier met behulp van IVIS om genexpressie te meten met luminescentie (blauw) als verslaggever.
Daarna, in de tweede fase, we accijnzen, homogeniseren, en plaat tumoren voor kolonietellingen om het aantal bacteriën groeien in de tumor te bepalen.
Bioluminescentie gegenereerd door bacteriestammen gevisualiseerd middels IVIS (figuur 2). Signaal toeneemt met geïnjecteerde dosering, met een minimum koloniserende dosering ongeveer 5 x 10 5 (Figuur 2A). In alle gevallen, verzwakte bacteriën kunnen alleen hetzij specifiek koloniseren tumoren of niet groeien in de muizen. Signaal wordt gekwantificeerd met behulp van straling eenheden te normaliZE voor de belichtingstijd, waar de typische waarden van 10 ^ 6 of hoger zijn een indicatie van kolonisatie.
Voor een bepaalde infectie, signaal neemt toe met de tijd meer dan 24-48 uur (Figuur 2B). De piek begin ongeveer 36 uur na injectie, maar de timing is afhankelijk van de belasting en plasmide gebruikt. Zorg ervoor dat elke keer om de muis te positioneren precies dezelfde manier om kwantitatieve resultaten te garanderen.
In de volgende reeks experimenten wordt bacteriële biodistrution gekwantificeerd om de groei van bacteriën in de tijd (Figuur 3) te meten. Levensvatbare bacteriën in tumors worden gekwantificeerd door uitsnijden en homogeniseren van het tumor en scheepswand in seriële verdunningen (Figuur 3A). Andere organen kunnen eveneens worden gekwantificeerd. Hier hebben wij de milt, aangezien de verhouding tumor-milt is een typische handeling van bacteriële specificiteit 21, 22.
Deze tellingen kunnen we de bacteriële bevolking te metentie over de tijd (figuur 3B). Aan de linkerkant, kunnen we zien dat het aantal bacteriën gestaag groeien in de tumor tijdens de gehele duur van het experiment, met een verdubbeling van de tijd van 1-3 uur, aanzienlijk langzamer dan in batch cultuur experimenten. Dit verlaagde tarief is waarschijnlijk te wijten aan de slechte nutriënten in de tumor milieu. Aan de rechterkant hebben we verhouding tussen de tumor-milt gekwantificeerd en constateren dat het verhoogt gedurende het experiment. Deze bevinding toont specificiteit, dat de tellingen milt hoofdzaak constant terwijl bacteriën blijven groeien in de tumor.
Figuur 1. Schema van de totale experimentele werkwijze. (A) Bacteriën worden geïnjecteerd aan de staart-ader en specifiek koloniseren tumoren. (B) Op elk tijdstip worden tumoren uitgesneden,gehomogeniseerd en plated voor kolonietellingen. Overgenomen met toestemming 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figuur 2. Whole-dier luminescentie beeldvorming met behulp van IVIS. (A) Signaal neemt toe met de injectie dosering en (b) de tijd. Aangepast met toestemming 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figuur 3. Plating en kolonietellingen aan groeidynamiek te meten. (A) Seriële verdunningen toestaan individuele kolonies te rekenen voor een representatief monster milt (onderste). (B) Door het volgen van deze tellingen kunnen we creëren in vivo maatregelen populatie van bacteriën in de tumoren ( zoals in b </ Strong>) aantal cellen met en zonder plasmide (zoals in c) en de tumor verhouding milt (zoals in d). Aangepast met toestemming 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van deze procedure, zijn we in staat om de tijd cursussen voor de groei en gen dynamiek expressie van bacteriën koloniseren tumoren te genereren. Hoewel deze metingen worden routinematig uitgevoerd in vitro in batch cultuur of microfluïdische apparaten, ze veel moeilijker uit te voeren in vivo.
Er zijn verscheidene modificaties kunnen worden toegepast op deze methoden. Terwijl we de OVCAR-8 cellijn onze muismodellen genereren, kan een aantal andere cellijnen gelijkwaardig worden. Bijvoorbeeld kan luciferized cellijnen worden gebruikt die toelaten voor 3D colocalization tumor en bacteriële luciferase kanalen. Bovendien, terwijl we een bilateraal achterflank model, een verschillend aantal en de plaats van injectie kan worden gebruikt om modellen genereren verschillende fenomenen te bestuderen. Als bijvoorbeeld tumorgrootte een belangrijke variabele, kan seriële verdunningen van cellen bereid en geïnjecteerd op verschillende plaatsen tegelijk genereren smaller-en grotere-en kleinbedrijf tumoren. Tot slot, terwijl we vroeger S. typhimurium stam ELH430, andere stammen van S. typhimurium of andere bacteriën zoals C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum worden equivalente gebruikt bij deze methoden, hoewel de bacterietellingen voor injectie moet worden aangepast.
De meest kritische stappen in dit protocol betrekking hebben op de creatie van de muis kanker model, en de voorbereiding en de injectie van bacteriën. Voor de creatie van de kanker-model, zal de precisie in het aantal cellen en de concentratie, injectie volume, en injectieplaats plaatsing sterk verbeteren van de consistentie van de tumoren gegenereerd. Wij hebben gevonden dat equivalente grootte, vorm en geplaatst tumoren maakt de kwantitatieve vergelijkbare gegevens. Voor de bereiding van bacteriën, is het essentieel om ze volledig wassen voorafgaand aan injectie en controle voor de bacteriën concentratie, volume en zorgvuldig injectieplaats. Deze stappen zijn nodig om avoid overmatige immunologische effect van de injectie en kwantitatieve vergelijking tussen afzonderlijke muismodellen handhaven. Aangezien het aantal bacteriën dat de tumor voeren is een kleine fractie van de toegediende dosis, kan variaties in het aantal bacteriën tussen geïnjecteerde muizen resulteren in dramatische verschillen op kolonie progressie. Voor meer informatie, zie een aantal extra verwijzingen naar bacteriële voorbereiding op kwantitatieve in vivo studies 3, 4,
Hoewel deze technieken zijn zeer aanpasbaar aan diverse specifieke studies, wat beperkingen aanwezig voor uitbreiding tot bepaalde toepassingen. Bijvoorbeeld, kan intraveneuze levering van hoge bacterietellingen niet wenselijk voor bepaalde bacteriën en / of muismodellen door immunologische impact. Een alternatieve wijze van toediening is orale toediening (gavage), een techniek die wordt beschreven op Jupiter 23. Daarnaast kunnen time-lapse imaging nogal arbeidsintensief, afhankelijk van de specific experiment lengte, tijd-resolutie, en apparatuur beschikbaar. Automatiseren van het beeldvormende proces zou veel van deze lasten te verlichten, maar introduceert ook nieuwe technische uitdagingen. Muis vitale zoals hartslag, ademhalingsfrequentie, en temperatuur moeten continu worden bewaakt door extra apparatuur. Bovendien wordt voor langere termijn anesthesie, oogzalven worden gebruikt om voldoende vocht te behouden. Tenslotte moet het niveau van verdoving afgeleverd de muis continu afgesteld op de diepte van de anesthesie te handhaven. Een closed-loop feedback regelsysteem dat de muis vitale metingen integreert met verdoving levering zou dit proces aanzienlijk vergemakkelijken.
Hoewel synthetische biologie veel succes 17, 19, 20, heeft bereikt toepassen gemanipuleerde gen circuits in vivo toepassingen zal kwantitatieve in vivo tijdsverloop ontwerpprincipes kennis. S. typhimurium is een uitstekende rek voor klinisch synthetische biolgie voor kankertherapie omdat het vergelijkbaar E. coli, bijzonder koloniseert tumoren en veilig is gebleken in klinische proeven 6, 12, 14, 22. Daarnaast hebben recente onderzoeken is gebleken dat veel gepubliceerd circuits functioneren in S. typhimurium zonder wijziging 24. Met behulp van de experimenteel platform hier beschreven, hebben we onlangs beschreven hoe dynamisch in vivo expressie profielen kunnen worden geprogrammeerd met de inherente instabiliteit van plasmide vectoren 25. Bovendien heeft recent onderzoek nieuwe methoden stabiel handhaven plasmidevectoren in vivo 23 ontwikkeld.
Terwijl luciferase reporter is een gemeenschappelijk gebruikt voor in vivo beeldvorming voor de gevoeligheid 5, zijn er voorbeelden van uitstekende studies betreffende kwantitatieve in vivo genexpressie met GFP 26. Met behulp van GFP zou de onderzoeker aan de ruimtelijk-temporele dynamiek van individuele bacteriën te bestuderen in vivo.Bovendien, terwijl we gebruik gemaakt van een subcutane model, uitbreiding van deze studies in de richting van meer relevante modellen van kanker zouden hun voorspellende kracht 7 verder te verhogen. Toekomstige studies als deze kan een volgende generatie van in vivo synthetische biologie voor klinische toepassingen mogelijk.
Het ontwikkelen van zowel experimentele als computationele technieken in concert zal cruciaal zijn voor techniek in vivo genetische circuits. Computermodellen kunnen snel sonde systeemparameters om mogelijke uitgangen verkennen, maar nauw verbonden met de experimentele resultaten moet blijven om relevant te blijven. Tot dusver zijn deze resultaten moeilijk kwantitatief te verkrijgen, mede door het ontbreken van voor het bestuderen van genetische circuits in vivo.
Voortbouwend op dit platform, zullen toekomstige toepassingen zijn ontworpen gen circuits die verder uit te breiden het bereik van de dynamiek meningsuiting, sensing tumor-specifieke stimuli en zelfregulerend cargo production indien nodig. Aangezien de complexiteit van deze in vivo circuits toeneemt, de vereisten van kwantitatieve gegevens om tunen zal toenemen. Wij zijn van mening dat de hier beschreven methoden, samen met nieuwe innovaties in de langdurige muis beeldvorming, zal dit proces mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken H. Fleming voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Misrock Postdoctoraal fellowship (TD) en NDSEG graduate fellowship (AP). SNB is een HHMI onderzoeker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
- Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
- Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
- Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
- Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
- Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
- Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
- Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
- Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
- Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
- Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
- Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
- Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
- Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
- Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
- Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J.
- Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
- Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
- Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
- Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
- Prindle, A., et al.
- Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).
