Summary
L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di attenuato
Abstract
L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di S. attenuato typhimurium colonie batteriche che crescono all'interno dei tumori.
Abbiamo generato tumori trapiantati in topi modello per iniezione sottocutanea di una linea cellulare di carcinoma ovarico umano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD).
Abbiamo trasformato ceppi attenuati di S. batteri typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasi costitutivamente espresso (luxCDABE) plasmide per la visualizzazione 2. Questi ceppi specificamente colonizzano tumori rimanendo essenzialmente non virulento al mouse 1.
Una volta tumori misurabili sono stati stabiliti, i batteri sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda con diversi dosaggi. Tumore localizzato, espressione del gene batterico è stata monitorata in tempo reale nel corso di 60 ore utilizzando unnel sistema di imaging in vivo (IVIS). Ad ogni tempo, i tumori sono stati asportati, omogeneizzato, e piastrate per quantificare colonie batteriche per la correlazione con i dati di espressione genica.
Insieme, questi dati produce una misura quantitativa della crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri in crescita all'interno dei tumori.
Introduction
La biologia sintetica è progredita rapidamente nel corso degli ultimi dieci anni ed è ora posizionato a impatto dei problemi importanti nella energia e salute. Tuttavia, l'espansione in ambito clinico è stato rallentato da problemi di sicurezza e l'assenza di sviluppo di criteri di progettazione per circuiti genetici in vivo. Accelerare le applicazioni mediche di grande impatto richiede metodi che si interfacciano direttamente con infrastrutture mediche, circuiti genetici che funzionano al di fuori del setting di laboratorio controllato, e padroni di casa microbici sicuri e clinicamente accettato che utilizza.
Un numero di ceppi sono state studiate per la terapia del cancro a causa della loro capacità di crescere preferenzialmente nei tumori. Questi hanno incluso C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generato particolare interesse come hanno esibito la sicurezza e la tolleranza in un certo numero di prove cliniche umane 9-12. Questi batteriologiche un stati inizialmente mostrati per creare effetti antitumorali attraverso la stimolazione del sistema immunitario dell'ospite e dalla deplezione di sostanze nutritive necessarie per il metabolismo delle cellule del cancro. Produzione di merci terapeutico è stato poi aggiunto attraverso modificazioni genetiche. Mentre questi studi rappresentano importanti progressi nell'uso di batteri per le terapie tumorali, la maggior parte degli sforzi esistenti hanno fatto affidamento su un'espressione di alto livello, che in genere si traduce nella fornitura di alti dosaggi, effetti off-target, e lo sviluppo di resistenza dell'ospite 13-16 .
Ora, la biologia sintetica può aggiungere la produzione del carico programmabile utilizzando circuiti genetici computazionalmente-progettati in grado di eseguire il rilevamento avanzate e di consegna 17-20. Questi circuiti possono essere progettati per agire come sistema di consegna che rilevano gli stimoli tumore-specifici e di auto-regolare la produzione di merci, se necessario. Tuttavia, studiando la funzione di questi circuiti in vivo è stato quindi finora impegnativo.
ve_content "> Dal plasmidi sono il quadro di riferimento comune per i circuiti sintetici, si descrive un metodo per caratterizzare la dinamica di espressione genica plasmide-based in vivo, utilizzando un modello di topo. Questi metodi utilizzano time-lapse luminescenza imaging e misurazione quantitativa di biodistribuzione. Insieme, questi approcci forniscono un quadro per studiare le reti basate plasmide in vivo per applicazioni cliniche.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Linee cellulari passaggio utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. In questo esperimento, abbiamo utilizzato OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD). Coltivare le cellule a un target confluenza di 80 - 100%.
- Incubare le cellule con 5 ml di tripsina per 5 minuti, quindi aggiungere 5 ml di terreno RPMI + FBS per inattivare la tripsina.
- Celle di raccolta e di contare su un emocitometro. Risospendere in rosso fenolo-DMEM privo bersaglio ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule / ml, o circa 200 pl per bombola.
- Aggiungere 15% ridotta del fattore di crescita Matrigel (BD Biosciences) e mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino all'impianto.
2. Impianto del tumore
- Anestetizzare 4 settimane vecchia femmina Ncr / Nu topo, utilizzando 3% isoflurano e attendere circa 5 minuti per garantire l'anestesia profonda. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Caricare le cellule (100 microlitri per tumore) in una siringa da 1 ml e allegare un 27 1/ 2 ago calibro.
- Per ciascuno dei due siti di iniezione fianchi posteriori bilaterali, sollevare delicatamente la pelle con una pinza per fare una tenda e iniettare le cellule alla base. Fare attenzione a non penetrare troppo in profondità, producendo sangue. Utilizzare le pinzette per rimuovere delicatamente la siringa senza spruzzi.
- Monitorare la crescita del tumore al giorno per 10-20 giorni fino a un diametro del tumore di 2 - viene raggiunto da 4 mm.
3. Batteri Preparazione
- Avviare una cultura durante la notte di batteri in 3 ml di LB + ampicillina multimediale da un -80 C magazzino congelatore o piastra refrigerata. In questo esperimento, abbiamo utilizzato S. typhimurium ceppo ELH430 (SL1344 PhoPQ-Aroa-).
- La mattina, diluire la cultura 1:100 in LB filtrata e crescere per OD600 0,4-0,6.
- Spin down e lavare 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) e risospendere ad una finale OD600 di 0,1 (circa 1 x 10 7 cellule / ml).
4. Batteri Iniezione
- Anestetizzare l'animale unposizione d su un lato con la coda rivolta verso la mano dominante. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Dilatare la vena caudale utilizzando acqua calda o una lampada di calore.
- Caricare i batteri (100 microlitri per topo) in una siringa da 1 ml e piegare la punta poco meno di 90 gradi.
- Allineare la punta della siringa con la vena della coda, penetrare a bassa profondità (dovrebbe sentire alcuna resistenza), e iniettare batteri. Osservare lo spostamento flusso sanguigno per una iniezione di successo.
5. Topo Imaging
- Anestetizzare gli animali nella camera di induzione quindi posizionare ogni mouse sulla piattaforma di imaging. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Mantenere il posizionamento preciso per garantire risultati quantitativi tra i punti di tempo.
- Animali immagine utilizzando il sistema di imaging Spectrum IVIS (Caliper Life Sciences). Se l'imaging più di 1 animale, luogo fotocellule tra di loro per evitare cross-illuminazione. Animali dovrebbero essere ripreso prima sul lato ventrale per confermare la localizzazione di batteri.
- Animali Immagine dorsalmente con IVIS ogni 2 ore per la durata dell'esperimento (36 ore). Generare un corso di tempo per un dato ROI.
6. Quantificare Biodistribuzione batterica
- Euthanize animali utilizzando CO 2 e posto sul retro su un pannolino assorbente.
- Girare l'animale per esporre i due tumori posteriori fianco sottocutanei. Tagliare il tessuto della pelle circostante per separare e rimuovere i tumori. Tenendo il tumore con una pinzetta, togliere la pelle con un movimento a forbice rovesciata. Quando la maggior parte della pelle è stata separata, rimuovere completamente il tumore usando pinzette.
- Posizionare gli organi in provette da microcentrifuga pre-pesati. Poiché la massa di questi tubi può variare significativamente è importante per loro pre-pesare per risultati quantitativi.
7. Quantificare Biodistribuzione batterica
- Per ogni punto, accise e pesare i tumori.
- Aggiungere 500 microlitri di PBS + 15% glicerolo e omogeneizzare con un tessuto-Tearor (BioSpec). Sciacquare l'omogeneizzatore 3 volte con etanolo tra i campioni.
- Generare diluizioni seriali e piastra per il conteggio delle colonie batteriche. Per piastra diluizioni multiple su un'unica piastra Usare piatti pre-sezionati.
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Representative Results
Usando questo protocollo, siamo in grado di generare dati sulla crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri mirati tumorali. Il flusso di lavoro generale è riassunto in Figura 1.
Nella prima fase, abbiamo iniettare batteri (verde) e l'immagine dell'animale utilizzando IVIS per misurare l'espressione genica con luminescenza (blu) come reporter.
Poi, nella seconda fase, abbiamo accise, omogeneizzare, e tumori piastra per il conteggio delle colonie a determinare il numero di batteri che crescono nel tumore.
Bioluminescenza generato da ceppi batterici viene visualizzato per mezzo IVIS (Figura 2). Segnale aumenta con dosaggi iniettato, aventi un dosaggio minimo di colonizzazione circa 5 x 10 5 (Figura 2A). In tutti i casi, i batteri attenuati sono solo in grado di colonizzare sia specificamente tumori o non riescono a crescere nei topi. Segnale viene quantificato utilizzando unità di radianza Normalize del tempo di esposizione, dove i valori tipici di 10 ^ 6 o maggiore sono indicativi di colonizzazione.
Per una data infezione, segnale aumenta con il tempo oltre 24-48 (Figura 2B). L'insorgenza di picco è circa 36 ore dopo l'iniezione, ma i tempi possono variare a seconda del ceppo e plasmide utilizzato. Assicurarsi di posizionare il mouse esattamente nello stesso modo ogni volta al fine di garantire risultati quantitativi.
Nella serie successiva di esperimenti, biodistrution batterica è quantificato per misurare la crescita di batteri nel tempo (Figura 3). Batteri vitali nei tumori sono quantificati da asportare e omogeneizzazione del tumore e placcatura a diluizioni seriali (Figura 3A). Altri organi possono essere quantificati in modo simile. Qui, abbiamo utilizzato la milza, poiché il rapporto tumore-milza è una misura tipica di specificità batterica 21, 22.
Questi conteggi ci permettono di misurare la popolazione battericazione nel tempo (Figura 3B). Sulla sinistra, possiamo vedere che il numero di batteri crescere costantemente nel tumore per tutta la durata dell'esperimento, con un tempo di raddoppio di 1-3 hr, sostanzialmente più lento che in esperimenti di coltura batch. L'aliquota ridotta è probabilmente dovuto alle cattive condizioni di nutrienti nell'ambiente tumorale. Sulla destra, abbiamo quantificato il rapporto tumore-milza e osservare che durante tutto l'esperimento aumenta. Questa scoperta dimostra specificità, in quanto i milza conta sono essenzialmente costante mentre i batteri continuano a crescere nel tumore.
Figura 1. Schematica del processo sperimentale globale. (A) I batteri vengono iniettati nella vena della coda, e specificamente colonizzano tumori. (B) In ciascun punto di tempo, i tumori vengono asportati,omogeneizzato, e placcato per la conta delle colonie. Ristampato con il permesso 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figura 2. L'imaging luminescenza intero animale con IVIS. (A) segnale aumenta con il dosaggio di iniezione e (b) il tempo. Adattato su autorizzazione 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figura 3. Placcatura e conta delle colonie per misurare la dinamica di crescita. (A) diluizioni seriali consentono singole colonie da contare per un campione rappresentativo della milza (in basso). (B) Seguendo questi conteggi, possiamo creare in misure di popolazione in vivo di batteri all'interno dei tumori ( come in b </ Strong>) numero di cellule con e senza il plasmide (come in C) e il tumore al rapporto milza (come in d). Adattato su autorizzazione 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
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Discussion
Utilizzando questa procedura, siamo in grado di generare corsi di tempo per la crescita e la dinamica di espressione genica dei batteri colonizzano i tumori. Mentre queste misurazioni sono eseguite di routine in vitro in coltura batch o dispositivi microfluidici, sono molto più difficili da eseguire in vivo.
Ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questi metodi. Mentre abbiamo utilizzato la linea cellulare OVCAR-8 per generare nostri modelli murini, un certo numero di altre linee cellulari possono essere utilizzati in modo equivalente. Ad esempio, le linee cellulari luciferized possono essere utilizzate per consentire di co-localizzazione 3D di canali luciferasi tumorali e batteriche. Inoltre, mentre abbiamo utilizzato un modello bilaterale hind fianco, un diverso numero e posizione dei punti di iniezione possono essere utilizzati per generare modelli per studiare fenomeni differenti. Ad esempio, se la dimensione del tumore è una variabile importante, diluizioni seriali di cellule possono essere preparate e iniettate a siti diversi contemporaneamente, generando Smaller-e tumori di maggiori dimensioni. Infine, mentre abbiamo utilizzato S. typhimurium ceppo ELH430, altri ceppi di S. typhimurium o altri batteri come C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum può essere usato in modo equivalente con questi metodi, anche se la conta batterica per l'iniezione può essere necessario un aggiustamento.
I passi più critici in questo protocollo implicano la creazione del modello di cancro mouse, e la preparazione e l'iniezione di batteri. Per la creazione del modello di cancro, precisione nel conteggio delle cellule e concentrazione, volume di iniezione, e il posizionamento sito di iniezione permetterà di migliorare notevolmente la coerenza dei tumori generati. Abbiamo trovato che i tumori di dimensione equivalente, sagomato, e collocato creano i dati più quantitativamente comparabili. Per la preparazione di batteri, è critico per lavare completamente loro prima dell'iniezione e per controllare la concentrazione di batteri, di volume, e il sito di iniezione con attenzione. Questi passi sono necessari per avoid eccessivo impatto immunologica di iniezione, e di mantenere confronto quantitativo tra modelli separati mouse. Poiché il numero di batteri che entrano nel tumore è una piccola frazione della dose iniettata, variazioni nel numero di batteri iniettati tra topo possono verificare differenze drammatiche sulla progressione colonia. Per ulteriori informazioni, vedere diversi riferimenti aggiuntivi sulla preparazione batterica quantitativa per studi in vivo 3, 4,
Mentre queste tecniche sono altamente adattabile ad una varietà di studi specifici, esistono alcune limitazioni per estendere a determinate applicazioni. Per esempio, la somministrazione endovenosa di alte conta batterica può non essere desiderabile per alcuni batteri e / o modelli murini per le impatto immunologica. Un percorso alternativo di somministrazione è la consegna orale (gavage), una tecnica che viene descritto a JoVE 23. Inoltre, time-lapse imaging può essere molto alta intensità di lavoro in base alla specific lunghezza esperimento, risoluzione temporale, e le attrezzature a disposizione. Automatizzare il processo di imaging sarebbe alleviare molti di questi oneri, ma introduce anche nuove sfide tecniche. Vitali del mouse come la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e la temperatura devono essere continuamente sorvegliate da apparecchiature aggiuntive. Inoltre, per l'anestesia a più lungo termine, unguenti per gli occhi devono essere utilizzati per mantenere un'adeguata umidità. Infine, il livello di anestetico consegnato al mouse deve essere continuamente regolata per mantenere la corretta profondità dell'anestesia. Un sistema di controllo di retroazione a circuito chiuso che integra le misure vitali del mouse con la consegna anestetico potrebbe facilitare notevolmente questo processo.
Mentre la biologia sintetica ha ottenuto molto successo 17, 19, 20, l'applicazione di circuiti genici ingegnerizzati per applicazioni in vivo richiede quantitativa, in corsi a tempo vivo di informare i principi di progettazione. S. typhimurium è un eccellente tiro per biol sintetico clinicalogia per la terapia del cancro poiché è simile a E. coli, colonizza specificamente tumori, ed è stato dimostrato sicuro in studi clinici umani 6, 12, 14, 22. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che molti circuiti pubblicati funzionano in S. typhimurium senza modifiche 24. Utilizzando la piattaforma sperimentale qui descritto, abbiamo recentemente descritto come dinamica in profili di espressione in vivo può essere programmato utilizzando l'instabilità intrinseca di vettori plasmidici 25. Inoltre, una recente ricerca ha messo a punto nuovi metodi per mantenere stabilmente vettori plasmidici in vivo 23.
Mentre luciferasi è un giornalista comune utilizzato per l'imaging in vivo per la sua sensibilità 5, ci sono esempi di eccellenti studi sulla quantitativa di espressione genica in vivo utilizzando GFP 26. Utilizzando GFP permetterebbe al ricercatore di studiare le dinamiche spazio-temporali dei singoli batteri in vivo.Inoltre, mentre abbiamo utilizzato un modello per via sottocutanea, estendendo questi studi verso modelli più importanti di cancro aumenterebbero ulteriormente il loro potere predittivo 7. Studi futuri come questo possono consentire una nuova generazione di in biologia sintetica in vivo per applicazioni cliniche.
Lo sviluppo di entrambe le tecniche sperimentali e computazionali in concerto sarà fondamentale per l'ingegneria in circuiti genetici in vivo. Modellazione computazionale può sondare rapidamente i parametri di sistema per esplorare potenziali uscite ma deve restare strettamente legata ai risultati sperimentali per rimanere rilevante. Finora, questi risultati sono stati difficili da ottenere quantitativamente, in parte a causa della mancanza di metodi per studiare circuiti genetici in vivo.
Sulla base di questa piattaforma, le applicazioni future includeranno circuiti genici ingegnerizzati che ampliano ulteriormente la gamma di dinamiche di espressione, di rilevazione stimoli tumore-specifici e di auto-regolazione del carico di prodottiiOn, se necessario. Come la raffinatezza di questi in circuiti aumenta in vivo, i requisiti in materia di dati quantitativi necessari per accordare loro anche aumentare. Noi crediamo che i metodi qui descritti, insieme con le nuove innovazioni nel campo dell'imaging topo lungo termine, renderà possibile questo processo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo H. Fleming per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato Misrock (TD) e NDSEG Graduate Fellowship (AP). BNS è un investigatore HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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