Summary
Biokemisk tillvägagångssätt beskrivs för att identifiera in vivo-protein-proteininteraktioner (PPI) av membranproteiner. Metoden kombinerar proteintvärbindning, affinitetsrening och masspektrometri, och kan anpassas till nästan vilken celltyp eller organism. Med detta synsätt blir ännu identifiering av övergående PPI möjligt.
Abstract
Membranproteiner är viktiga för cellernas livskraft och är därför viktiga terapeutiska mål 1-3. Eftersom de fungerar i komplex 4, metoder för att identifiera och karaktärisera deras interaktioner är nödvändiga 5. Därför utvecklade vi den Membrane Strep-proteininteraktion experiment kallat Membran-SPINE 6. Denna teknik kombinerar in vivo tvärbindning med den reversibla tvärbindnings formaldehyd med affinitetsrening av en Strep-märkta membranbetesprotein. Under förfarandet tvärbundna bytesproteinerna är samrenades med membranet betesprotein och därefter separeras genom kokning. Därför kan två stora uppgifter att utföras vid analys av protein-proteininteraktioner (PPI) för membranproteiner med hjälp av Membran-SPINE: först, bekräftelse av en föreslagen interaktionspartner genom immun, och andra, att identifiera nya interaktionspartners genom masspektrometrianalys . Även low samhörighet, övergående protonpumpshämmare kan detekteras med denna teknik. Slutligen är Membran-SPINE kan anpassas till nästan alla celltyper, vilket gör det tillämpas som ett kraftfullt verktyg för screening för att identifiera PPI av membranproteiner.
Introduction
För att förstå funktionen hos ett protein är det viktigt att känna till dess interaktionspartners. Flera klassiska tekniker finns tillgängliga för identifieringen av interaktionspartner av lösliga proteiner. Dessa tekniker är emellertid inte lätt överföras till membranproteiner på grund av deras hydrofoba natur 4. För att övervinna denna begränsning, har vi utvecklat Membrane Strep-proteininteraktion experiment (Membran-SPINE) 6. Den är baserad på ryggraden metod, som var endast lämplig för lösliga proteiner 7.
Membran-ryggen fördelar från två fördelar med tvärbindningsmedlet formaldehyd: för det första kan formaldehyd lätt penetrera membraner och alstrar en exakt bild av den interactome hos en levande cell 8 därför. För det andra, kan formaldehyd tvärbindningar vändas genom kokning 9. Här är dessa två fördelar för att identifiera inte bara permanenta utan även övergående producentprisindex för membran proteins 6.
I korthet är en Strep-markör fuserad till C-terminalen av den integralt membranbetesprotein. Celler som uttrycker membranbetesprotein inkuberas med formaldehyd som tvärbindningar bytesproteinerna till membranet betesprotein (figur 1). Behövs inte Modifieringar av bytesproteinerna. Därefter är det membranfraktionen förberedd. Därför är membranproteiner solubiliseras genom detergentbehandling och agn proteiner är samrenades med sitt byte proteiner med användning av affinitetsrening. Därefter tvärbinda omkastas genom kokning och betet och dess sam-eluerade bytesproteinerna separeras genom SDS-PAGE. Slutligen kan bytesproteinerna identifieras genom immunoblot-analys eller mass-spektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detaljerad information om buffertar i protokollet finns i tabell 1.
1. Fixering av protein-proteininteraktioner genom Formaldehyd Tvärbindning i levande celler
- Till att börja förbereda tillväxtmedier, lagerlösningar och buffert P1
- Bered 500 ml medium: Mediet bör ge förutsättningar som stödjer interaktionen mellan membranbetesprotein och bytesproteiner. Dessutom bör ett experiment utföras under betingelser där ingen interaktion förväntas (t.ex. utan tvärbindning).
OBS: Vi jämför protein-proteininteraktioner i stressade och icke stressade bakterier. Därför förbereder vi 500 ml Luria Bertani (LB) medium (tabell 1) som vi kompletterar med en stressframkallande medel (t.ex. 0,5 M NaCl) i en 2 L Erlenmeyerkolv. För kontroll, använder vi normalt LB-medium med 0,17 M NaCl (pH 7,0). - Förbered Tris-buffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) och 0,1 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA), pH 8,0 stamlösning (Tabell 1).
- Förbered buffert P1. Lös sackaros till en slutlig koncentration av 0,5 M i Tris-buffert. Sterilisera buffert P1 genom filtrering och förvaras vid 4 ° C.
- Bered 500 ml medium: Mediet bör ge förutsättningar som stödjer interaktionen mellan membranbetesprotein och bytesproteiner. Dessutom bör ett experiment utföras under betingelser där ingen interaktion förväntas (t.ex. utan tvärbindning).
- Odla celler som uttrycker membranbetesprotein med en C-terminal Strep-tag fusion från en vektor. Inducera uttryck av membranbetesproteiner under en tillräcklig tid.
Observera: Vi inducera uttryck av bakteriella membran betesproteiner vid tidig log-fas (A 600 = 0,3) genom tillsats av 250 | il 1 M isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) till 500 ml medium (slutkoncentration: 0,5 mM) . För att ge tillräcklig uttryck, vi inkubera bakterierna fram till slutet av log-fasen (A 600 = 1,2). - Förbered för varje kultur två centrifugbägare med en minimivolym på 300 ml vardera och placera dem på is.
- Utför formaldehyd tvärbindning.
CAUTION: Formaldehyd är mycket giftigt Vi rekommenderar att arbeta under ett säkerhets dragskåp..- Överför odlingskärl under en säkerhets dragskåp. Dela upp varje prov i två prover, ett utelämnande av tvärbindning (- X) och en bland annat formaldehyd tvärbindning (+ X). Lägg 4 ml 37% formaldehydlösning till 250 ml odling för att nå en slutlig koncentration av 0,6%.
- Överför odlingskärl tillbaka och odla cellerna under ytterligare 20 min såsom tidigare.
- Fyll dina kulturer i centrifugrören enligt en säkerhets dragskåp. Samla cellerna genom centrifugering vid 3000 x g under 30 min.
- Kassera supernatanten genom att försiktigt pipettera upp det i en säkerhets dragskåp. Samla giftiga formaldehyd-innehållande supernatanten och kassera den på rätt sätt.
- För att nå optimal avkastning under membranproteinpreparat, förbereder sfäroplaster först. Här ger vi ett protokoll för sferoplast bildandet av gramnegativa bakterier:
- Förberedere buffert P2 (tabell 1) från lyofiliserat pulver. Upplösa försiktigt 2 mg lysozym i 0,1 M EDTA, pH 8, i ett 1,5 ml rör. Alltid förbereda buffert P2 nyligen för dagen för experimentet.
- Förbered Tris-buffert med proteashämmare (buffert P3). Till 10 ml av Tris-buffert, tillsätt 0,1 ml 1 M fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (tabell 1) till en slutlig koncentration av 10 mM. Använd bufferten omedelbart, för att säkerställa korrekt funktion PMSF som proteashämmare.
- Återsuspendera cellpelletarna i 10 ml Tris-buffert med proteashämmare och överföra lösningen till ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml buffert P2 och inkubera på is under 30 min.
- Samla sfäroplasterna genom centrifugering vid 3000 x g under 30 min och kassera supernatanten försiktigt.
- Inkubera sferoplast pellets natten vid -20 ° C.
2. Rening av Strep-Tag Membrane Protein (bete)
- Placera sferoplast pellets på is. </ Li>
- Under den tid de sferoplast pellets töa på is, förbereda 10 ml buffert P3 för varje sferoplast beredning. Försiktigt lösa upp 1 mg DNasI i 10 ml Tris-buffert. Lägg till 0,1 ml 1 M PMSF strax före användning.
- Suspendera pelleten i 6 ml nyberedd P3. Sonikera provet fyra gånger under 1 min kontinuerligt på is med 1 min paus mellan varje skur, för att störa sfäroplaster.
- Centrifugera provet vid 10000 x g under 10 min för att skörda cellrester. Överför supernatanten med en pipett till ett ultracentrifugrör.
- Pellemembranfraktionen vid 100.000 x g under 30 min. Tvätta pelleten försiktigt i Tris-buffert utan att lösa upp den. Torka det rör med en pappersnäsduk (t.ex. Kleenex). Undvik att störa pelleten när som helst.
- Resuspendera pelleten (= membran) försiktigt i 1 ml Tris-buffert. Använd en 20 pl alikvot för att bestämma proteinkoncentrationen genom t.ex. BCA-analys. Vid detta steg kan membranen vara chock frysas i liquid kväve och lagrades vid -80 ° C.
3. Rening av Strep-Tag Membrane betesprotein och SDS-PAGE
- Normalisera proteinkoncentration av membranfraktionen till 5 mg / ml med Tris-buffert. Ta 2,5 ml membranfraktion (5 mg / ml) i en ultracentrifug rör och tillsätt 0,25 ml 20% Triton X-100 för att nå en slutlig koncentration av 2%, för att solubilisera membranproteiner. Lägg till en mikro-magnetstav och rör på is under en timme.
Anmärkning: Även om vi i allmänhet har goda resultat med användning av Triton X-100 som detergent, kan det vara lämpligt att ändra tvättmedel för optimering. I detta avseende har vi bästa resultat med de rengöringsmedel som används för funktionell rening av respektive membran betesprotein. - Medan du utför steg 3.1, förbereda 50 ml buffert W och 5 ml buffert E från (tabell 1). Fyll på 10 ml 5x buffert W koncentratet till 50 ml och tillsätt 150 | il 20% Triton X-100.
- Fyll 1 ml 5x buffer E-koncentrat till 10 ml och tillsätt 30 | il 20% Triton X-100. Jämvikta en 1 ml Strep-Tactin superflow självfall kolonn med 8 ml buffert W.
OBS: Det är viktigt att lägga detergenten används för solubilisering i en koncentration 10-faldigt över den kritiska micellkoncentrationen (CMC) i varje buffert under reningsförfarandet.
- Fyll 1 ml 5x buffer E-koncentrat till 10 ml och tillsätt 30 | il 20% Triton X-100. Jämvikta en 1 ml Strep-Tactin superflow självfall kolonn med 8 ml buffert W.
- Avlägsna mikromagnetstav från provet solubilisering och ultracentrifug vid 100.000 x g under 30 min, för att pelletera olösliga membranfraktionen. Avlägsna supernatanten med en pipett för ytterligare rening.
- Fyll på supernatanten till kolonnen. Kör kolonnen endast med tyngdkraftsflöde. Tvätta kolonnen med 5 ml buffert W. Upprepa tvättsteg 5x.
- Eluera membranbetesproteiner med 1 ml buffert E. Upprepa elueringssteg 4x.
- Koncentrera elueringsfraktionerna 2, 3, och 4 till 300 pl med en centrifugal-filterenheten.
- Blanda 200 l av varje prov med 50 ^ 5x SDS-PAGE loading dye. Dela varje preparat i 125 l alikvoter. Koka en portion av varje preparat under 20 minuter vid 95 ° C, för att vända formaldehyd bindningar. Låt proverna svalna till rumstemperatur under minst 10 min på bänk.
- Belastning 30 jil från varje prov i ett enda körfält av en polyakrylamid-gel lämplig för immunoblotting. Använd en förfärgade molekylviktsmarkör för bästa orientering och köra SDS-PAGE 10.
4. Immunoblot analys för att bekräfta Interaktionspartners
- När steg 3.8 är klar, överföra proteiner till en nitrocellulosamembran genom t.ex. halvtorra.
- Blockera membranet för att förhindra ospecifik märkning. Förbered blockerande buffert genom vägning av bovint serumalbumin (BSA) för att uppnå 3% vikt per volym i Tris-buffrad saltlösning kompletterad med slutlig koncentration av 0,05% Tween-20 (TBS-T). Använd en tillräcklig volym av blockerande buffert för att täcka membranet. Blockera membranet under 1 h vid RT.
- Späd ennd inkubera bytet proteinspecifika första antikropp som vanligt. Använd en HRP-kopplad antikropp som den andra antikroppen.
- Utveckla immunoblot med användning av en kemiluminiscerande detektionskit med hög känslighet. Övervaka signalen med hjälp av en klassisk förfarande film bearbetning eller digital bildutrustning.
5. NanoLC-ESI-MS/MS Högupplösta Experiment för att identifiera Interaktions Partners
- Om ingen specifik antikropp är tillgänglig för bytesprotein eller okända interaktionspartner identifieras, använder masspektrometri (MS) för identifiering. För att förhindra keratin föroreningar, använda precasted geler för proteinseparation.
- Silverfärgning SDS-PAGE med användning av en MS-kompatibel färgningskit enligt tillverkarens protokoll. Utför alla färgning och tvättsteg i glasbehållare.
- Punkt respektive band och analysera dessa genom hög upplösning LC / MS 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran SPINE analys möjliggör samtidig rening av membranproteiner och transient samverkande proteinpartner. Samtidig rening uppnås genom att använda tvärbindningsmedlet formaldehyd. Två parametrar är avgörande för att förhindra ospecifika tvärbindningar: formaldehydkoncentrationen och den tvärbindningen tid. Det är tillräckligt, men inte överdriven användning av formaldehyd kan enkelt styras genom immunoblotting. Formaldehyd tvärbundna protein-komplex kan separeras genom kokning men ej med hjälp av SDS-behandling. Därför kan de visualiseras efter blottning av Strep-tagged membranet betesprotein som utstryk i den övre sektionen av den immun-blot av en okokt prov.
Ett representativt resultat av ett membran SPINE assay, inklusive alla nödvändiga manöverorganen, presenteras i figur 2. Som bete protein gralmembranprotein CpxA av Escherichia coli användes 6,11. CpxA är en sensor kinas och består av enN-terminal-sensor domän med två transmembrandomäner (TMD) integrering av ett stort extracytoplasmic sensor domän och en C-terminal högkonserverad cytoplasmatisk katalytiska domänen 12. Efter stimulering, CpxA aktiverar dess besläktade gensvar regulator CpxR. Aktiverad CpxR diffunderar bort att medla svaret. For Membrane SPINE ades Strep-markör fuserad till C-terminalen av CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep tvärbunden till andra proteiner eller proteinkomplex detekteras såsom ett utstryk i unboiled formaldehydbehandlat prov (fig 2, rad 1 kontra linje 3), vilket indikerar tillräcklig tvärbindning. Dessutom är en direkt protein-proteininteraktion av CpxA-Strep med dess besläktade svarsregulatorprotein CpxR som bytet proteinet endast detekteras i närvaro av formaldehyd (Figur 2, rad 2 kontra rad 4) stödja specificitet formaldehyd tvärbindning.
Ett representativt resultat av ett membran SPINE analys presenteras in Fig. 3. Prover som motsvarar de i fig 2 silverfärgades. Pilen markerar ett band som är specifikt för det kokta provet. På grund av den bakgrunden, MS-analys identifierade också andra proteiner förutom CpxR 6. Därför bör den icke-formaldehydbehandlade provet alltid skall analyseras, för att tilldela bakgrundsbrus och specifik interaktion partner.
Tabell 1: Buffertar och reagens som krävs för membran ryggraden.
| Buffert / Reagens / Medium | Arbets koncentration | kommentar | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g trypton 5 g jästextrakt 10 g NaCl till 1 L, justera pH till 7,0 | Luria-Broth-medium | |
| IPTG | 1 M Isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid | 0,5 mM | |
| Tris-buffert | 20 mM Tris-HCl, pH 8 | Justera pH till 8,0 med användning av NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0,1 M EDTA | Justera pH till 8,0 med användning av NaOH | |
| PMSF | 1 M fenylmetylsulfonylfluorid i 100% isopropanol | 10 mM | PMSF är stabil i 100% isopropanol, men inte i vatten! Aktie lösning kan förvaras vid -20 ° C, PMSF måste anpassas till rumstemperatur innan spädning i buffert, PMSF innehåller buffertar ska användas inom 10 minuter efter framställningen. |
| P1 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M sackaros | ||
| P2 | 2 mg / ml lysozym i 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM PMSF | Använd omedelbartbart efter beredning | |
| Tvättmedel | 20% Triton X-100 | 2% för solubilisering | |
| Buffert W | Fyll upp 10 ml 5x koncentrat till 50 ml lägga till 150 | il 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA, 0,06% Triton X-100 | 5x koncentrat är en del av Strep-tagg proteinrening buffert set (IBA) |
| Buffert E | Fyll 1 ml 5x koncentrat till 10 ml lägga till 30 ^ il 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 2,5 mM detiobiotin 0,06% Triton X-100 | 5x koncentrat är en del av Strep-tagg proteinrening buffert set (IBA) |
| 5x SDS-PAGE loading dye | 0,3125 M Tris-HCl, pH 6,8 10% SDS 0,5 M DTT 50% glycerol |
Figur 1. Flödesschema av membranet-ryggen förfarande med användning av en Escherichia coli-membranprotein som bete protein. A) bakterier som uttrycker Strep-inmärkt membranet betesprotein behandlas med formaldehyd. Formaldehyd penetrerar membran och tvärbindningar offer proteiner till membranbetesproteinet. B) Membranfraktionen är beredd och membranproteiner löses genom detergentbehandling. Därefter bytesproteinerna är samrenades med betet protein. C) Formaldehyd tvärbindningar återförs genom kokning och proteiner separerades genom SDS-PAGE. Slutligen är bytes proteiner antingen övervakas av immunoblotting (D) eller identifieras av MS-analys (E). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Representativa immunoblot används för att övervaka en PPI av ett membranprotein. Bakterier som producerar CpxA-Strep från en plasmid som membran betesprotein, odlades i LB-medium till ett OD 600 av en och exponerades för formaldehyd (CH2O) under 20 min. Den inre membranfraktion framställdes, membranproteiner solubiliserades genom detergentbehandling och CpxA-Strep renades (spår 1 och 2). Bakterier som producerar antingen CpxA-Strep utan formaldehydbehandling (spår 3 och 4) eller bär den tomma vektorn med formaldehydbehandling (banorna 5 och 5) tjänade som kontroller. Alikvoter av varje prov kokades vid 95 ° C under 20 min(spår 2, 4 och 6) för att separera tvärbundna proteiner från CpxA-Strep. Proteiner separerades på en 12,5% SDS-PAGE. Immunblotting utfördes och blotting separerades enligt storlek CpxA-Strep (51 kDa) och de respektive bytesproteinerna CpxR (26 kDa). De två delarna av immunoblot inkuberades med polyklonala antikroppar som tagits fram mot CpxA och CpxR, respektive. Därefter överfördes blottar ytterligare behandlas med ett anti-kanin-häst (HRP)-antikropp och utvecklades med användning av Supersignal West Pico Chemiluminescent substrat. Den pilspets markerar nedbrytningsprodukter av CpxA. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Representative silverfärgad SDS-PAGE användes för identifiering av en i:nteraction partnern av ett membranprotein av MS-analys. Prover som motsvarar de i fig 2 var silverfärgades. Pilen markerar ett band, som analyserades med MS-analys och som bekräftade CpxR som interaktionen partner CpxA 5. Lane 7 visar renade CpxR-His 6 och körfält 8 visar renade CpxA-Hans 6-proteinet. Klicka här för större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran SPINE Analys är en biokemisk metod som gör det möjligt att bekräfta och fastställa till denna punkt okända interaktionspartner för membranproteiner. Membran SPINE kombinerar in vivo tvärbindning av formaldehyd med rening av en Strep-märkta membranbetesprotein. Kombinationen med immunoblotting underlättar bekräftelse av förutsagda interaktionspartner (Figur 2). Dessutom kan kombinationen med MS-analys möjliggör identifiering av okända interaktionspartner (Figur 3). För båda ansökningarna, det finns inget krav på att ändra ditt byte protein. Dessutom är Membrane SPINE tillräckligt känsligt för att medge detektion av endogena bytesproteinerna 6.
Här presenterar vi ett protokoll optimerat för membranproteiner från gram-negativa bakterier. Anslaget på gramnegativa bakterier separerar cytoplasman från omgivningen och besitter, förutom dencytoplasmiska membranet, ett yttre membran och en murein säcken. Därför innehåller vår protokoll avlägsnande av det yttre membranet och den murein säcken, vilket resulterar i så kallade sfäroplaster. Eftersom sådana protokoll finns tillgängliga för de flesta celltyper, bör våra protokoll kunna anpassas för de flesta membranproteiner. Dessutom bör följande punkter beaktas.
Först av allt, det antal kopior av vektorn som används för att överproducera membranbetesproteinet måste balanseras mellan en hög nivå för att ge tillräcklig membranproteinrening och en låg nivå för att förhindra ospecifika interaktioner
För det andra, för vissa membranproteiner av en N-terminal fusion kan vara mer optimala än en C-terminal fusion. I båda fallen bör funktionaliteten hos fusions bekräftas genom transkomplementering.
Tredje, andra affinitetsreningsprotokoll är också kompatibla med efterföljande MS-analys, såsom FLAG rening ochtandem affinitetsrening (TAP). Vi föredrar Strep-tag II på grund av dess ringa storlek med endast 8 aminosyror (WSHPQFEK).
För det fjärde bör koncentrationen av formaldehyd som används och den tvärbindande tiden optimeras för att förhindra ospecifika tvärbindning. En tillräcklig men inte överdriven användning av formaldehyd kan övervakas genom immunoblotting av okokt prover som förhållandet mellan tvärbunden och olänkade membranbetesprotein (figur 2). Tvärbundna proteiner migrerar som ett utstryk i den övre delen av immunoblot. Un-kopplade proteiner migrerar som obehandlat protein. Förhållandet mellan tvärbunden och olänkade protein bör vara ca 3:1.
Femte, det finns ingen "allmän rengöringsmedel" för alla membranproteiner för solubilisering. Därför i vissa fall lämplig detergent för solubilisering av membran betesprotein måste bestämmas. Därvid måste dock den valda detergent vara kompatibel med Strep-Tag column.
Slutligen har silverfärgningsproceduren för att vara kompatibel med efterföljande MS-analys. MS kompatibla silverfärgnings kit finns från olika leverantörer. Vi använde olika listor med jämförbara goda resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 och SFB940 till SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
