고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

이 절차의 전반적인 목표는 숙주 유전자 침묵과 같은 표현형 조절제의 영향 또는 마이코박테리움 결핵, 세포 내 복제에 대한 소분자의 영향을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 소분자와 384웰 플레이트를 분주하거나 irna로 세포를 transection하고 복합체로 transfection하여 수행됩니다. 다음 단계는 세포를 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 또는 G-F-P-M-T-B를 발현하는 녹색 형광 단백질로 감염시키고 웰을 포함하는 작은 분자에 세포를 첨가하고 마이크로플레이트를 5일 동안 배양하는 것입니다.

RNAi 접근법의 경우, 웰을 포함하는 RNAi transfection 복합체에 세포를 추가합니다. 마이크로플레이트를 3일 동안 배양한 다음 결핵균을 발현하는 G-F-P-M-T-B로 세포를 감염시킵니다. 세포를 염색한 후 마지막 단계는 자동 컨포칼 현미경을 사용하여 플레이트를 판독하는 것입니다.

궁극적으로 자동 형광 현미경 검사와 이미지 기반 분석을 사용하여 G-F-P-M-T-V 세포 내 성장의 변화를 측정합니다. 군체를 형성하는 유니 헌팅과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 긴 잠복 기간을 절약하고 더 많은 처리량을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Christophe Keval 또는 SONG과 제 연구팀의 박사후 연구원 3명입니다.

SI RNA 라이브러리 스크리닝 및 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 프로토콜은 MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV 배양을 발현하는 2주 된 GFP를 활용합니다. G-F-P-M-T-B 세균성 현탁액을 첫째로 준비하기 위하여는, 4, 5 분 동안 000 Gs에 배양물을 원심 분리하고, 상등액 Resus를 버리고, DPBS로 배양물을 중단하고 이런 식으로 다시 분리기를 하십시오. DPBS로 배양물을 세 번 세척합니다.

세 번째 세척 후, supernat을 버리고 RPMI 1640 배지를 함유 한 10 % FBS 10 밀리리터에 박테리아 펠릿을 재현탁시킵니다. 박테리아 응집체가 침전될 수 있도록 실온에서 1시간 동안 현탁액을 그대로 두십시오. 박테리아 supernat를 수집하고 600 나노 미터에서 OD와 GFP 형광을 측정합니다.

박테리아 농도를 결정하기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600나노미터의 OD는 0.6에서 0.8 사이여야 합니다. 기준 회귀선을 사용하여 현탁액의 역가를 계산하고, 동일한 조건에서 준비된 다른 배양물에 대한 실험 전에 생성된 CFU 값의 함수로 RFU 값을 표시합니다. 일반적인 농도는 밀리리터당 8개의 박테리아에 10 곱하기 10입니다.

96에 저장된 건조된 SI RNA 라이브러리를 Resus가 현탁하여 이 절차를 시작합니다. 2개의 마이크로몰 농도에 대한 1개의 X-S-I-R-N-A 완충액이 있는 웰 마더 플레이트. 혼합물 10 마이크로 리터를 384 웰 도터 플레이트의 각 웰로 옮기고, 딸 플레이트의 각 웰에서 2.5 마이크로 리터의 SI RNA를 384 웰 분석 플레이트로 동일한 분석 플레이트로 옮깁니다.

각각 2.5마이크로리터의 음성 및 양성 대조군 IRNA를 각각의 웰에 추가합니다. 도터 플레이트를 사용하지 않을 경우 즉시 박리 가능한 알루미늄 씰로 밀봉하십시오. 밀봉된 플레이트는 IRNA에 따라 최소 6개월에서 최대 2-3년 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

라이브러리 제조업체의 권장 사항. transfection 시약을 하나의 X-D-P-B-S로 희석하여 각각에 0.1 microliter를 제공할 수 있는 충분한 용액을 생성하여 준비합니다. 희석된 transfection 용액을 실온에서 5분 동안 사전 배양합니다.

7.5 마이크로리터의 희석된 형질주입 용액을 384 웰 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에 현탁된 40 마이크로리터의 인간 유형 2 폐렴 세포, A 5, 4, 9 세포에서 분석 플레이트의 각 웰에 실온에서 30분 동안 배양합니다. 5%의 이산화탄소를 함유한 대기에서 섭씨 37도에서 3일의 배양 기간 동안 세포를 유지합니다. 이 세포는 매 24 시간마다 분열한다, 따라서 대략 12, 000의 세포는 transfection 후에 3 일 후에 각 well에 있다.

si. 3일 후. 5 49 세포의 RNA transfection은 MTBH 37 RV GFP 박테리아 현탁액을 준비합니다. 앞에서 설명한 바와 같이.

현탁액은 밀리리터당 6개의 박테리아에 2.4 곱하기 10을 포함해야 하며, 이는 5의 감염 다중성에 해당합니다. 384 웰 분석 플레이트에서 매체를 제거하고 웰당 25마이크로리터의 박테리아 현탁액을 추가합니다. 384웰 분석 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 함유한 대기에서 5시간 동안 배양합니다.

5시간 후. 배지를 제거하고 10% FBS가 보충된 RPMI 배지로 세포를 세 번 부드럽게 세척하여 남아 있는 세포외 박테리아를 죽입니다. 각 웰의 세포를 50마이크로리터로 처리합니다.

밀리리터당 50마이크로그램의 아미카신을 함유한 신선한 R-P-M-I-F-B-S 배지. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 함유한 대기에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, Amikasin을 함유한 배지를 제거하고 10%FBS가 보충된 50마이크로리터의 새로운 RPMI 배지를 추가합니다. 잘.

컨포칼 현미경으로 스크리닝하기 전에 5%의 이산화탄소가 포함된 대기에서 섭씨 37도에서 5일 동안 분석 플레이트를 배양합니다. 이 절차를 시작하려면 실온에서 100% DMSO에 용해된 화합물 라이브러리가 포함된 384웰 마더 플레이트를 해동하여 마더 플레이트에서 0.5마이크로리터의 화합물을 RPMI 1640 웰당 10마이크로리터를 포함하는 384웰 도터 플레이트로 전달합니다. 배지는 10%FPS를 다음 수확하여 6일 된 1차 인간 대식세포를 4배로 10배하여 RPMI 1640에서 밀리리터당 5개의 세포를 수확합니다.

10%FPS와 밀리리터당 50나노그램이 보충된 미디엄. 재조합 인간 MCSF는 희석된 일차 세포를 현탁액 1에서 5까지의 다양한 MOI에서 기저와 함께 섭씨 37도에서 2시간 동안 90RPM으로 가벼운 진탕으로 배양합니다. 감염된 세포를 350GS에서 5분 동안 원심분리하여 세포외 박테리아를 제거합니다.

Resus는 RPMI 1640에서 펠릿을 현탁시킵니다. 10% FPS와 원심분리기가 추가된 중간. 다시 이것을 반복하고 마지막 세척 후 두 번 세탁하십시오.

Resus는 10% FBS와 밀리리터당 50마이크로그램이 보충된 RPMI 1640 배지에 감염된 세포를 현탁시킵니다. 아미카신은 섭씨 37도의 원심분리기에서 1시간 동안 가벼운 흔들림으로 현탁액을 5분 동안 배양합니다. 아미카신(Amikasin)을 함유한 배지를 제거하고 감염된 세포를 완전한 RPMI 1640으로 세척합니다.

배지에는 10% FBS와 밀리리터당 50나노그램이 보충됩니다. 재조합 인간 MCSF. 이 세척을 한 번 반복하십시오.

감염된 대식세포 현탁액 웰당 40마이크로리터를 이미 10마이크로리터의 화합물 희석액이 함유되어 있는 이전에 준비한 동일한 384웰 분석 플레이트에 추가합니다. 각 웰에서 DMSO의 최종 농도는 이제 1%입니다.SI RNA 라이브러리용 컨포칼 현미경으로 스크리닝하기 전에 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기에서 섭씨 37도에서 5일 동안 분석 플레이트를 배양합니다. 스크리닝 이미지 획득 전에 PBS에서 밀리리터당 30마이크로그램 DPI를 새로 준비한 10마이크로리터의 분석 플레이트의 각 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.

화합물 스크리닝의 경우: 이미지 획득 전에 살아있는 세포를 세포 투과성 원적외 형광 염료로 섭씨 37도에서 30분 동안 염색합니다. 분석 플레이트를 자동 컨포칼 현미경에 로드합니다. 노출 매개변수를 설정하고 405나노미터의 여기 레이저와 450나노미터의 방출 필터를 사용하여 DPI 형광을 기록합니다.

488나노미터의 여기 레이저와 520나노미터의 방출 필터를 사용하여 GFP 형광을 기록합니다. 획득할 각 우물에서 우물과 필드를 선택한 다음 레이아웃(layouts) 및 하위 레이아웃(sub layouts)이라고 합니다. 파라미터는 설정된 파라미터를 사용하여 실험 파일을 생성하고 자동 수집을 실행합니다.

이 경우, 동일한 웰 및 필드의 4개의 서로 다른 이미지가 기록되어 원격 서버로 전송 이미지를 전송합니다. 그 후, SI RNA 스크리닝을 위해 acapella 2.6 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평가합니다. 각 필드에는 두 개의 채널 또는 색상이 포함되어 있습니다.

초록색은 박테리아, 파란색은 세포입니다. 핵은 핵 검출 알고리즘을 사용하여 DAPI 채널에서 세포핵을 검출하고 픽셀 강도 속성 알고리즘을 사용하여 GFP 채널에서 박테리아 영역을 검출합니다. 채널을 병합하고 박테리아와 세포가 공유하는 픽셀의 수를 계산하여 세포 내 박테리아를 정량화합니다.

4개 필드의 평균으로 표현된 최종 결과는 총 박테리아 면적, 총 세포 수, 감염된 세포의 비율 및 세포당 박테리아 면적입니다. 복합 스크리닝의 경우, 각 필드에는 두 가지 채널 또는 색상이 포함되며, 박테리아의 경우 녹색, 세포의 경우 적색입니다. 핵과 세포질은 픽셀 강도 속성 알고리즘을 사용하여 원적외선 채널에서 세포 영역을, GFP 채널에서 박테리아 영역을 검출합니다.

채널을 병합하고 박테리아와 핵이 공유하는 픽셀의 수를 계산하여 세포 내 박테리아를 정량화합니다. 4개 필드의 평균으로 표현된 최종 결과는 총 박테리아 면적, 총 세포 면적, 세포 내 박테리아 총 면적, 세포 내 박테리아 면적과 세포 총 면적 간의 비율입니다. 고처리량 게놈 전체 SI RNA 스크리닝의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있으며, SI RNA로 din one의 발현을 침묵시켜 5 49 세포에서 세포 내 마이코박테리아 양의 감소로 이어졌습니다.

이러한 대표적인 컨포칼 이미지에서 볼 수 있듯이, 비표적 IRNA 또는 din one에 특이적인 SI RNA로 transfection되고 5일 동안 MTB를 발현하는 GFP에 감염된 5,49개 세포. GFP MT BH 37 RV는 녹색으로, 셀은 빨간색으로 시각화되었습니다. 세포의 수와 세포 내 G-F-P-M-T-B-H 37 RV 부하는 이미지 기반 분석 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다.

이 그래프는 파란색 원으로 표시된 스크램블 IRNA의 5회 복제에서 감염된 5 49개 세포와 빨간색 원으로 표시된 din 1개의 irna의 비율을 보여줍니다. 3일간의 침묵과 5일간의 감염 후, 감염된 세포의 비율은 비표적 스크램블 IRNA로 형질주입된 세포에 비해 5 49개의 세포를 침묵시킨 din one에서 절반으로 감소합니다. Z-점수를 정의하기 위해 스크램블과 비교하여 SI RNA 표적 DIN ONE의 샘플 기반 정규화를 적용했습니다.

SI a 대상 DIN 1에 대해 약 음의 15 Z-점수 평균을 얻었습니다. 세 개의 별표는 0.0001보다 작은 P 값을 나타냅니다. 이러한 결과는 DIN one이 si에 대한 양성 대조군으로 사용될 수 있음을 나타내며, 이는 고함량 화합물 스크리닝에서 dins IRNA와 동일한 표현형을 가질 수 있는 MTB 집락화 및 폐렴 세포와 관련된 다른 새로운 숙주 인자를 발견하기 위한 스크리닝입니다.

세포 내 박테리아 성장에 대한 복합 효율은 용량 반응 곡선 또는 DRC를 설정하고 기준 양성 및 음성 화합물로 정규화하여 평가되었습니다. 이 예시에서, MTBH 37 RV 균주를 발현하는 A GFP에 감염된 인간 1차 대식세포를 1%DMSO를 음성 대조군으로 사용하거나 isid, INH 및 rifampicin의 농도를 증가시켜 배양했습니다. 리프. 대식세포는 적색 형광 염료로 표지되어 있으며, 녹색은 감염된 인간 대식세포의 컨포칼 형광 이미지에 대한 MTB 분석을 통해 활성 화합물이 숙주 세포에서 MTB의 세포 내 복제에 영향을 미쳐 세포 내 GFP 신호 영역에 해당하는 마이코박테리아 부하의 감소로 이어진다는 것을 나타냅니다.

세포 내 박테리아 면적과 총 세포 면적 사이의 비율을 계산한 다음 화합물 농도의 함수로 표시하여 DRC를 생성했으며, 여기에 표시된 DRC는 각 그래프에서 isid 및 rifampicin의 DRC입니다. 화합물의 DRC는 1% DMSO로 정규화되었고, 음성 대조군은 0.1 μg이며, 밀리리터당 0.1 마이크로그램은 양성 대조군이다. 이 곡선을 통해 한 학기 동안 박테리아 집락의 50%를 억제하는 데 필요한 농도와 99%의 박테리아 복제를 억제하는 데 필요한 최소 농도를 모두 결정할 수 있습니다.

이, 이 기술은 세포 형질주입 또는 화합물 준비의 경우 2시간, 세포 감염 및 마이크로플레이트에 분주하는 데 6시간, 이미지 획득을 유지하는 데 2시간으로 나누어 10시간으로 완료할 수 있습니다. 8일 동안 결핵균을 다루는 작업은 예술가로서 매우 힘들 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 마스크를 포함한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 조숙한 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.