Summary
תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.
Abstract
רוב מקרי מוות הקשורים לסרטן מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית. שלב מחלה הקטלני ביותר זה קשור לנוכחות של תאים סרטניים במחזור (CTCs). תאים נדירים אלה כבר הוכיחו להיות בעל משמעות קלינית בשד גרורתי, סרטן ערמונית, סרטן מעי גס. תקן הזהב הנוכחי בזיהוי CTC קליני וספירה הוא במערכת ה-FDA פינה CellSearch (CSS). כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי מנוצל על ידי פלטפורמה זו, כמו גם בשני פרוטוקולים נוספים מותאמים המתארים את התהליך מפורט של סמן אופטימיזציה של משתמש מוגדר לאפיון חלבונים של CTCs מטופל ופרוטוקול דומה ללכידת CTC בכמויות נמוכות מאוד של דם, באמצעות תקן ריאגנטים CSS, ללימוד בעכברי מודל פרה vivo של גרורות. בנוסף, הבדלים באיכות CTC בין דם תורם בריא זינקו עם תאים מתרבית רקמה לעומת SAMP דם חולהles מודגשים. לבסוף, כמה פריטים בדרך כלל סותרים שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC מפורטים. יחדיו, פרוטוקולים אלה יספקו משאב שימושי עבור משתמשים בפלטפורמה זו מתעניינת במחקר פרה קליני הנוגע לגרורות וCTCs.
Introduction
בשנת 2013 הערכה הוא כי 580,350 אנשים ימותו מסרטן וש1,660,290 מקרים החדשים של מחלה זו יאובחנו בארצות הברית לבדה 1. רוב מקרי המוות הללו מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית 2. חוסר הנוכחי של טיפולים יעילים בטיפול בגרורות ובהבנה מוגבלת של המפל גרורתי הופך שלב זה של מחלה קטלני ביותר. נוכחותם של תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתוך זרם הדם הוכח לתאם עם מחלה גרורתית 3. תאים אלה הם נדירים ביותר וזיהוי שלהם מעיד על הישרדות כוללת בשד גרורתי 4, 5 ערמונית, וסרטן מעי גס 6. בחולים אלה, הנוכחות של ≥ 5 (שד וערמונית) או ≥ CTCs 3 (מעי גס) ב7.5 מיליליטר של דם מעיד על פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה לאותם חולים עם פחות או ללא CTCs לזיהוי בסאםדם דואר בנפח. בנוסף, השינוי במספר CTC במהלך או לאחר התערבות טיפולית הוכח להיות שימושי כמנבא של תגובה לטיפול, לעתים קרובות מוקדם יותר מאשר טכניקות מנוצלים כיום 7-10.
הערכה הוא כי בחולי סרטן גרורתי, CTCs מתרחש בתדירות של כ 1 CTC לכל 10 5 -10 7 תאי mononuclear דם ובחולים עם מחלה מקומית, תדר זה יכול להיות אפילו נמוך יותר (~ 1 ב10 8). הטבע הנדיר של תאים אלה יכול לעשות את זה קשה לזהות באופן מדויק ואמין ולנתח 11 CTCs. מספר שיטות (נבדק בעבר 12-14) כבר נוצל כדי להעשיר ולזהות תאים אלה על ידי ניצול מאפיינים שמבדילים אותם מסביב מרכיבי דם. באופן כללי, ספירת CTC היא תהליך בן שני חלקים שדורש הן צעד העשרה ושלב זיהוי. באופן מסורתי, את הפעולות העשרה מסתמכות על הבדלים בחינוך גופנימאפייני iCal של CTCs (גודל תא, צפיפות, deformability) או על ביטוי סמן חלבון (כלומר מולקולת הידבקות תא אפיתל [EpCAM], cytokeratin [CK]). בעקבות העשרה, זיהוי CTC יכול להתבצע במספר הדרכים שונות, הנפוץ ביותר מהם מבחני המבוססים על חומצות גרעין ו / או גישות cytometric. כל אחת מאסטרטגיות אלה הם ייחודיים, שיש יתרונות וחסרונות ברורים, עם זאת כל שחסר להם סטנדרטיזציה; הכרח עבור כניסה להגדרה הקלינית. מערכת CellSearch (CSS) לפיכך פותחה כדי לספק שיטה סטנדרטית לזיהוי והספירה של CTCs הנדיר בדם אדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטכניקות המבוסס על נוגדן 4-6. פלטפורמה זו נחשבת כיום לסטנדרט בספירת CTC הזהב והיא הטכניקה היחידה שאושרה על ידי ארה"ב מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לשימוש במרפאת 15.
CSS הוא שתי consistin פלטפורמת רכיבגרם של, (1) מערכת CellTracks AutoPrep (להלן ככלי ההכנה), שממכנת את הכנת דגימות דם של בני אדם, ו (2) CellTracks מנתח השני (להלן ככלי ניתוח), אשר סורק את אלה דוגמאות הבאות הכנה. כדי להבחין CTCs את זיהום לויקוציטים מכשיר ההכנה מעסיק נוגדן בתיווך, גישת הפרדה מגנטית מבוסס ferrofluid ומכתים הקרינה ההפרש. בתחילה, מערכת תוויות CTCs באמצעות נוגדנים אנטי EpCAM מצומדת לחלקיקי ברזל. המדגם הוא מודגרות אז בשדה מגנטי, וכל התאים ללא תווית הם aspirated. תאים סרטניים שנבחרו resuspended, וטופחו בכתם הקרינה ההפרש, בהיקף של נוגדני fluorescently שכותרתו ומגיב מכתים גרעיני. לבסוף, המדגם מועבר למחסנית מגנטית, הנקרא MagNest (להלן כמכשיר המגנטי), וscanned באמצעות כלי הניתוח.
מכשיר הניתוח משמש לסריקת דגימות מוכנות באמצעות מסנני הקרינה שונים, זה מותאם לחלקיקי הניאון המתאימים, באמצעות עדשה אובייקטיבית 10X. CTCs מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי EpCAM, אנטי הפאן CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18, ו19), ואת הכתם הגרעיני 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). לעומת זאת, לויקוציטים לזהם מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי CD45-allophycocyanin (APC) וDAPI. בעקבות סריקה, תאים סרטניים פוטנציאליים המוגדר על מחשב מוצגים למשתמש. מתמונות אלה, המשתמש חייב להעסיק ניתוח איכותי באמצעות הפרמטרים המוגדרים ומכתים ההפרש שנדונו לעיל, כדי לקבוע שאירועים הם CTCs.
בנוסף לאספקת שיטה סטנדרטית לספירת CTC, CSS מאפשר לאפיון מולקולרי של CTCs המבוסס על סמני חלבון של עניין. זה ג החקירהלהתבצע ברמת התא הבודד, באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) ערוץ הקרינה אינו נדרש לצורך זיהוי CTC 16. למרות שפלטפורמה זו מספקת את היכולת לאפיון מולקולרי, התהליך מפורט של פיתוח פרוטוקול ואופטימיזציה אינו מוגדר היטב. שלושה סמנים זמינים מסחרי פותחו על ידי היצרן לשימוש עם CSS, ובכלל זה צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן (EGFR), גורם קולטן אנושי צמיחת אפידרמיס 2 (HER2), וגורם גדילה דמוי אינסולין קולטן 1 (IGF-1R). ניתוח HER2, בשילוב עם CSS, נוצל על ידי מספר קבוצות כדי להמחיש את הפוטנציאל לאפיון CTC להודיע קבלת החלטות קלינית ואפשרות לשנות את הנחיות טיפול קיימות. לדוגמא, Fehm et al. 17 הראו כי כשליש מחולי סרטן השד עם גידולים מסוג HER2 העיקרי היה HER2 + CTCs. בנוסף, ליו et al.18 דיווחו לאחרונה כי עד 50% מהחולים עם סרטן השד גרורתי + שלה לא היו HER2 + CTCs. הרצפטין, הקולטן HER2 מפריע נוגדן חד שבטי הפגין להועיל לחולים אשר גידולים להביע רמות מספיקות של HER2, הוא טיפול מנוצל בדרך כלל לחולים עם גידולים ראשוניים + HER2 19-21 במידה רבה. עם זאת, מחקרים אלה מראים כי הרצפטין ניתן להיות תת אופטימלי מנוצל וכי אפיון CTC עשוי לסייע בניבוי תגובה לטיפול. סופו של דבר, אפיון CTC יכול להיות הפוטנציאל לשפר את טיפול אישי.
מחקר CTC הוא ייחודי בכך שהיא במידה רבה מנוצל גישת מיטה להמעבדתיים. בשיטה זו, בניגוד למחקר מעבדתי למיטה, אשר לעתים קרובות יכול לקחת שנים כדי להשפיע על טיפול בחולה, אפשרה כניסה מהירה CTCs להגדרה הקלינית. עם זאת, רופאים מהססים להשתמש בתוצאות מניתוח CTC בהחלטות Mak טיפול בחולהing בשל חוסר הבנה של הביולוגיה הבסיסית שלהם. לכן מודלים עכבר פרה מתאימים של טכניקות גרורות וניתוח CTC משלים חייבים להיות מנוצלים על מנת לחקור השאלות קשות האלה. באופן כללי, ישנם שני סוגים של מודלים פרה לשמש כדי לחקור את המפל גרורתי, (1) מודלים גרורות ספונטניות, המאפשרים הלימוד של כל השלבים במפל גרורתי, ו (2) מודלים גרורות ניסיוניים, המאפשרים רק ל המחקר של צעדים מאוחר יותר בתהליך גרורתי כמו extravasation והיווצרות גידולים משניים 22. מודלים גרורות ספונטניים, כרוכים בזריקות של תאי גידול למיקומים מתאימים orthotopic (למשל הזרקה של תאי סרטן ערמונית לבלוטת הערמונית לחקר סרטן הערמונית). לאחר מכן ניתנו תאי זמן כדי ליצור גידולים ראשוניים וספונטאניות לשלוח גרורות לאתרים משניים כגון עצמות, ריאות, ובלוטות לימפה. בתוךלעומת זאת, מודלים גרורות ניסוייות כרוכים בהזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור הדם (לדוגמא דרך וריד זנב או הזרקת intracardiac למקד תאים למקומות ספציפיים) ולכן לדלג על השלבים הראשוניים של intravasation והפצה לאיברים משניים 22. עד כה רוב ניתוח CTC בin vivo מערכות מודל שבוצע באמצעות או 23 או מותאם טכניקות מבוססות cytometry מבוסס אנושי CTC (למשל AdnaTest) 24. אמנם שימושי, אף אחת מטכניקות אלה משקף באופן נאות ספירת CTC באמצעות CSS תקן זהב. בהתבסס על האישור הקליני, הטבע סטנדרטי, ושימוש נרחב של CSS, הפיתוח של טכניקת CTC לכידה וזיהוי לin vivo דוגמנות שמנצלת הכנת מדגם מקבילה, עיבוד, וקריטריוני זיהוי יהיה יתרון כתוצאות תהיה דומות לאלה מתקבל דגימות מטופל. עם זאת, בשל הנפח requirements של מכשיר ההכנה לא ניתן לעבד כמויות קטנות של דם באמצעות פלטפורמה אוטומטית זה. . בנוסף, העבודה קודמת של אליאן ואח' 25 הוכיחה כי זיהום של דגימות עם תאי האפיתל בעכבר (שגם עומדות בהגדרה CTC הסטנדרטי [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) יכול להוביל לסיווג מוטעה של תאי אפיתל קשקש עכבר כמו CTCs. כדי לטפל בבעיות אלה בטכניקה מותאמת המאפשרת הניצול של חומרים כימיים ערכת CSS CTC בשילוב עם הליך בידוד ידני פותח. התוספת של אנטיגן לויקוציטים אנושיים FITC נוגדן הנקרא (HLA) לassay מאפשרת לתאים סרטניים אנושיים כדי להבחין בין תאי אפיתל קשקש עכבר.
כתב יד זה מתאר סטנדרטי, שפותח באופן מסחרי ופרוטוקול CSS מותאם לעיבוד דגימות חולים דם ומלכודות נפוצות שעשויות להיות נתקלים, כולל discrepanפריטים לא שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC. בנוסף, ההתאמה האישית של assay ב-CSS כדי לבחון מאפייני חלבון בהגדרת משתמש של CTCs נתפס וטכניקת CSS מותאמת דומה המאפשרת להעשרה וזיהוי של CTCs מכמויות קטנות של דם בעכברי מודל פרה של גרורות מתוארות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבני האדם שתוארו בכתב היד הזה בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי אדם מחקר האתיקה מועצת המנהלים של האוניברסיטה המערבית. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מערב השימוש בבעלי חי ועדת המשנה.
1. CTC ספירה סטנדרטית מדגימות דם חולה באמצעות CSS
1. איסוף דם אדם לדוגמא והכנה לעיבוד בכלי ההכנה
- באמצעות שימוש בטכניקות phlebotomy אספטיים סטנדרטיות, לצייר מינימום של 8.0 מיליליטר של דם אדם לתוך צינור CellSave 10 מיליליטר (להלן כצינור CTC חומר משמר), המכיל חומצת אתילן diaminetetraacetic (EDTA) וחומר משמר סלולארי קניינית. הפוך 5x הצינור כדי למנוע קרישת דם. דוגמאות יכולות להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסנות בטמפרטורת חדר למשך עד 96 שעה.
- Removריאגנטים CSS דואר מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
- בעזרת פיפטה חד פעמית 10 מיליליטר וpipettor אוטומטית, לאסוף 7.5 מיליליטר של דם מצינור משמר CTC ולוותר לאט דם לתוך צינור עיבוד שכותרתו כראוי הכנת מכשיר.
- הוספת 6.5 מיליליטר של חיץ דילול מדגם זה. מערבבים על ידי היפוך 5x מדגם. צנטריפוגה מדגם ב XG 800 עבור 10 דקות עם הבלם במצב "כבוי". בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לטעון את כל דגימות המטופל על המערכת לעיבוד. דגימות חייבות להיות מעובד בתוך 1 שעות של הכנה.
2. בקרת הכנה לעיבוד בכלי ההכנה
- בעדינות מערבולת בקבוקון השליטה ולהפוך 5x לערבב.
- מוציא בזהירות את הפקק מבקבוקון השליטה ולמקם את צינור עיבוד הפוך הכנת מכשיר על גבי הבקבוקון הסיר את המכסה. בתנועה אחת מהירה, להפוך אתלשלוט בבקבוקון, ויוצקים את התוכן לתוך צינור העיבוד. אמנם הפוך, בעדינות קפיצית הצדדים של בקבוקון השליטה לשחרר את כל תכנים שנותרו.
- מוציא בזהירות את בקבוקון שליטה ההפוכה מצינור העיבוד, הבטחה כי נוזל לא הולך לאיבוד ומניח בצד. בעזרת פיפטה 1,000 μl, לאסוף כל תוכן שנותר מהבקבוקון ואת המכסה ובעדינות פיפטה לתוך צינור העיבוד.
- בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה כדי לטעון את השליטה על המערכת לעיבוד.
3. סריקה לדוגמא על כלי ניתוח
- בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לפרוק את כל הדגימות מהמערכת. באופן רופף כובע כל מחסנית מכשיר מגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ואניncubate בחושך לפחות 20 דקות בטמפרטורת חדר. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה.
- הפעל את כלי הניתוח ולאתחל את המנורה. ברגע שחמם (~ 15 דקות), טענת את מחסנית אימות מערכת על גבי מכשיר הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת QC. בצע את ההוראות המופיעים על מסך כדי לבצע את אמצעי בקרת איכות הנדרשת.
- טען מדגם על כלי הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת החולה. כל המידע שנשמר ממכשיר ההכנה יוצג. לחץ על התחל כדי לאתחל סריקת מדגם. המערכת תבצע מיקוד גס וגילוי קצה של מחסנית המכשיר המגנטית.
- התאם את כל הקצוות לפי צורך באמצעות מקשי הכיוון. בחר קבל. המערכת תבצע להתמקד בסדר ולהתחיל סריקת מדגם.
- שליטה בעקבות סריקת התוצאות צריכה להיות מאומתת באמצעות הקריטריונים שהוגדרו לתאים זינקו ב גבוה (CK + DAPI + CD45 - APC +) ונמוך (CK + DAPI + CD45 - FITC + ריכוזים). מדגם מטופל בעקבות סריקת התוצאות צריך להיבדק לCTCs נתפס באמצעות הקריטריונים המוגדרים CTC (CK + DAPI + CD45 -).
2. אפיון CTC לסמנים המוגדר על ידי משתמש באמצעות CSS
1. הכנת סמנים מוגדר משתמש ומכשיר האתחול
- לדלל את הנוגדן של עניין באמצעות ונד ראשי נוגדן ממס לריכוז הרצוי בכוס מגיב סמן באמצעות הנוסחה הבאה, שבו ריכוז העבודה הוא הריכוז של הנוגדנים לאחר בנוסף למדגם וריכוז המניות הוא הריכוז של נוגדנים ב כוס מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, להתאים את כמויות הנוגדנים כפי שמתואר בטבלה 1. מניחים את הכוס מגיב סמן למקום 1 במחסנית מגיב וload המחסנית על CSS.
ריכוז מניות = (ריכוז עבודה x 850 μl) / 150 μl - איסוף דם, להכין את הדגימות, ולטעון את מכשיר ההכנה כפי שמתואר בתקן הנ"ל CTC ספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. כדי לאפשר תוספת סמן מותאמת אישית, בחר מוגדר משתמש Assay כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי מכשיר ההכנה. קלט את שם הסמן ובחר שמור. כדגימות הועמסו על המכשיר, המפעיל יתבקש לציין שאמור לקבל סמן מותאם אישית על ידי בחירה כן או לא בהתאם לצורך.
2. סריקת מדגם של סמנים מוגדרי משתמש בכלי ניתוח
- הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS
- טען מדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. כדי לאתחל את ערוץ FITC, בחר CellSearch CTC כזהות קיט תחת סעיף בדיקת הפרוטוקולים. מתפריט זה, מחקר CTC בחר, לחץ על לחצן ערוך ולהגדיר את זמן החשיפה בהתאם לצורך. מומלץ כי זמן חשיפה של 1.0 שניות לא יהיה חריגה בעת שימוש בערכת CSS CTC כמו זה יכול להגדיל לדמם דרך לערוצי ניאון אחרים מנוצלים לזיהוי CTC.
3. עיבוד של CSSProtocol התקן לשימוש במודלים פרה מאוס
** מעובד מתוך Veridex עכבר / עכברוש CellCapture ערכה (כבר לא זמין באופן מסחרי)
1. עכבר של אוסף דם ואחסון
- לפני איסוף דם, לרוץ ~ 30 μl של 0.5 M EDTA קדימה ואחורה באמצעות מחט G 22, משאיר כמות קטנה של EDTA ברכזת.
- לאסוף מינימום של 50 μl של דם עכברים מעכברים שהוזרק בעבר עם תאים סרטניים אנושיים דרך נתיבים, וריד זנב, או intracardiac orthotopic. לאסוף דם מוריד saphenous (לניתוח CTC סידורי) או על ידי לנקב לב (לניתוח CTC מסוף). הסר את המחט ולוותר על דם לתוך צינור איסוף דם microtainer EDTA 1 מיליליטר. מערבבים על ידי היפוך או צינור בעדינות קפיצי למניעת קרישת דם. דם עשוי להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן בטמפרטורת חדר למשך עד 48 שעות הבאות התוספת של נפח שווה של חומר משמר סלולארי CytoChex.
2. CTC העשרה
- הסר ריאגנטים CSS מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
- העבר את המקבילה של 50 μl של דם לזרימת x 75 מ"מ 12 cytometry צינור. הוסף 500 μl של חיץ דילול מדגם זה, שוטף את כל דם שנשאר על הדפנות של הצינור. במידת צורך, ספין צנטריפוגות קצרניתן להשתמש בם כדי לאסוף את כל דם שנותר.
- בעדינות מערבולת ferrofluid אנטי EpCAM ולהוסיף 25 μl לכל דגימה על ידי הצבת קצה פיפטה ישירות לתוך המדגם. הוסף 25 μl של מגיב שיפור לכידת ומערבולת בעדינות לתערובת. דגירה דגימות בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
- הנח צינורות מדגם לתוך המגנט ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק.
3. CTC מכתים
- הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב 50 μl של חומצות גרעין דאי, 50 μl של הכתמה מגיב, 1.5 μl של אנטי עכבר CD45-APC, 5.0 μl של אנטי אנושי HLA-Alexa פלואוריד 488, ושל permeabilization 100 μl מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, ריאגנטים אלה עשויים להיות מעורבבים מראש ו206.5 μl של תערובת ניתן להוסיף לכל מבחנה. מערבולת בעדינות לתערובתדגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- הוסף 500 μl של חיץ דילול, מערבולת בעדינות, דוגמיות המקום אל המגנט, ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב350 μl של חיץ דילול. מערבולת בעדינות לתערובת.
4. טעינת התקנים מגנטית
- באמצעות קצה טעינת ג'ל, מעביר בזהירות את כל הנפח מצינור המדגם לתוך מחסנית במכשיר המגנטי. התחל בתחתית המחסנית ולסגת באיטיות את הקצה כמדגם הוא לוותר.
- ברגע שכל הדגימה הועברה, באופן רופף מכסה את מחסנית המכשיר המגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית, כמתואר בsection 3.1 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS.
- פופ כל בועות באמצעות מחט G 22 סטריליים על ידי לכידתם בין פוע וקצה המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ודגירה בחושך לפחות 10 דקות. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה.
5. סריקה של דוגמאות מופרדים באופן ידני בכלי ניתוח
- הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS.
- טען את המדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. נקה את כל הנתונים קיימים על כפתור נתוני מכשיר המגנטי על ידי לחיצה על הכפתור לדוגמא עיצוב. אפשר ערוץ FITCnd להגדיר את זמן חשיפה ל1.0 שניות כפי שתואר בסעיף 2.2 אפיון CTC לסמנים מוגדר משתמש באמצעות CSS.
- לחץ על כרטיסיית בדיקת החולה ובחר עריכה כדי קלט את המידע לדוגמה. בחר CellSearch CTC כזהות קיט ומחקר CTC כפרוטוקול בדיקה. קלט את המידע הדרוש שנותר כפי שצוין ככוכבית. שמור את המידע לדוגמא ולחץ על התחל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תקן CTC ספירת Assay
הרגישות והסגוליות של CSS תועדה היטב בספרות. עם זאת, כדי לאמת את התאוששות CTC שווה ערך, זינק (תאי סרטן ערמונית אנושית 1,000 LNCaP) ודגימות דם של בני אדם unspiked מתורמים מתנדבים בריאים עובדו על CSS באמצעות פרוטוקול CSSCTC הסטנדרטי. כצפוי, דגימות unspiked היו חופשיות של CTCs, 0.00 ± 0.00%, והתאוששות CTC הודגמה להיות 86.9 ± 4.71% עבור דגימות ממוסמר (איור 1 א). תמונות בגלריה CSS מתקבלות דגימות ממוסמר היו באיכות אופטימלית וCTCs היו קל להבחין שמאינו CTCs. עם זאת, בעת עיבוד דגימות שהתקבלו מחולי הסרטן, זיהוי CTCs הוא מעט יותר מאתגר, עם תאים רבים המופיעים בגודל קטן יותר ולהיות פחות להבחין בקלות מהלא CTCs (איור 1). בנוסף, בעת בדיקת דגימות חולה 6 קטגוריות של אירועים היתה identifiאד שהיו פריטים נפוצים סותרים בין בודקים (תרשים 1C). 6 קטגוריות אלה כללו, (1) אירועים קטנים שלא עומדים בדרישת גודל מיקרומטר 4 לסיווג CTC, (2) פריטים עם CK העמום ו / או מכתים DAPI; (3) מוצדקים (צריכים להיחשב כCTC) לעומת מוצדק (לא צריך להיות נחשב CTC) לדמם דרך לתוך ערוץ CD45-APC שנגרם על ידי צביעת CK-PE בהיר; (4) FITC + אירועים; (5) תמונות pixelated בCK ו / או ערוצי DAPI; ו (6) אירועים עם מכתים DAPI שהוא גדול יותר מאשר תמונות CK או אלה עם מכתים DAPI שאינו חופפים> 50% עם תמונת CK. עבור קטגוריות (2) ו (5) קריטריונים ספציפיים קיימים עבור סיווג CTC. לקטגוריה (2), פריטים עם CK העמום / DAPI יכולים להיות מסווגים כCTCs ובלבד שקרום שלם ניתן לצפות בערוץ CK ותמונת DAPI בגודל המתאים הוא ציין. לקטגוריה (5), פריטים עם CK pixelated / DAPI לא יכולים להיות מסווגים כCTCs אם בכלל pixelation הוא ציין בערוץ CK. עם זאת, pixelation מקובל בערוץ DAPI ובלבד שזה לא חמור מדי (כלומר, תמונה היא לגמרי לבנה על רקע, אין שטחים אפורים - שתוארו על ידי Janssen אבחון (לשעבר Veridex) כצבע לבן על רקע שחור) או מפוזר (חייבים עדיין מופיע בצורת אליפסה ולהשתלב בתוך CK).
מוגדר משתמש מרקר Assay פיתוח
עיבוד של CSS לאפיין CTCs לסמנים המוגדר על ידי משתמש דורש לעבוד למעלה משמעותיים עם בקרות מחמירות וכבר תאר בעבר 16. ככלל, אופטימיזציה מתאימה של כל סמן מוגדר על ידי משתמש דורשת כי בקרות שליליות להיות מועסקות על מנת להבטיח כי תוצאות הן ספציפיות. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר דגימות זינקו מעובדות עם שניהםשליטת IgG ספציפי במקום של נוגדן היעד ועם מדלל הנוגדנים לבד כפי שתואר לעיל. ריכוזי נוגדני היעד שונים וזמני חשיפה גם צריכים להיות מוערכים ומאומתים באמצעות שורות תאים עם צפיפות אנטיגן גבוהה, נמוכה, ונעדר (שלילית). תנאי פרוטוקול אופטימליים מושגות כאשר assay מדגים גם רגישות גבוהה לאנטיגן היעד ורעש רקע נמוך מספציפי מחייב 16.
דוגמא לכך עבודתו של דבר באמצעות סמן תא גזע סרטני, CD44, מוצגת כאן. בדיקות ראשוניות עם סמן זה החלו להשתמש בערכה סטנדרטית CSS CTC (המכונה את ערכת CTC המסורתית להלן), אשר מנצלת את ערוץ FITC לפיתוח סמן מוגדר על ידי משתמש. השימוש בערכת CTC המסורתית, זה היה הוכיח כי, לאחר אופטימיזציה משמעותית, את המספר המרבי של CTCs שיכול להיות מסווג כCD44 + היה 69.3 ± 2.67% באמצעות דגימות מתובלות 1,000 הומא מד"א-MB-468n תאי סרטן שד, המכונים להפגין ביטוי CD44 גבוה עם רוב של תאים (98.4 ± 0.90%; כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה) לבטא חלבון זה (איור 2 א). בהתבסס על ממצאים אלו ששער כי ערכת CSS CXC זמינה המסחרית עשויה להניב תוצאות משופרות. ערכה זו מאפשרת הדמיה משופרת של סמנים עם צפיפות נמוכה יותר אנטיגן (~ 50,000 אנטיגנים / תא) בהשוואה לערכת CTC המסורתית (מותאמת לסמנים עם צפיפות של ~ 100,000 אנטיגנים / תא) על ידי היפוך ערוץ הקרינה בי CK8 / 18/19 (מיוצג באופן מסורתי בערוץ PE) וסמן העניין של המשתמש (המיוצג באופן מסורתי בערוץ FITC) מיוצגים (ולכן להלן ערכת CXC יהיה מכונה ערכת CTC צפיפות אנטיגן הנמוכה) 26. אחרי אופטימיזציה משמעותי, זה היה הוכיח כי שינוי זה אפשר לצביעת CD44 משופרת, עם 98.8 ± 0.51% מCTCs סווג כCD44 + </ Sup> באמצעות CD44-PE בריכוז של 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר וזמן חשיפה של 0.6 שניות (איור 2 א). אופטימיזציה המתאימה של כל סמן משתמש מוגדר גם דורשת אימות באמצעות צפיפות הגבוהה אנטיגן (מד"א-MB-468), צפיפות נמוכה אנטיגן (21 NT), ו( LNCaPs) שורות תאים שליליות לסמן של עניין (איור 2).
ניתוח CTC במודלים פרה מאוס
כדי לקבוע את הרגישות וסגוליות של פרוטוקול CSS עכבר המותאם, ממוסמר (1,000 תאי סרטן ערמונית אנושית LNCaP) ודגימות דם עכבר unspiked עובדו באופן ידני ונסרקו במכשיר הניתוח ובהשוואה לתוצאות שהושגו תוך שימוש באותה שורת תאי מעובד באמצעות התקן פרוטוקול CSS אוטומטי על (איור 3 א) מכשיר הכנה. כצפוי, דגימות unspiked היו חופשיות של CTCs באמצעות שני מבחני, 0.00 ± 0.00% והתאוששות CTC באמצעות הערכה המותאמת עכבר (90.8 ± 5.18%) לא הייתה שלשונה ignificantly מתוצאות שהושגו באמצעות המערכת האוטומטית סטנדרטית (86.9 ± 4.71%, p> 0.05). תמונות המתקבלות באמצעות פרוטוקול העכבר הידני המותאם לא היו שונות מאלו שנצפו בטכניקה האוטומטית הסטנדרטי, למעט התוספת של סמן HLA-FITC. בנוסף, תאי אפיתל קשקש עכבר לא ללכלך באופן חיובי לHLA-FITC (איור 3 ב). כדי לוודא שטכניקה זו הייתה רגישה כמו פרוטוקול ה-CSS הסטנדרטי לבידוד של מספר הנמוך של CTCs, דילולים סדרתי בוצעו עם דגימות דם ממוסמר והמתאם של מספר הצפוי של תאים לעומת מספר התאושש של תאים הוערך (איור 3 ג). תוצאות מראות כי CTCs יכול להיות יעיל התאושש עד לרגישות של 5 cells/50 μl של דם מלא באמצעות assay. ערכים אלה בקורלציה עם תוצאות צפויות עם r = 2 0.99.
איור 2. אפיון של CTCs לסמנים המוגדר על ידי משתמש באמצעות CSS. () אחוז מהתאים שסווג כCD44 + באמצעות ערכות CTC וCXC ב-CSS (n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *** = שונה באופן משמעותי (P <0.0005). (ב ') תמונות בגלריה CSS נציג של דם מתורם בריא מתנדב (7.5 מיליליטר), מהולות ב~ 1,000 תאים משורת התאים המזוהים, הודגרו עם 1.5 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי -CD44-PE, ונסרק בזמן חשיפה של 0.2 שניות. ריבועים כתומים מעידים על CD44 + </ Sup> CTCs שנוצר כCK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. עיבוד של הליך CSS לשימוש במודלים של עכברים פרה של גרורות. () התאוששות CTC באמצעות פרוטוקול CSS עכבר המותאם נמדד כאחוז ממספר התאים ממוסמר ובהשוואה לתוצאות שהושגו באמצעות פרוטוקול CSS האנושי הרגיל. תאים נספרו על ידי hemocytometer ו ~ 1,000 תאי סרטן ערמונית אנושית LNCaP היו ממוסמרים ל7.5 מיליליטר של דם אנושי. דגימות דם אדם Unspiked שימשו כביקורת שלילית (n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ns = לא משמעותי. (B) (ג) ניתוח של מתאם ורגרסיה ליניארית של ציפה לעומת מספר התאושש של תאים סרטניים ממוסמר בריכוזים שונים . תאי סרטן ערמונית אנושיים LNCaP תחילה נספרו על ידי hemocytometer וזנקו לאחר מכן לתוך דם עכבר בריכוז של ~ 1,000 cells/50 גידול μl של דם. דם עכבר ממוסמר היה אז באופן סדרתי מדולל לריכוז של μl cells/50 5 גידול ועיבוד באמצעות פרוטוקול העכבר המותאם CSS (n = 3). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| # של דוגמאות עם הגדרת משתמש מרקר נוסף | סה"כ Voluלי הוסף למגיב גביע (μl) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1,050 |
| 6 | 1,200 |
| 7 | 1,350 |
| 8 | 1,500 |
טבלת 1. . דרישות נפח כוללות עבור CSS בעת עיבוד מספרים שונים של דגימות עם סמן מוגדר על ידי משתמש ** מעובד מתוך Veridex הלבן (זמין בכתובת: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות ההתפתחות של טכנולוגיות רבות CTC חדשים מאז כניסתה של CSS ב2004, טכניקה זו היא עדיין הטכנולוגיה שאושרה קליני רק על השוק היום, ולכן זה נחשב תקן הזהב הנוכחי לאיתור CTC ופקידה. כתב היד הזה הוכיח שלמרות שיש לו את CSS תקני בקרת איכות קפדניים זה יכול להיות כפוף להטית פרשנות וכי זיהוי CTC בדגימות מטופל הוא שונה בהרבה מזיהוי בדגימות ממוסמר. שש קטגוריות של פריטים נפוצים סותרים זוהו שיכול לגרום misclassifications CTC להתרחש. פריטים סותרים אלה מדגישים את הצורך במספר בודקים בכל דגימת מטופל מעובד במכשיר זה. בנוסף, ההבדלים שנצפו בממוסמר מול המטופל מתקבלים CTCs מוכיחים כי יש הכרח לכל טכנולוגיות חדשות CTC להיות תוקף בשתי דגימות ממוסמרות ומטופל. בנוסף, טכנולוגיות חדשות אלה חייבים bדואר בהשוואה לCSS תקן זהב באמצעות בדיקת דגימה מפוצלת של שני דגימות ממוסמר וסבלניות, כמו לכידת CTC יעילה מדגימות ממוסמר רק שאינה משקפת בהכרח את היעילות הלכידה CTC בדגימות מטופל.
למרות CSS יש את היכולת לבצע אפיון של CTCs שנתפס, הוא מוגבל למדי בכל הקשור לאופטימיזציה של התאמה אישית. באופן כללי, הפרמטרים היחידים שניתן לשנות במכשיר זה לאופטימיזציה של סמנים המוגדר על ידי משתמש הם ריכוז נוגדנים ואת משך הזמן שfluorophore חשוף למנורת הכספית. קיבולת מוגבלת זו לאופטימיזציה יכולה להציג בעיות כאשר עובד למעלה סמנים מוגדרים למשתמש על CSS. אחד פתרונות שהוצעו בכתב היד הזה (שתוארו בפירוט 16 בעבר) הוא השימוש בערכת CTC צפיפות אנטיגן הנמוך אשר עוברת FITC וערוצי ניאון PE מאפשרים הדמיה טובה יותר של סמנים עם צפיפות אנטיגן נמוכה. לא משנהשהערכה היא מנוצל (ערכת CTC צפיפות אנטיגן מסורתית או נמוכה) יש כמה צעדים הדרושים שצריך להיעשות כדי להבטיח רגישות סמן המתאימה, סגוליות, ואופטימיזציה. ראשית, רגישות assay יש להעריך, בהשוואה לשיטה תוקף היטב, כגון cytometry זרימה, שתאפשר קביעת רמת זיהוי הצפויה (כלומר אחוז התאים באוכלוסיית התא שמבטאים את הסמן של ריבית) של המשתמש סמן מוגדר. שנית, assay יש להעריך ביכולתה לזהות את הסמן של עניין בשורות תאים עם רמות שונות של ביטוי (כלומר צפיפות גבוהה ונמוכה אנטיגן) והסגוליות שלה חייב להיות מאומת בשורת תאים שהיא שלילי עבור הסמן של עניין . בכל המקרים, בכל שורות התאים חייבות להיבדק באמצעות שליטת תאים בלבד (ללא נוגדנים הוסיפו), הבקרה המתאימה IgG, והנוגדנים של עניין בריכוזים שונים ובזמני חשיפה על מנת לקבוע את מוהגדרות מתאימות st שיבטיחו אופטימיזציה של הסמן מוגדר על ידי המשתמש. עם זאת, יש לציין כי למרות שהאפיון של CTCs אפשרי על CSS, כרגע רק אחד סמן מוגדר על ידי משתמש של עניין יכול להיחקר במדגם זה, ושהמערכת מוגבלת מאוד בכל הקשור ליישומים במורד הזרם בשל העיבוד הקשה של הדגימות.
הגישה לצד המיטה להמעבדתיים הייחודית מנוצל במחקר CTC אפשרה לכניסה מהירה של assay זה שימושי להגדרה הקלינית. עם זאת, הביא בהבנה לקויה של הביולוגיה הבסיסית של תאים הנדירים אלה. לכן הפיתוח ואופטימיזציה של מבחני המאפשרים הערכה של CTCs בפרה בעכברי מודל vivo של הסרטן יש צורך. כתב יד זה מתאר פרוטוקול CSS מותאם המאפשר לCTCs תוערך 50 כרכי μl דם עכבר, מתאימים באופן אידיאלי למודלים ניסויי אוסף CTC סדרתי. ד כתב היד הזהemonstrates שספירת CTC שימוש בפרוטוקול זה היא דומה לתוצאות שהתקבלו באמצעות CSS בשילוב עם ערכת CTC המסורתית, ללא הבדלים משמעותיים ביעילות הלכידה CTC בין טכניקות הפרדה האוטומטיות וידניות. בנוסף, במהלך הפיתוח של assay זה זה היה מוכר, כפי שתואר בעבר בספרות 25, כי זיהום תא עכבר קשקש האפיתל יכול לעשות זיהוי מדויק של CTCs יותר קשה ולפעמים בלתי אפשרי. לכן כדי להילחם בבעיה זו HLA-Alexa פלואוריד בהגדרת משתמש 488 התווסף לפרוטוקול זה כדי להבטיח שרק תאים אנושיים (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa פלואוריד 488 +) נמצאים שהוקצו כראוי כCTCs. חשוב לציין כי שורת תאי LNCaP שימוש בכתב היד הזה היא HLAlow ולכן HLA-Alexa פלואוריד 488 ייתכן שיהיה הצורך טיטרציה לשורות תאים עם ביטוי HLA שונה. אמנם יש לנו הוספתי Fluo HLA-Alexar 488 לפרוטוקול שלנו על מנת להבטיח זיהוי מדויק של CTCs, ראוי לציין כי רובם המכריע של תאי אפיתל קשקש עכבר היו לזיהוי בקלות על ידי מורפולוגיה והיו מוגבלים במספר תאים (0.33 ± 0.24 events/50 μl, n = 9). מספרי תא גבוהים יותר (עד 11 events/50 μl) נצפו רק כאשר איסוף דם (דרך לנקב לב) היה קשה וניסיונות חוזרים ונשנים היו נחוצים. לכן אנו מציעים כי אם רוצים, אפיון של CTCs במערכת יכול להתבצע על ידי השמטת סמן זה. בנוסף, למרות שאינם מתואר כאן, אנו צופים כי אוסף של CTCs ואפיון נוסף במורד הזרם של CTCs בשיטות אחרות יכול להיות המושגת בקלות כפי שהודגם באמצעות CSS 27,28 בעבר.
למרות CSS נוצל קליני כדי לזהות ביעילות CTCs בדם של שד גרורתי, סרטן ערמונית וחולי סרטן מעי גס 4,10,29, אך יש לה כמה limitations. בעד 35% מהחולים עם סרטן גרורתי שונים, CTCs הוא לגילוי למרות הנוכחות של מחלה מערכתית הנרחבת 30. זה חוסר זיהוי הוצע להיות כתוצאה ממעבר אפיתל לmesenchymal, תהליך מתועד היטב הידוע כדי לשפר את פלישת סרטן, גרורות, ואגרסיביות כללית ביום 31. מעבר זה כבר קשור לירידה משמעותית בסמני אפיתל, כגון EpCAM, וגידול מקביל בmesenchymal סמני 32. מספר מחקרים הראו לאחרונה כי הנוכחות של סמני mesenchymal אלה בCTCs מעידות על פרוגנוזה גרועה יותר, וכי רבים של תאים אלה חוסר ביטוי של סמני אפיתל שיהיה צורך לגילוי שלהם באמצעות CSS 24,33-38. הדבר מצביע על כך את הגדרת ה-CSS הסטנדרטי עלולה להיות חסר חלק מCTCs האגרסיבי ביותר.
למרות המגבלות שתוארו, זה ה צפויפרוטוקולי דואר שתוארו בכתב היד הזה יהיו כלי חשוב לניתוח CTC השתפר באמצעות CSS, הפיתוח של טכנולוגיות חדישות CTC, אופטימיזציה של סמנים המוגדר על ידי משתמש, והבנה משופרת של הביולוגיה CTC שימוש במודלים של עכברים פרה vivo. יחדיו, פרוטוקולים אלה יספקו משאב שימושי עבור משתמשים בפלטפורמה זו מתעניינת במחקר פרה קליני הנוגע לגרורות וCTCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר (ALA) זכה למימון שהועמד על ידי Janssen אונקולוגיה, אשר חברה האם של חברת Johnson & Johnson גם בעלי Janssen אבחון LLC, אשר מייצר ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו לחקר הסרטן (# 08NOV230), קרן קנדה עבור חדשנות (# 13199), סרטן ערמונית קנדה, Janssen אונקולוגיה, התכנית למלחמה בסרטן האזורית בלונדון, ותמיכת תורמים מג'ון ודונה בריסטול דרך קרן לונדון למדעי בריאות (לALA). LEL נתמך על ידי בנטינג פרדריק ומלגות לתארים מתקדמים צ'רלס בסט קנדה דוקטורט פרס. ALA נתמך ניו פרס חוקר CIHR ופרס חוקר מוקדם ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות על ידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
