Summary
As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.
Abstract
A maioria das mortes relacionadas ao câncer ocorrem subseqüente para o desenvolvimento da doença metastática. Este estádio da doença altamente letal está associada com a presença de células tumorais (CTCs) circulante. Estas células raras foram demonstrou ser de relevância clínica em mama metastático, próstata e colorretal. O atual padrão ouro na detecção clínica CTC e enumeração é o sistema CellSearch aprovado pela FDA (CSS). Este manuscrito descreve o protocolo padrão utilizado por esta plataforma, bem como dois protocolos adicionais adaptados que descrevem o processo detalhado de optimização marcador definido pelo utilizador para a caracterização da proteína de CTC paciente e um protocolo similar para o CTC captura em volumes muito baixos de sangue, usando o padrão reagentes de estilo CSS, para estudar em modelos de ratos pré-clínicos in vivo de metástase. Além disso, as diferenças de qualidade entre CTC sangue doador saudável enriquecida com células de cultura de tecidos contra samp sangue do pacienteles são realçados. Finalmente, vários itens comumente discrepantes que podem levar a erros de classificação do CTC são delineadas. Tomados em conjunto, estes protocolos irá fornecer um recurso útil para os utilizadores desta plataforma interessados em pesquisa pré-clínica e clínica pertencente a metástase e CTCs.
Introduction
Em 2013 estima-se que 580.350 pessoas morrerão de câncer e que 1.660.290 novos casos da doença serão diagnosticados nos Estados Unidos sozinho 1. A maioria das mortes ocorrem subsequente ao desenvolvimento da doença metastática 2. A atual falta de terapias eficazes no tratamento de metástases e uma compreensão limitada da cascata metastática faz nesta fase da doença altamente letal. A presença de células tumorais circulantes (CTCs) na corrente sanguínea tem sido demonstrada estar correlacionada com doença metastática 3. Estas células são extremamente raros e a sua detecção é indicativo de sobrevida de mama metastático 4, 5 da próstata, colo-rectal e cancro da 6. Nestes pacientes, a presença de ≥ 5 (mama e próstata) ou ≥ 3 (colorectal) CTC em 7,5 ml de sangue é indicativo de um pior prognóstico quando comparado com os pacientes com menos ou nenhuma CTC detectáveis na samvolume de e sangue. Além disso, a alteração no número CTC durante ou após intervenção terapêutica tem sido demonstrado ser úteis como um indicador da resposta ao tratamento, muitas vezes, mais cedo do que as técnicas actualmente utilizadas 7-10.
Estimou-se que, em pacientes com cancro metastático, CTC ocorrem com uma frequência de cerca de 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de sangue e em pacientes com doença localizada, essa frequência pode ser ainda mais baixa (~ 1: 10 8). A natureza raras dessas células pode tornar difícil a precisão e fiabilidade detectar e analisar CTC 11. Vários métodos (avaliação previamente 12-14) têm sido utilizados para o enriquecimento e detectar estas células através da exploração de propriedades que os diferenciam dos componentes do sangue circundante. Em geral, CTC enumeração é um processo de duas etapas que exige uma etapa de enriquecimento e um passo de detecção. Tradicionalmente, as etapas de enriquecimento de contar com as diferenças de Physpropriedades iCal de CTCs (tamanho da célula, densidade, deformabilidade) ou na expressão de marcador de proteína (ou seja, a molécula de adesão de células epiteliais [EpCAM], citoqueratina [CK]). Seguindo o enriquecimento, a detecção CTC pode ser realizada em um número de maneiras diferentes, sendo o mais comum dos quais são os ensaios baseados em ácidos nucleicos e / ou citometria de abordagens. Cada uma dessas estratégias são únicos, com vantagens e desvantagens, no entanto todos eles não têm padronização; uma necessidade para a entrada no ambiente clínico. O sistema CellSearch (CSS), foi desenvolvido para proporcionar um método normalizado para a detecção e enumeração de CTC raras no sangue humano, através de microscopia de fluorescência e técnicas à base de anticorpos 4-6. Esta plataforma é actualmente considerado o padrão ouro no CTC enumeração e é a única técnica aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA) para uso na clínica 15.
O CSS é um dois consistin plataforma componenteg, (1) o sistema CellTracks Autoprep (doravante referido como o instrumento de preparação), que automatiza a preparação de amostras de sangue humano, e (2) o CellTracks Analyzer II (doravante referido como o instrumento de análise), que analisa estes amostras seguintes preparação. Para distinguir CTC contaminem leucócitos o instrumento de preparação utiliza um anticorpo mediado, separação magnética abordagem baseada em ferrofluido e fluorescência de coloração diferencial. Inicialmente, o sistema de etiquetas CTC, utilizando anticorpos anti-EpCAM conjugados com nanopartículas de ferro. A amostra é então incubada num campo magnético, e todas as células não marcadas são aspirados. Células tumorais seleccionadas são ressuspensos e incubados em um de fluorescência da mancha diferencial, que consiste de anticorpos fluorescentemente marcadas e um reagente de coloração nuclear. Finalmente, a amostra é transferida para um cartucho magnético, chamado um magnest (daqui em diante referido como o dispositivo magnético), e scanned usando o instrumento de análise.
O instrumento de análise é usado para digitalizar amostras preparadas com diferentes filtros de fluorescência, cada um otimizado para a partícula fluorescente apropriado, usando uma lente objetiva de 10X. CTCs são identificadas como células que estão vinculados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), ea mancha nuclear 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Por outro lado, os leucócitos contaminantes são identificadas como células que estão vinculados por anti-CD45-aloficocianina (APC) e DAPI. Após a análise, as células de tumor possíveis definidos por computador são apresentados ao utilizador. A partir dessas imagens, o usuário deve empregar análise qualitativa utilizando os parâmetros definidos e coloração diferencial discutidos acima para determinar quais eventos são CTCs.
Além de fornecer um método padronizado para CTC enumeração, o CSS permite a caracterização molecular de CTCs com base em marcadores de proteínas de interesse. Este interrogatório cum ser efectuada ao nível de uma única célula, utilizando um isotiocianato de fluoresceína (FITC), canal de fluorescência não é necessária para a identificação CTC 16. Embora esta plataforma proporciona a capacidade para a caracterização molecular, o processo detalhado de desenvolvimento do protocolo e optimização não é bem definida. Três marcadores comercialmente disponíveis foram desenvolvidas pelo fabricante para utilização com o EAP, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o crescimento epidérmico humano do receptor do factor 2 (HER2), e factor de crescimento semelhante à insulina-1 receptor (IGF-1R). Análise HER2, em combinação com o CSS, tem sido utilizado por vários grupos para ilustrar o potencial de caracterização CTC para informar a tomada de decisão clínica e mudar potencialmente diretrizes de tratamento existentes. Por exemplo, Fehm et al. 17 demonstraram que aproximadamente um terço dos pacientes com cancro da mama com tumores HER2-primário tinha HER2 + CTC. Além disso, Liu et al.18 informou recentemente que até 50% dos pacientes com HER + câncer de mama metastático HER2 não tinha + CTCs. Herceptin, um receptor HER2 interferindo anticorpo monoclonal demonstraram beneficiar muito a pacientes cujos tumores expressam níveis suficientes de HER2, é um tratamento vulgarmente utilizado para pacientes com tumores HER2 + primárias 19-21. No entanto, esses estudos sugerem que Herceptin pode estar sendo sub-utilizada de forma otimizada e que a caracterização CTC pode ajudar na previsão de resposta ao tratamento. Em última análise, a caracterização CTC pode ter o potencial para melhorar o atendimento personalizado.
Pesquisa CTC é o único que tem em grande parte utilizou uma abordagem de cabeceira-to-de bancada. Este método, ao contrário de bancada-a-cabeceira investigação, que muitas vezes pode levar anos para afetar o atendimento ao paciente, permitiu CTCs entrada rápida no ambiente clínico. No entanto, os médicos hesitam em utilizar os resultados da análise CTC no tratamento do paciente-mak decisãoção, devido a uma falta de compreensão da sua biologia subjacente. Portanto mouse modelos pré-clínicos adequados de técnicas de metástase e análise CTC complementar deve ser utilizado, a fim de investigar essas questões pendentes. Em geral, existem dois tipos de modelos pré-clínicos usados para estudar a cascata metastática, (1) os modelos de metástase espontânea, o que permite o estudo de todos os passos da cascata metastática, e (2) os modelos de metástases experimentais, os quais só permitem o estudo de passos posteriores no processo metastático como extravasamento e a formação do tumor secundário 22. Modelos de metástase espontâneas, envolvem injeções de células tumorais em locais ortotópico apropriadas (por exemplo, injeção de células de câncer de próstata na próstata para o estudo do câncer de próstata). As células são então dado tempo para formar os tumores primários e metástase espontânea para locais secundários, tais como o osso, pulmão, e nódulos linfáticos. Emcontraste, os modelos de metástase experimentais envolvem injeção direta de células tumorais na corrente sanguínea (por exemplo, via veia da cauda ou injeção intracardíaca às células-alvo para locais específicos) e, portanto, ignorar as etapas iniciais de intravasation e disseminação para os órgãos secundários 22. Até agora, a maioria das análises CTC em sistemas modelo in vivo tem sido realizada utilizando qualquer 23 ou adaptados CTC técnicas à base de citometria de base humana (por exemplo, AdnaTest) 24. Embora útil, nenhuma dessas técnicas reflete adequadamente CTC enumeração usando o padrão ouro CSS. Com base na aprovação clínica, natureza padronizada, e o uso generalizado do CSS, o desenvolvimento de uma técnica de captura e detecção do CTC para modelar in vivo que utiliza a preparação da amostra equivalente, processamento, e critérios de identificação seria vantajoso que os resultados sejam comparáveis àqueles obtido a partir de amostras de doentes. No entanto, devido ao volume de requirements do instrumento de preparação não é possível processar pequenas quantidades de sangue, utilizando esta plataforma automatizada. . Além disso, o trabalho anterior por Eliane et al 25 demonstraram que a contaminação das amostras com células epiteliais do mouse (que também se enquadram na definição CTC padrão [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) pode levar a erros de classificação de rato células epiteliais escamosas como CTCs. Para tratar dessas questões de uma técnica adaptada que permite a utilização dos reagentes CSS CTC combinados com um procedimento de isolamento manual foi desenvolvido. A adição de um antigénio de leucócitos humanos marcados com FITC (HLA) de anticorpos para o doseamento permite que as células de tumor humano a ser distinguido de rato células epiteliais escamosas.
Este manuscrito descreve o padrão, desenvolvido comercialmente e protocolo CSS otimizado para o processamento de amostras de pacientes de sangue e armadilhas comuns que podem ser encontrados, incluindo discrepânciast itens que podem levar a erros de classificação do CTC. Além disso, a personalização do ensaio CSS para examinar as características de proteína definida pelo utilizador de CTC capturados e uma técnica CSS comparável adaptado que permite o enriquecimento e a detecção dos CTC de pequenos volumes de sangue de rato, em modelos pré-clínicos de metástases são descritos.
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Protocol
Todos os estudos em humanos descritos neste manuscrito foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa Humana da Universidade Ocidental. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Canadense de Cuidados Animal, no âmbito de protocolos aprovados pela Western University Uso de Animais Subcomissão.
1. Padrão CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes, utilizando o CSS
1. Coleta de sangue humano e Preparação para processamento no Instrumento Preparação
- Usando técnicas de flebotomia assépticas padrão, desenhe um mínimo de 8,0 ml de sangue humano em um tubo de 10 ml CellSave (doravante referido como o tubo de conservante CTC), que contém ácido etileno diamino (EDTA) e um conservante celular proprietária. Inverta os 5x tubo para prevenir a coagulação do sangue. As amostras podem ser processados imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 96 horas.
- REMOÇÃOreagentes e CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar.
- Usando uma pipeta descartável de 10 ml e pipetador automático, recolher 7,5 ml de sangue a partir do tubo de conservante CTC e dispensar lentamente sangue em tubo de um instrumento de processamento de preparação adequadamente rotulado.
- Adicionar 6,5 ml de tampão de diluição de cada amostra. Misture invertendo amostra de 5x. Amostra Centrifugar a 800 xg por 10 minutos com o freio na posição "off". Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar todas as amostras do paciente no sistema para processamento. As amostras devem ser processadas no prazo de 1 hora de preparação.
2. Preparação de Controle de Processamento no Instrumento Preparação
- Suavemente vortex o frasco controle e inverter 5x para misturar.
- Com cuidado, retire a tampa do frasco de controlo e coloque um instrumento tubo processamento preparação invertido em cima do frasco destampado. Em um movimento rápido, inverter acontrolar frasco e despeje o conteúdo para dentro do tubo de processamento. Enquanto invertida, agite delicadamente as laterais do frasco de controlo para liberar qualquer conteúdo remanescente.
- Retire cuidadosamente o frasco de controlo invertido a partir do tubo de processamento, garantindo que nenhum líquido é perdido e colocar de lado. Usando uma pipeta de 1000 mL, recolher qualquer conteúdo restantes do frasco e tampa e pipeta suavemente para dentro do tubo de processamento.
- Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar o controle no sistema para processamento.
3. Digitalização de amostra sobre o Instrumento de Análise
- Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para descarregar todas as amostras do sistema. Vagamente cap cada cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho. Uma vez que todas as bolhas tenham sido removidos, firmemente cobre o cartucho, coloque o dispositivo magnético plana, e euncubate no escuro durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação.
- Ligue o instrumento de análise e inicializar a lâmpada. Depois de aquecida (~ 15 min), coloque o cartucho de verificação do sistema para o instrumento de análise e selecione a guia teste QC. Siga as instruções na tela para executar as medidas de controle de qualidade necessários.
- Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Teste do Paciente. Todas as informações salvas do instrumento de preparação será exibido. Clique em Iniciar para iniciar a digitalização da amostra. O sistema irá realizar um foco grosso e detecção de borda do cartucho dispositivo magnético.
- Ajuste todas as bordas, se necessário, utilizando as teclas direcionais. Selecione Aceitar. O sistema irá realizar um bom foco e iniciar a digitalização da amostra.
- Após a digitalização de controle os resultados devem ser validados utilizando os critérios definidos para as células contaminadas em alta (CK + DAPI + CD45 - APC +) e baixo (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentrações. Após a digitalização de amostra do paciente, os resultados devem ser revistos para CTCs capturados utilizando os critérios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -).
2. CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS
1. Preparação de marcadores definidos pelo usuário e Instrumento de Inicialização
- Diluir o anticorpo de interesse, utilizando ligação primária diluente de anticorpo para a concentração desejada em um copo de reagente marcador através da seguinte fórmula, em que a concentração de trabalho é a concentração do anticorpo após a adição à amostra e a concentração de estoque é a concentração de anticorpo na copo reagente. Para várias amostras, ajustar os volumes de anticorpos, tal como descrito na Tabela 1. Coloque o copo reagente marcador para a posição 1 no cartucho de reagente e lOAD o cartucho para CSS.
Banco de Concentração = (concentração de trabalho x 850 ul) / 150 mL - Recolha de sangue, amostras de preparar, e carregar o instrumento de preparação, tal como descrito acima no padrão CTC Enumeração das amostras de sangue do paciente, utilizando o protocolo de CSS. Para habilitar disso marcador personalizado, selecione Definido pelo usuário Ensaio quando solicitado pelo instrumento de preparação. Digite o nome do marcador e selecione Salvar. Como as amostras são carregados no instrumento, o operador será solicitado a indicar qual deve receber marcador personalizado selecionando Sim ou Não, se necessário.
2. Amostra de digitalização de marcadores definidos pelo usuário sobre o Instrumento de Análise
- Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS
- Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Para inicializar o canal FITC, selecione CellSearch CTC como o ID de Kit na seção Teste de Protocolos. A partir deste menu, selecione CTC Research, clique no botão Editar e defina o tempo de exposição se o desejar. Recomenda-se que um tempo de exposição de 1,0 seg não ser excedido quando se utiliza o kit de CSS CTC como este pode aumentar de passagem de purga para outros canais fluorescentes utilizados para a identificação do CTC.
3. Adaptação do CSSProtocol padrão para uso em pré-clínica do rato Modelos
** Adaptado de Veridex Mouse / Rato CellCapture Kit (não mais disponível no mercado)
1. Rato coleta de sangue e armazenamento
- Antes da recolha de sangue, funcionamento ~ 30 ul de EDTA 0,5 M, para trás e para a frente através de uma agulha G 22, deixando uma pequena quantidade de EDTA no cubo.
- Coletar um mínimo de 50 mL de sangue do rato dos ratos previamente injetados com células tumorais humanas através de rotas ortotópico, veia da cauda, ou intracardíacas. Recolha de sangue a partir da veia safena (para análise CTC série) ou por meio de punção cardíaca (por análise CTC terminal). Remova a agulha e distribuir sangue para a 1 ml EDTA microtainer tubo de coleta de sangue. Misture por inversão ou tubo suavemente movimento para evitar a coagulação do sangue. O sangue pode ser processado imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 48 horas após a adição de um volume igual de CytoChex conservante celular.
2. CTC Enriquecimento
- Remover reagentes CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar.
- Transferir o equivalente de 50 ul de sangue inteiro a um fluxo de 12 milímetros x 75 milímetros de citometria tubo. Adicionar 500 ul de tampão de diluição de cada amostra, lava-se todo o sangue que permanece sobre os lados do tubo. Se necessário, a uma curta rotação centrífugapode ser usado para coletar todo o sangue restante.
- Suavemente vortex o ferrofluido anti-EpCAM e adicionar 25 ul de cada amostra, colocando a ponta da pipeta directamente para a amostra. Adicionar 25 mL de reagente de captura Enhancement e vortex suavemente para misturar. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 min.
- Coloque os tubos de amostras para o ímã e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar.
3. CTC Coloração
- Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 50 mL de ácido nucléico da tintura, 50 ul de reagente de coloração, 1,5 ul de anti-rato de CD45-APC, 5,0 ul de anti-HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ul de permeabilização Reagente. Para várias amostras, estes reagentes podem ser previamente misturados e 206,5 uL de mistura pode ser adicionada a cada tubo. Vortex suavemente para misturare incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
- Adicionar 500 mL de tampão de diluição, vortex suavemente, tubos lugar de amostra para o ímã, e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar. Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 350 ul de tampão de diluição. Vortex suavemente para misturar.
4. Magnetic dispositivo de carregamento
- Utilizando uma ponta de carregamento de gel, transferir cuidadosamente a totalidade do volume do tubo de ensaio para um cartucho no dispositivo magnético. Comece na parte inferior do cartucho e retirar lentamente a ponta medida que a amostra é distribuída.
- Uma vez que toda a amostra foi transferida, vagamente cobre o cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho, conforme descrito no Section 3.1 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS.
- Pop quaisquer bolhas utilizando uma agulha esterilizada 22 G, aprisionando-entre o bisel e o bordo do cartucho. Uma vez que todas as bolhas de ter sido removido, firmemente cobre o cartucho, colocar o dispositivo magnético plana, e incubar no escuro durante pelo menos 10 min. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação.
5. Digitalização de amostras separadas manualmente sobre o Instrumento de Análise
- Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes que utilizam o protocolo CSS.
- Coloque a amostra no instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Limpe todos os dados existentes sobre o botão de dados do dispositivo magnético, clicando no botão Formatar da Amostra. Ativar o canal a FITCª definir o tempo de exposição a 1,0 seg, como descrito na Seção 2.2 do CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS.
- Clique na aba teste do paciente e selecione Editar para inserir a informação da amostra. Selecione CellSearch CTC como o ID de Kit e CTC Research como o Protocolo de Teste. Insira as informações necessárias permanecendo como indicado como o asterisco. Salve as informações da amostra e clique em Iniciar.
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Representative Results
Padrão CTC enumeração Assay
A sensibilidade e especificidade do CSS tem sido bem documentada na literatura. No entanto, para validar a recuperação CTC equivalente, cravado (1.000 LNCaP células cancerosas da próstata humana) e amostras de sangue humano não enriquecido de doadores voluntários saudáveis foram processados no CSS usando o protocolo CSSCTC padrão. Como esperado, as amostras não enriquecido estavam livres dos CTC, 0,00 ± 0,00%, e a recuperação do CTC mostrou ser 86,9 ± 4,71% para amostras enriquecidas (Figura 1A). Galeria de CSS imagens obtidas a partir de amostras fortificadas eram de ótima qualidade e CTCs eram fáceis de distinguir de não-CTCs. No entanto, durante o processamento de amostras obtidas a partir de pacientes de cancro, a identificação de CTC é um pouco mais difícil, com muitas células que aparecem mais pequenos em tamanho e ser menos facilmente distinguível de não-CTC (Figura 1B). Além disso, ao analisar amostras de pacientes seis categorias de eventos foram identified que eram itens comumente discrepantes entre os revisores (Figura 1C). Estas seis categorias incluídas, (1) pequenos eventos que não cumpriram a exigência de tamanho 4 mm para classificação CTC, (2) itens com CK fraca e / ou coloração DAPI; (3) justificado (deve ser contado como um CTC) versus injustificada (não deve ser contado como um CTC) sangrar através no canal CD45-APC causada pela brilhante coloração CK-PE; (4) FITC + eventos; (5) imagens pixeladas na CK e / ou canais de DAPI, e (6) eventos coloração com DAPI, que é maior do que as imagens de CK ou com coloração DAPI que não se sobrepõem> 50% da imagem com CK. Para as categorias (2) e (5) os critérios específicos existem para classificação CTC. Para a categoria (2), os artigos com fraca CK / DAPI pode ser classificada como CTC, desde que uma membrana intacta pode ser observado no canal de CK e umaDAPI imagem de tamanho apropriado é anotado. Para a categoria (5), com itens CK pixelizada / DAPI não pode ser classificado como CTC, se qualquer pixelação é observada no canal de CK. No entanto, pixelização é aceitável no canal DAPI, desde que não seja muito grave (ou seja, imagem é inteiramente branco sobre um fundo, há zonas cinzentas - descritas por Janssen Diagnostics (anteriormente Veridex) como tinta branca sobre um fundo preto) ou difusa (must ainda aparecem de forma oval e caber dentro da CK).
Marcador de Ensaio Desenvolvimento User-Defined
Adaptação do CSS para caracterizar CTCs para os marcadores definidos pelo usuário exige um trabalho-up significativa com rigorosos controles e tem sido descrito anteriormente 16. Como regra geral, a optimização de qualquer marcador apropriado definido pelo utilizador requer que ser empregues controlos negativos para garantir que os resultados são específicos. Os melhores resultados são obtidos quando as amostras de picos são processados com ambasum controlo de IgG inespecífica no lugar do anticorpo-alvo e com somente o diluente de anticorpo, tal como descrito anteriormente. Várias concentrações de anticorpos alvo e tempos de exposição também deve ser avaliado e validado usando linhas de células com altos, baixos, e ausentes (negativos) densidades de antígenos. Condições protocolo ideal são alcançados quando o ensaio demonstra tanto de alta sensibilidade para o antígeno alvo e baixo nível de ruído de fundo de ligação não específica 16.
Um exemplo deste trabalho-up usando um marcador de células-tronco do câncer, CD44, é apresentado aqui. Os testes iniciais com este marcador começou a usar o kit CSS CTC padrão (doravante referido como o kit tradicional CTC), que utiliza o canal FITC para o desenvolvimento marcador definido pelo usuário. Utilizando o kit tradicional CTC, demonstrou-se que, após optimização significativo, o número máximo de CTC que poderiam ser classificados como CD44 + foi de 69,3 ± 2,67%, utilizando amostras contendo 1,000 MDA-MB-468 human células de cancro da mama, conhecidos para demonstrar a expressão elevada de CD44 com a maioria das células (98,4 ± 0,90%; como determinado por citometria de fluxo) que expressam esta proteína (Figura 2A). Com base nestes resultados foi a hipótese de que o kit de CSS CXC disponível no mercado pode produzir melhores resultados. Este kit permite uma melhor visualização de marcadores com uma densidade de antigénios menor (~ 50.000 antigénios / célula) em comparação com o kit tradicional CTC (optimizado para os marcadores com uma densidade de ~ 100.000 antigénios / célula) através da inversão do canal de fluorescência em que o CK8 / 18/19 (tradicionalmente representado no canal PE) e marcador do utilizador de interesse (tradicionalmente representado no canal FITC) são representados (por conseguinte, daqui em diante o kit CXC será referido como o kit CTC baixa densidade de antigénio) 26. Após a otimização significativa, demonstrou-se que essa mudança permitiu uma melhor coloração CD44, com 98,8 ± 0,51% de CTCs classificados como CD44 + </ Sup> usando CD44-PE, numa concentração de 1,0 mg / ml e um tempo de exposição de 0,6 segundos (Figura 2A). Otimização adequada de qualquer marcador definido pelo usuário também exige a validação usando alta densidade de antígeno (MDA-MB-468), baixa densidade de antigénio (21 NT), e (LNCaPs) linhas de células negativas para o marcador de interesse (Figura 2B).
Análise CTC em pré-clínica do rato Modelos
Para determinar a sensibilidade e especificidade do protocolo CSS rato adaptado, cravado (1000 LNCaP de células de cancro da próstata humano) e as amostras de sangue não enriquecido ratinho foram transformadas manualmente e digitalizado no instrumento de análise e comparação com os resultados obtidos utilizando a mesma linha de células transformadas utilizando a norma CSS protocolo automatizado na preparação instrumento (Figura 3A). Como esperado, as amostras não enriquecido estavam livres dos CTC, utilizando ambos os ensaios, 0,00 ± 0,00% e recuperação CTC usando o kit de rato adaptado (90,8 ± 5,18%) não foi significantly diferentes dos resultados obtidos com o sistema automatizado normal (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). As imagens obtidas utilizando o rato protocolo adaptado manual não diferiram das observadas utilizando a técnica automatizada padrão, com a excepção de a adição do marcador de HLA-FITC. Além disso, células epiteliais escamosas de ratinho não mancham positivamente para o HLA-FITC (Figura 3B). Para confirmar que esta técnica era tão sensível como o protocolo padrão do CSS para o isolamento de baixo número de CTC, diluições em série foram realizadas com amostras de sangue perfurantes e a correlação da quantidade esperada de células versus o número de células recuperado foi avaliada (Figura 3C). Os resultados demonstram que o CTC pode ser efectivamente recuperado até uma sensibilidade de 5 células/50 ul de sangue total usando este ensaio. Estes valores correlacionados com os resultados esperados com um r 2 = 0,99.
Figura 2. Caracterização de CTCs para os marcadores definidos pelo usuário usando o CSS. (A) porcentagem de células classificadas como CD44 + usando os kits de CTC e CXC no CSS (n = 3). Os dados são apresentados como a média ± SEM. *** = Significativamente diferente (P <0,0005). (B) Representante imagens da galeria CSS de sangue de um doador voluntário saudável (7,5 ml), cravado com ~ 1.000 células da linhagem de células identificadas, incubadas com 1,5 mg / ml de anti -CD44-PE, e digitalizado em um tempo de exposição de 0,2 seg. Quadrados laranja indicam CD44 + </ Sup> CTCs, identificado como CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Adaptação do processo CSS para utilização em modelos pré-clínicos de rato de metástase. (A) recuperação CTC, utilizando o protocolo de CSS rato adaptado medida como uma percentagem do número de células enriquecidas e comparados com os resultados obtidos utilizando o protocolo de CSS humano padrão. As células foram contadas pelo hemocitómetro e ~ 1000 LNCaP de células de cancro da próstata humano foram misturados em 7,5 ml de sangue humano. As amostras de sangue humano não enriquecido foram usadas como um controlo negativo (n = 3). Os dados são apresentados como a média ± SEM. ns = não significativo. (B) (C) Análise de correlação e regressão linear do esperado versus o número recuperado de células tumorais cravado em várias concentrações . As células de cancro da próstata humano LNCaP foram inicialmente contados pelo hemocitómetro e subsequentemente cravado no sangue do rato a uma concentração de ~ 1000 células/50 ul de sangue do tumor. Sangue cravado rato foi então diluído em série a uma concentração de 5 mL tumor células/50 e processados usando o protocolo do mouse adaptado CSS (n = 3). Clique aqui para ver imagem ampliada.
| N. º de amostras com User Defined marcador Adicionado | Total Volume para Adicionar ao Reagente Cup (mL) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Tabela 1. Requisitos. Volume total para o CSS ao processar vários números de amostras com um marcador definido pelo usuário ** Adaptado do Livro Branco Veridex (disponível em: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
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Discussion
Apesar do desenvolvimento de muitas novas tecnologias CTC desde a introdução da CSS em 2004, esta técnica ainda é a única tecnologia clinicamente aprovado hoje no mercado e, portanto, é considerada o padrão ouro atual para a detecção e enumeração CTC. Este manuscrito demonstrou que embora o CSS tem padrões de controle de qualidade rigoroso que pode estar sujeito a viés de interpretação e que a identificação CTC em amostras de pacientes é muito diferente de identificação em amostras enriquecidas. Foram identificados seis categorias de itens vulgarmente discrepantes que podem causar erros de classificação do CTC para ocorrer. Esses itens discrepantes destacar a necessidade de vários revisores em cada amostra processados neste instrumento. Além disso, as diferenças observadas no cravado contra paciente obtidos CTCs demonstra que existe uma necessidade para todas as novas tecnologias de CTC para serem validados em ambas as amostras enriquecidas e paciente. Além disso, essas novas tecnologias deve be em comparação com o CSS padrão ouro usando o teste da amostra dividida de ambos amostras enriquecidas e paciente, como captura CTC eficiente de amostras fortificadas só não reflecte necessariamente CTC eficiência de captura de amostras do paciente.
Embora o CSS tem a capacidade de realizar uma caracterização de CTCs capturados, é bastante restrito com relação a otimização altamente personalizável. Em geral, os únicos parâmetros que podem ser alterados no instrumento para a optimização de marcadores definidos pelo utilizador são a concentração de anticorpos e a duração de tempo em que o fluoróforo é exposto a uma lâmpada de mercúrio. Esta capacidade limitada para a otimização pode apresentar problemas quando se trabalha-se marcadores definidos pelo usuário no CSS. Uma solução proposta neste manuscrito (descrito em detalhe anteriormente 16) é a utilização do kit CTC baixa densidade de antigénio, que muda a FITC e PE canais fluorescentes que permitem uma melhor visualização de marcadores com uma baixa densidade de antigénio. Independentementedo qual kit é utilizado (kit CTC densidade do antígeno tradicional ou baixa) há várias etapas necessárias que devem ser tomadas para garantir a sensibilidade marcador apropriado, especificidade e otimização. Em primeiro lugar, a sensibilidade do ensaio tem de ser avaliada, em comparação com um método bem validada, tal como a citometria de fluxo, que vai permitir a determinação do nível de detecção do que o esperado (isto é, a percentagem de células na população de células que expressam o marcador de interesse) do utilizador- marcador definido. Em segundo lugar, o ensaio deve ser avaliado quanto à sua capacidade de detectar o marcador de interesse em linhas de células com diferentes níveis de expressão (isto é, densidades altas e baixas de antigénio) e da sua especificidade deve ser validado de uma linha de células que é negativa para o marcador de interesse . Em todos os casos, todas as linhas de células devem ser testados usando um só células de controlo (sem anticorpo adicionado), a IgG de controlo apropriado, e o anticorpo de interesse em várias concentrações e tempos de exposição para determinar o moconfigurações apropriadas st que irão garantir a otimização do marcador definido pelo usuário. No entanto, deve notar-se que, embora a caracterização de CTC é possível no CSS, actualmente apenas um marcador definido pelo utilizador de interesse pode ser explorada em cada amostra, e que o sistema é muito limitados no que diz respeito às aplicações a jusante, devido ao tratamento severo das amostras.
A abordagem única de cabeceira-para-bancada utilizada na pesquisa CTC tem permitido para a entrada rápida deste ensaio útil para a prática clínica. No entanto, isso resultou em uma inadequada compreensão da biologia básica dessas células raras. Por isso são necessários o desenvolvimento e otimização de ensaios que permitem a avaliação de CTCs no pré-clínica em modelos in vivo de ratos com câncer. Este manuscrito descreve um protocolo CSS adaptado que permite CTCs de ser avaliado em 50 volumes ul de sangue de camundongos, ideal para coleta de CTC de série modelos experimentais. Este manuscrito demonstrates que enumeração CTC usando esse protocolo é comparável aos resultados obtidos usando o CSS em combinação com o kit tradicional CTC, sem diferenças significativas no CTC eficiência de captura entre as técnicas manuais e automatizados de separação. Além disso, durante o desenvolvimento deste ensaio, foi reconhecido, tal como anteriormente descrito na literatura, 25, que rato escamosas contaminação de células epiteliais pode fazer uma identificação precisa dos CTC mais difícil e por vezes impossível. Portanto, para combater este problema de um user-defined HLA-Alexa Fluor 488 foi adicionada a este protocolo para garantir que apenas as células humanas (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) estão sendo adequadamente atribuído como CTCs. É importante observar que a linhagem celular LNCaP utilizado neste manuscrito é HLAlow e, por conseguinte, o HLA-Alexa Fluor 488 podem ter de ser ajustadas para as linhas de células com diferentes expressão de HLA. Embora nós adicionamos uma HLA-Alexa Fluor 488 para o nosso protocolo para garantir a identificação exata de CTCs, é de salientar que a grande maioria de rato células epiteliais escamosas eram facilmente identificáveis pela morfologia e foram limitados no número de células (0,33 ± 0,24 events/50 mL, n = 9). Número de células mais elevadas (até 11 events/50 ul) só foram observados quando a coleta de sangue (via punção cardíaca) revelou-se difícil e repetidas tentativas foram necessárias. Portanto, propomos que, se desejado, a caracterização no sistema de CTC pode ser realizada por omitindo este marcador. Além disso, embora não descritos aqui, prevemos que a recolha do CTC e caracterização adicional a jusante do CTC usando outros métodos podem ser facilmente conseguido como demonstrado anteriormente usando o CSS 27,28.
Embora o CSS tem sido utilizada clinicamente para detectar eficazmente CTCs no sangue de mama metastático, de próstata e pacientes com câncer colorretal 4,10,29, ele tem vários limitations. Em até 35% dos pacientes com vários tipos de câncer metastático, CTCs são indetectáveis apesar da presença de doença sistêmica generalizada 30. Esta falta de detecção tem sido proposto para ser como um resultado da transição epitelial-mesenquimal a-, um processo bem conhecido para melhorar documentado invasão do cancro, metástase, agressividade e em geral 31. Esta transição tem sido associada com uma redução significativa em marcadores epiteliais, tais como EpCAM, e um aumento correspondente na mesenquimais marcadores 32. Vários estudos demonstraram recentemente que a presença destes marcadores mesenquimais CTC são indicativos de prognóstico reservado, e que muitas destas células não ter expressão de marcadores epiteliais que seriam necessários para a sua detecção utilizando o CSS 24,33-38. Isto sugere que a definição CSS padrão pode estar faltando algumas das CTCs mais agressivos.
Apesar das limitações descritas, é antecipado the protocolos descritos neste manuscrito serão ferramentas importantes para uma melhor análise CTC usando o CSS, desenvolvimento de tecnologias inovadoras CTC, otimização de marcadores definidos pelo usuário, e uma melhor compreensão da biologia CTC usando em modelos de ratos pré-clínicos in vivo. Tomados em conjunto, estes protocolos irá fornecer um recurso útil para os utilizadores desta plataforma interessados em pesquisa pré-clínica e clínica pertencente a metástase e CTCs.
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Disclosures
O autor (ALA) recebeu financiamento que foi fornecida pelo Janssen Oncologia, cuja empresa-mãe Johnson & Johnson também possui Janssen Diagnostics LLC, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Ontário de Pesquisa do Câncer (# 08NOV230), a Fundação Canadense para Inovação (# 13199), o cancro da próstata Canadá, Janssen Oncologia, o Programa Regional Cancer Londres, e apoio de doadores de John e Donna Bristol através Fundação Londres Ciências da Saúde (para ALA). LEL é apoiado por uma Frederick Banting e Charles Best Canadá Scholarship Award de Pós-Graduação de Doutorado. ALA é apoiado por uma CIHR New Investigator Award e um Prêmio Pesquisador Precoce do Ministério da Investigação e Inovação Ontário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
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