Summary
Cirkulerande tumörceller (CTCs) är prognostiska i flera metastaserande cancer. Detta manuskript beskriver guldmyntfoten Cellsearch systemet (CSS) CTC uppräkning plattform och höjdpunkter gemensamma klassificeringsfel fel. Dessutom är två anpassade protokoll beskrivs för användardefinierad markör karakterisering av CTCs och CTC uppräkning i prekliniska musmodeller av metastaser med hjälp av denna teknik.
Abstract
Huvuddelen av cancerrelaterade dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom. Denna mycket dödlig sjukdom steg är förknippat med förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs). Dessa sällsynta celler har visat sig vara av klinisk signifikans i metastaserande bröst-, prostata-och kolorektal cancer. Den nuvarande guldmyntfot i klinisk CTC detektering och räkning är FDA-godkänt Cellsearch systemet (CSS). Detta manuskript beskriver standardprotokoll som används av denna plattform samt ytterligare två anpassade protokoll som beskriver den detaljerade processen för användardefinierad markör optimering för proteinkarakterisering av patient CTCs och ett jämförbart protokoll för CTC fånga i mycket låga volymer av blod, med vanliga CSS-reagens, för att studera in vivo prekliniska musmodeller av metastaser. Dessutom kan skillnader i CTC kvalitet mellan frisk givare blod spetsades med celler från vävnadskultur kontra patientblod samples är markerade. Slutligen, finns flera allmänt avvikande poster som kan leda till CTC klassificeringsfel fel beskrivs. Sammantaget kommer dessa protokoll utgör en användbar resurs för användare av denna plattform är intresserade av preklinisk och klinisk forskning avseende metastaser och CTCs.
Introduction
År 2013 beräknas det att 580.350 personer kommer att dö i cancer och att 1.660.290 nya fall av denna sjukdom kommer att diagnostiseras i USA ensamt 1. De flesta av dessa dödsfall inträffar efter utveckling av metastatisk sjukdom 2. Den nuvarande bristen på effektiva behandlingar vid behandling av metastaser och en begränsad förståelse för metastaserande kaskad gör detta skede av sjukdomen mycket dödlig. Förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs) i blodomloppet har visat sig korrelera med metastaserad sjukdom 3. Dessa celler är extremt sällsynta och deras upptäckt är ett tecken på total överlevnad vid metastaserande bröstcancer 4, prostata 5, och kolorektal 6 cancer. Hos dessa patienter, ≥ 5 (bröst och prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod är förekomsten av tecken på sämre prognos jämfört med patienter med färre eller inga detekterbara CTCs i same blodvolym. Dessutom har förändringen av CTC antal under eller efter terapeutisk behandling visat sig vara användbar som en prediktor för behandlingssvar, ofta tidigare än för närvarande utnyttjas tekniker 7-10.
Det har uppskattats att det i metastaser cancerpatienter, CTCs inträffar med en frekvens på ca 1 CTC per 10 5 -10 7 mononukleära blodceller och hos patienter med lokaliserad sjukdom, kan denna frekvens vara ännu lägre (~ 1 i 10 8). Den sällsynta karaktären av dessa celler kan göra det svårt att exakt och pålitligt upptäcka och analysera CTCs 11. Flera metoder (omdömet tidigare 12-14) har använts för att berika och upptäcka dessa celler genom att utnyttja egenskaper som skiljer dem från omgivande blodkomponenter. I allmänhet är CTC uppräkning en process i två delar som kräver både en anrikningssteg och ett detekteringssteg. Traditionellt anrikningssteg är beroende av skillnader i fystiska egenskaper CTCs (cellstorlek, densitet, deformerbarhet) eller på proteinmarkör expression (dvs. epitelial celladhesionsmolekyl [EpCAM], cytokeratin [CK]). Efter anrikning kan CTC detektering utföras på ett antal olika sätt, är den vanligaste av dessa är nukleinsyra-baserade analyser och / eller cytometrisk tillvägagångssätt. Var och en av dessa strategier är unika, med olika fördelar och nackdelar, men de alla saknar standardisering, en nödvändighet för inträde i klinisk miljö. Den Cellsearch systemet (CSS) har därför utvecklats för att ge en standardiserad metod för detektion och räkning av sällsynta CTCs i blod med hjälp av fluorescensmikroskopi och antikroppsbaserade metoder 4-6. Denna plattform är för närvarande anses vara den högsta standarden inom CTC uppräkning och är den enda teknik som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för användning i kliniken 15.
CSS är en tvåkomponents plattform consisting, (1) den CellTracks autoprep.-systemet (nedan kallad framställning instrument), som automatiserar framställning av humana blodprov, och (2) den CellTracks Analyzer II (i det följande kallad analys instrument), som läser av dessa prov efter beredning. För att skilja CTCs förorenar leukocyter beredningen Instrumentet är en antikroppsmedierad, ferrofluid baserad magnetisk separation strategi och differentialfluorescensfärgning. Initialt märker systemet CTCs använda anti-EpCAM antikroppar konjugerade till järn nanopartiklar. Provet inkuberas sedan i ett magnetfält, och alla omärkta celler aspireras. Valda tumörcellerna återsuspenderas och inkuberas i en differential fluorescens fläck, som består av fluorescensmärkta antikroppar och en nukleär färgning reagens. Slutligen provet överfördes till en magnetisk patron, som kallas en MagNest (hädanefter kallad den magnetiska anordningen) och scanned använder analysinstrumentet.
Analysinstrumentet används för att skanna framställda proverna med användning av olika fluorescensfilter, vart och ett optimerat för att den lämpliga fluorescerande partikel, med användning av ett 10X objektiv. CTCs identifieras som celler som är bundna av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fykoerytrin (PE) (CK8, 18, och 19), och den nukleära fläck 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Omvänt är kontaminerande leukocyter identifierade som celler som är bundna av anti-CD45-allofykocyanin (APC) och DAPI. Efter skanning, är datordefinierade potentiella tumörceller presenteras för användaren. Från dessa bilder, måste användaren använda kvalitativ analys med hjälp av de definierade parametrar och differentialfärgning som diskuterats ovan för att bestämma vilka händelser är CTCs.
Förutom att ge en standardiserad metod för CTC räkning, gör CSS för molekylär karakterisering av CTCs baserad på proteinmarkörer av intresse. Detta förhör cen utförs vid encelliga nivå, med användning av en fluorescein-isotiocyanat (FITC) i fluorescenskanal krävs inte för CTC identifiering 16. Även denna plattform ger kapaciteten för molekylär karakterisering, den detaljerade processen för protokollutveckling och optimering är inte väldefinierad. Tre kommersiellt tillgängliga markörer har utvecklats av tillverkaren för användning med CSS, inklusive epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2) och insulin-liknande tillväxtfaktor 1-receptor (IGF-1R). HER2-analys i kombination med CSS, har utnyttjats av flera grupper för att belysa potentialen för CTC karakterisering att informera kliniskt beslutsfattande och att eventuellt ändra befintliga behandlingsriktlinjer. Exempelvis Fehm et al. 17 visade att ungefär en tredjedel av bröstcancerpatienter med HER2-primära tumörer hade HER2 + CTCs. Dessutom Liu et al.18 rapporterade nyligen att upp till 50% av patienter med HER + metastaserad bröstcancer inte hade HER2 + CTCs. Herceptin, en HER2-receptorn störande monoklonal antikropp visat att kraftigt gynna patienter vars tumörer uttrycker tillräckliga nivåer av HER2, är en vanligen använd behandling för patienter med HER2 + primära tumörer 19-21. Dessa studier tyder på att Herceptin kan vara sub-utnyttjas optimalt och att CTC karakterisering kan hjälpa till att förutsäga behandlingssvar. I slutändan kan CTC karakterisering har potential att förbättra personlig vård.
CTC forskning är unikt genom att det i stort sett utnyttjat en säng-till-bänk strategi. Denna metod, till skillnad från bänk till sängen forskning, som ofta kan ta år att påverka patientvården, har gjort CTCs snabbt inträde i klinisk miljö. Men läkarna är tveksamma till att använda resultaten från CTC-analys i patientbehandling beslutsfattning på grund av en brist på förståelse för den underliggande biologin. Därför lämpliga prekliniska musmodeller av metastaser och kompletterande CTC analystekniker måste utnyttjas för att undersöka dessa utestående frågor. Generellt finns det två typer av prekliniska modeller som används för att studera metastaser kaskad, (1) spontan metastaser modeller, som möjliggör studier av alla steg i metastaserande kaskad, och (2) experimentella metastaser modeller, som endast tillåter studiet av senare steg i metastaserande process, såsom extravasation och sekundära tumörbildning 22. Spontan metastas modeller, involverar tumörcellinjektioner i lämpliga orthotopic platser (t.ex. insprutning av prostatacancerceller i prostatakörteln för studien av prostatacancer). Cellerna ges sedan tid att bilda primära tumörer och spontant metastasera till sekundära platser såsom ben, lungor och lymfkörtlar. IDäremot experimentella metastaser modeller innebär direkt injektion av tumörceller i blodet (t.ex. via svansvenen eller intrakardiell injektion till målceller till specifika platser) och därmed hoppa över de inledande stegen i intravasation och spridning till sekundära organ 22. Hittills majoriteten av CTC-analys i in vivo modellsystem har utförts med hjälp av antingen cytometry-baserade 23 eller anpassade CTC tekniker mänskliga baserade (t.ex. AdnaTest) 24. Även användbar, ingen av dessa tekniker återspeglar adekvat CTC uppräkning med hjälp av guldmyntfoten CSS. Baserat på den kliniska godkännande, standardiserad karaktär, och utbredd användning av CSS, skulle utvecklingen av en CTC fånga och upptäcka teknik för in vivo-modeller som använder provberedning motsvarande, bearbetning, och kriterier för identifiering vara fördelaktigt eftersom resultaten skulle vara jämförbara med dem erhölls från patientprover. Men på grund av den volym requirements av preparatets instrument är det inte möjligt att behandla små volymer av blod med hjälp av denna automatiserad plattform. . Dessutom har tidigare arbetet med Eliane et al 25 visade att kontaminering av prover med musen epitelceller (som också uppfyller standarden CTC definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan leda till felaktig klassificering av mus skivepitelcancer epitelceller som CTCs. För att hantera dessa frågor en anpassad teknik som möjliggör utnyttjandet av CSS CTC kitreagenser i kombination med en manuell isoleringsförfarande utvecklades. Tillsättning av en FITC-märkt human leukocyt antigen (HLA) antikroppen till analysen möjliggör humana tumörceller som skall särskiljas från mus skvamösa epitelceller.
Detta manuskript beskriver standard kommersiellt utvecklats och optimerats CSS protokoll för bearbetning av patientens blodprov och vanliga fallgropar som kan uppstå, inklusive discrepant ex som kan leda till CTC klassificeringsfel fel. Dessutom är anpassning av CSS-analysen för att undersöka användardefinierade proteinegenskaper fångade CTCs och jämförbar anpassade CSS-teknik som gör det möjligt för anrikning och detektion av CTCs från små volymer av blod i prekliniska djurmodeller för metastaser beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier på människa som beskrivs i detta manuskript utfördes under protokoll som godkänts av Western University s Human forskningsetik Board. Samtliga Djurstudier har utförts i enlighet med rekommendationerna från det kanadensiska rådet om Animal Care, enligt protokoll som godkänts av Western University Animal Användning utskottet.
1. Standard CTC Uppräkning från patientblodprover med CSS
1. Människoblod Provtagning och förberedelse för bearbetning för upprättande Instrument
- Med användning av standard aseptiska flebotomi tekniker, rita ett minimum av 8,0 ml av blod in i en 10 ml CellSave rör (nedan kallat CTC konserveringsmedel rör), som innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och en egen cellulär konserveringsmedel. Vänd röret 5x för att hindra blodet från att levra. Prov kan behandlas omedelbart eller lagras vid rumstemperatur under upp till 96 timmar.
- Avtagbare CSS reagenser från kylskåpet och låt dem värmas upp till rumstemperatur innan den används.
- Med hjälp av en engångs 10 ml pipett och automatiserad pipett, samla in 7,5 ml blod från CTC konserveringsmedel röret och långsamt dosera blod i en lämpligt märkt preparat instrumentbehandling röret.
- Lägg till 6,5 ml av utspädningsbuffert till varje prov. Blanda genom att vända prov 5x. Centrifugera provet vid 800 xg under 10 minuter med broms i läge "off". Följ instruktionerna på skärmen om förberedelserna instrumentet för att ladda alla patientprover på systemet för bearbetning. Proverna skall behandlas inom 1 timme av förberedelser.
2. Kontroll Förberedelse för bearbetning för upprättande Instrument
- Vortexa försiktigt kontrollflaskan och vänd 5x att blanda.
- Ta försiktigt bort locket från injektionsflaskan kontroll och placera en inverterad förberedelse instrumentbearbetningsröret ovanpå den icke-begränsade flaskan. I en snabb rörelse, inverterakontrollera flaskan och häll innehållet i behandlingsröret. Medan inverterad, knacka försiktigt sidorna av kontrollflaskan så att all innehåll.
- Ta försiktigt injektionsflaskan kontroll från behandlingsröret för att garantera att ingen vätska går förlorad och lägg åt sidan. Med hjälp av en 1000 l pipett, samla alla kvarvarande innehållet från flaskan och locket och försiktigt pipettera i behandlingsröret.
- Följ instruktionerna på skärmen om förberedelserna instrument för att ladda kontrollen in i systemet för bearbetning.
3. Sample Scanning på analysinstrumentet
- Följ instruktionerna på skärmen om förberedelserna instrumentet för att lasta av alla prover från systemet. Löst lock varje magnetisk enhet kassett och knacka den magnetiska enheten med hjälp av händer eller lab bänk för att släppa några bubblor som fastnat på kanterna på kassetten. När alla bubblor har tagits bort, fast mössa patronen, lägg den magnetiska enheten platt, och jagncubate i mörker under åtminstone 20 minuter vid rumstemperatur. Proverna skall skannas inom 24 timmar av förberedelser.
- Slå på analysinstrumentet och initiera lampan. En gång värmde (~ 15 min), ladda systemverifiering kassetten på analysinstrumentet och välj fliken QC-test. Följ instruktionerna på skärmen för att utföra de åtgärder som krävs för kvalitetskontroll.
- Ladda ett prov på analysinstrumentet och välj fliken Patient Test. All sparad information från beredningen instrumentet kommer att visas. Klicka på Start för att initiera provskanning. Systemet kommer att utföra en grov fokus och kantdetektering på den magnetiska enheten kassetten.
- Justera alla kanter efter behov med hjälp av riktningsknapparna. Välj Godkänn. Systemet kommer att utföra en fin fokus och börja provskanning.
- Efter kontroll skanna resultaten ska valideras med hjälp av de fastställda kriterierna för celler spetsade på hög (CK + DAPI + CD45 - APC +) och låg (CK + DAPI + CD45 - FITC +) koncentrationer. Efter patientprov skanna resultaten bör ses över för fångade CTCs använder de definierade CTC kriterier (CK + DAPI + CD45 -).
2. CTC Karaktärisering för användardefinierade Markörer med hjälp av CSS
1. Beredning av användardefinierade Markörer och instrument Initiering
- Späd antikroppen av intresse med användning av Bond Primary Antibody Diluent till den önskade koncentrationen i ett markörreagens kopp med hjälp av följande formel, där arbetskoncentration är koncentrationen av antikroppen efter tillsats till provet och beståndet koncentration är den koncentration av antikropp i reagens cup. För flera prover, justera antikropps volymer som beskrivs i tabell 1. Placera markören reagens cup i läge 1 i reagenspatronen och load patronen på CSS.
Förrådskoncentration = (arbetskoncentration x 850 | il) / 150 | il - Samla blod, förbereda prover, och ladda beredningen instrument som beskrivs i ovanstående standard CTC Uppräkning från patientblodprover med hjälp av CSS-protokollet. För att aktivera anpassade markör Dessutom väljer du Användardefinierad analys när du uppmanas av beredningen instrumentet. Input markören namnet och välj Spara. Eftersom proverna laddas på instrumentet, kommer operatören att bli ombedd att ange vilka bör få anpassade markör genom att välja Ja eller Nej vid behov.
2. Sample Scanning av användardefinierade Markörer på analysinstrumentet
- Slå på analysinstrumentet, initiera lampan, och utföra kvalitetskontroll och systemverifiering som beskrivs i avsnitt 3.2 i standarden CTC Uppräkning från patientblodprover med hjälp av CSS
- Ladda ett prov på analysinstrumentet och välj fliken Inställningar. För att initiera FITC kanalen väljer du Cellsearch CTC som Kit-ID under testprotokoll avsnittet. Från den här menyn väljer CTC Research, klicka på knappen Redigera och ställ in exponeringstiden efter önskemål. Det rekommenderas att en exponeringstid på 1,0 sek inte överskridas vid användning av CSS CTC kit eftersom detta kan öka genomblödning i andra fluorescerande kanaler som används för CTC identifiering.
3. Anpassning av standard CSSProtocol för användning i preklinisk Mouse Models
** Anpassad från Veridex mus / råtta CellCapture Kit (inte längre finns i handeln)
1. Mus Blood Insamling och lagring
- Före bloduppsamling, kör ~ 30 | il av 0,5 M EDTA och tillbaka genom en 22 G nål, vilket lämnar en liten mängd EDTA i navet.
- Samla minst 50 pl mus blod från möss som tidigare injicerats med humana tumörceller via orthotopic, svans ven eller intrakardiella vägar. Samla blod från vena saphena (för serie CTC-analys) eller genom hjärtpunktion (för terminal CTC-analys). Avlägsna nålen och dispensera blod in i en 1 ml EDTA Microtainer bloduppsamlingsrör. Blanda genom inversion eller knacka försiktigt röret för att förhindra att blodet levrar sig. Blod kan behandlas omedelbart eller lagras vid rumstemperatur under upp till 48 h efter tillsats av en lika stor volym CytoChex cellulär konserveringsmedel.
2. CTC Anrikning
- Ta bort CSS-reagens ur kylskåpet och låt dem värmas upp till rumstemperatur innan den används.
- Överför ekvivalent av 50 ^ il helblod till ett 12 mm x 75 mm flödescytometri rör. Tillsätt 500 ul av utspädningsbuffert till varje prov, tvätta ner något blod som finns kvar på sidorna av röret. Vid behov kan en kort centrifug spinnkan användas för att samla in eventuella kvarvarande blod.
- Vortexa försiktigt på anti-EpCAM ferrofluiden och tillsätt 25 | il av varje prov genom att placera spetsen på pipetten direkt in i provet. Tillsätt 25 l av Capture Enhancement reagens och skaka försiktigt för att blanda. Inkubera proverna i rumstemperatur i 15 minuter.
- Placera provrören i magneten och inkubera under 10 min. Medan provrören är fortfarande i magneten, använd en glaspipett för att försiktigt suga ut restvätska utan att vidröra väggen av röret intill magneten och kasta.
3. CTC Färgning
- Avlägsna provrören från magneten och återsuspendera i 50 jil av nukleinsyra Dye, 50 | il färgningsreagens, 1,5 | il av anti-mus-CD45-APC, 5,0 | il av anti-human-HLA-Alexa Fluor 488, och 100 | il av Permeabilization Reagens. För flera prover kan dessa reagens förblandas och 206,5 | il av blandningen kan tillsättas till varje rör. Vortex försiktigt för att blandaoch inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Tillsätt 500 ul av utspädningsbuffert, vortex försiktigt plats provrör in i magneten, och inkubera under 10 min. Medan provrören är fortfarande i magneten, använd en glaspipett för att försiktigt suga ut restvätska utan att vidröra väggen av röret intill magneten och kasta. Avlägsna provrören från magneten och resuspendera i 350 l av spädningsbuffert. Vortex försiktigt för att blanda.
4. Magnetisk Device Loading
- Med hjälp av en gel lastning tips, töm hela volymen från provröret i en patron i den magnetiska enheten. Börja i botten av patronen och långsamt dra tillbaka spetsen medan provet utmatas.
- När hela provet har överförts, löst lock den magnetiska enheten kassetten och tryck på den magnetiska enheten med hjälp av händer eller lab bänk för att släppa några bubblor som fastnat på kanterna av patronen enligt beskrivningen i Avsnitn 3.1 i standarden CTC Uppräkning från patientblodprover med hjälp av CSS.
- Pop alla bubblor med en steril 22 G nål genom att fånga dem mellan avfasning och kanten på kassetten. När alla bubblor har avlägsnats, stadigt cap patronen bestämmer den magnetiska anordningen platt, och inkubera i mörker under minst 10 min. Proverna skall skannas inom 24 timmar av förberedelser.
5. Skanning av Manuellt Separerade Prover på analysinstrumentet
- Slå på analysinstrumentet, initiera lampan, och utföra kvalitetskontroll och systemverifiering som beskrivs i avsnitt 3.2 i standarden CTC Uppräkning från patientblodprover med hjälp av CSS-protokollet.
- Ladda provet på analysinstrumentet och välj fliken Inställningar. Ta bort eventuella befintliga data på magnetiska enheten uppgifter knapp genom att klicka på Format Sample knappen. Aktivera FITC-kanalen ennd ställa in exponeringstiden till 1,0 sek som beskrivs i avsnitt 2.2 i CTC Karaktärisering för användardefinierade Markörer med hjälp av CSS.
- Klicka på fliken Patient Test och välj Redigera för att mata in stickprovsinformation. Välj Cellsearch CTC som Kit-ID och CTC forskning som testprotokollet. Mata in återstående nödvändig information som anges som asterisken. Spara provet och klicka på Start.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standard CTC Enumeration Assay
Känsligheten och specificiteten hos CSS är väl dokumenterade i litteraturen. Men för att validera motsvarande CTC återhämtning, spetsade (1.000 LNCaP mänskliga prostatacancerceller) och ospetsade humana blodprover från friska frivilliga givare behandlades på CSS med hjälp av standard CSSCTC protokollet. Som väntat ospetsade prover var fria från CTCs, 0,00 ± 0,00%, och CTC återhämtning visade sig vara 86,9 ± 4,71% för spetsade prover (Figur 1A). CSS galleri bilder som kommer från spetsade prover var av bästa kvalitet och CTCs var lätta att skilja från icke-CTCs. Men, när de behandlar prover från cancerpatienter, är identifiering av CTCs något mer utmanande, med många celler som förekommer mindre i storlek och är mindre lätt att skilja från icke-CTCs (Figur 1B). Dessutom, när man ser över patientprover 6 kategorier av händelser var identified som var allmänt avvikande objekt mellan granskare (Figur 1C). Dessa 6 kategorier ingår, (1) små händelser som inte uppfyller kravet på 4 ìm storlek för CTC klassificering, (2) objekt med dim CK och / eller DAPI färgning, (3) berättigad (bör räknas som en CTC) kontra omotiverad (bör inte räknas som en CTC) blöda igenom i CD45-APC-kanal som orsakas av ljus CK-PE färgning, (4) FITC + händelser, (5) pixelated bilder i CK och / eller DAPI kanaler, och (6) händelser med DAPI-färgning som är större än CK bilder eller de med DAPI-färgning som inte överlappar> 50% med CK bilden. För kategorierna (2) och (5) särskilda kriterier för CTC klassificering. Till kategorin (2), kan objekt med dim CK / DAPI klassificeras som CTCs förutsatt att ett intakt membran kan observeras i CK-kanal och enlämplig storlek DAPI bild noteras. För kategori (5), objekt med pixelated CK / DAPI kan inte klassificeras som CTCs om någon pixelering observeras i CK-kanalen. Dock är pixele acceptabelt i DAPI kanalen förutsatt att det inte är för svår (dvs. bilden är helt vit, bakgrund, inga gråzoner - beskrivs av Janssen Diagnostics (tidigare Veridex) som vit färg på en svart bakgrund) eller diffus (måste fortfarande visas ovalt och passa inom CK).
Användardefinierad Marker Assay Development
Anpassning av CSS för att karakterisera CTCs för användardefinierade markörer kräver betydande upparbetning med rigorösa kontroller och har beskrivits tidigare 16. Som en allmän regel, lämplig optimering av alla användardefinierade markör krävs att negativa kontroller utnyttjas för att säkerställa att resultaten är specifika. De bästa resultaten erhålls när spetsade prover bearbetas med bådeen icke-specifik IgG-kontroll på plats av den avsedda antikroppen och med antikropputspädningsmedlet ensam som tidigare beskrivits. Olika koncentrationer målet antikropps och exponeringstider bör också bedömas och valideras med hjälp av cellinjer med hög, låg, och frånvarande (negativa) antigen tätheter. Optimala protokollförhållanden uppnås när analys demonstrerar både hög känslighet för målantigenet och lågt bakgrundsbrus från icke-specifik bindning 16.
Ett exempel på denna upparbetning med användning av en cancer stamceller markör, CD44, presenteras här. Initial testning med denna markör började använda standardiserade CSS CTC kit (hädanefter kallad den traditionella CTC sats), som använder FITC-kanal för användardefinierad markör utveckling. Med hjälp av den traditionella CTC kit, visades att, efter betydande optimering, det maximala antalet CTCs som kan klassificeras som CD44 + var 69,3 ± 2,67% med hjälp av prov spetsat med 1.000 MDA-MB-468 human bröstcancerceller, kända för att uppvisa hög CD44-expression med majoriteten av cellerna (98,4 ± 0,90%, bestämt genom flödescytometri) som uttrycker detta protein (Figur 2A). Baserat på dessa resultat var det en hypotes att den kommersiellt tillgängliga CSS CXC kit kan producera förbättrade resultat. Detta kit medger förbättrad visualisering av markörer med en lägre antigendensitet (~ 50.000 antigener / cell) i jämförelse med den traditionella CTC kit (optimerad för markörer med en densitet av ~ 100.000 antigener / cell) genom omkastning av fluorescens kanal i vilken CK8 / 18/19 (traditionellt representerad i PE-kanalen) och användarens markör av intresse (traditionellt representerad i FITC-kanal) är representerade (alltså härefter CXC kit kommer att kallas den låga antigentätheten CTC kit) 26. Efter betydande optimering, visades det att denna ändring är tillåten för förbättrad CD44 färgning, med 98,8 ± 0,51% av CTCs klassificeras som CD44 + </ Sup> med CD44-PE vid en koncentration av 1,0 mikrogram / ml och en exponeringstid på 0,6 sek (Figur 2A). Lämplig optimering av alla användardefinierade markör kräver också validering med hjälp av hög antigentäthet (MDA-MB-468), låg antigen densitet (21 NT), och negativa (LNCaPs) cellinjer för markören av intresse (Figur 2B).
CTC Analys i preklinisk Mouse Models
För att bestämma känsligheten och specificiteten av den anpassade musen CSS-protokollet, spetsade (1.000 LNCaP mänskliga prostatacancerceller) och ospetsade mus blodprover behandlas manuellt och scannas på analysinstrumentet och jämföras med resultat som erhållits med hjälp av samma cellinje bearbetas med standarden automatiserad CSS-protokollet om förberedelserna instrumentet (Figur 3A). Som väntat ospetsade prover var fria från CTCs med båda analyserna, 0,00 ± 0,00% och CTC återhämtning med hjälp av den anpassade musen kit (90,8 ± 5,18%) var inte significantly annorlunda resultat som erhållits med standard automatiserade system (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). Bilder som erhålls med den manuella musen anpassat protokoll skilde sig inte från de som observerats med hjälp av standard automatiserade tekniken, med undantag för tillägget av HLA-FITC markör. Dessutom behöver mus skvamösa epitelceller fläckar inte positivt för HLA-FITC (fig 3B). För att bekräfta att denna teknik var så känsligt som standard CSS-protokollet för isolering av låga antalet CTCs, var seriespädningar utförs med spetsade blodprov och korrelationen av förväntade antalet celler kontra återvunna antal celler utvärderades (figur 3C). Resultaten visar att CTCs effektivt kan återvinnas ner till en känslighet på 5 celler/50 pl av helblod med hjälp av denna analys. Dessa värden korrelerade med förväntade resultat med ett r 2 = 0,99.
Figur 2. Karakterisering av CTCs för användardefinierade markörer med hjälp av CSS. (A) Andel celler klassificeras som CD44 + med CTC och CXC satser på CSS (n = 3). Data presenteras som medelvärdet ± SEM. *** = Signifikant olika (P <0,0005). (B) Representativa CSS galleri bilder av blod från en frisk frivillig givare (7,5 ml) spetsades med ~ 1000 celler från den identifierade cellinje, inkuberades med 1,5 | ig / ml av anti -CD44-PE, och scannas vid en exponeringstid på 0,2 sek. Orange rutor indikerar CD44 + </ Sup> CTCs, identifierats som CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Anpassning av CSS förfarandet för användning i prekliniska djurmodeller för metastaser. (A) CTC återhämtning med hjälp av den anpassade musen CSS protokoll mätt i procent av antalet spetsade celler och jämförelse med resultat som uppnåtts med hjälp av standard mänskliga CSS protokoll. Cellerna räknades med hemocytometer och ~ 1000 LNCaP humana prostatacancerceller spetsades in i 7,5 ml av humant blod. Ospetsade humana blodprover användes som en negativ kontroll (n = 3). Data presenteras som medelvärdet ± SEM. ns = ej signifikant. (B) (C) Analys av korrelation och linjär regression av den förväntade kontra återvunna antal spetsade tumörceller vid olika koncentrationer . LNCaP humana prostatacancerceller ursprungligen räknades med hemocytometer och därefter spiked in musblod vid en koncentration av ~ 1000 tumör celler/50 pl av blod. Spiked musblod sedan seriespäddes till en koncentration av 5 tumör celler/50 pl och bearbetas med hjälp av musen anpassade CSS-protokoll (n = 3). Klicka här för att visa en större bild.
| # Av Prover med användardefinierad Marker Lades | Totalt Volumig att Lägg till reagens Cup (pl) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Tabell 1. . Totala volymkrav för CSS vid bearbetning av olika antal prover med en användardefinierad markör ** Anpassad från Veridex vitbok (tillgänglig på: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots utvecklingen av många nya CTC teknik sedan införandet av CSS i 2004, är denna teknik fortfarande den enda kliniskt godkänd teknik på marknaden idag, och därför anses den nuvarande standarden för CTC upptäckt och kvantifiering. Detta manuskript har visat att även om CSS har rigorösa kvalitetskontroll kan det vara föremål för tolkning partiskhet och att CTC identifikation i patientprover är mycket annorlunda från identifiering i spetsade prover. Sex kategorier av allmänt avvikande poster identifierades som kan orsaka CTC felklassificeringar uppstå. Dessa avvikande poster stryker behovet av flera granskare på varje patientprov som behandlas på detta instrument. Dessutom, de skillnader som observerats i spetsiga kontra patienter erhållits CTCs visar att det är en nödvändighet för alla nya CTC teknik som ska valideras i både preparerade och patientprover. Dessutom måste dessa nya tekniker be jämfört med den gyllene standarden CSS med hjälp av split slumpvis provning av både spikade och patientprover, som effektivt CTC fånga från spetsade prover bara inte nödvändigtvis CTC uppsamlingskapacitet i patientprover.
Trots att CSS har förmågan att utföra karakterisering av fångade CTCs, är det ganska begränsat när det gäller mycket anpassningsoptimering. I allmänhet är de enda parametrar som kan ändras om detta instrument för optimering av användardefinierade markörer är antikroppskoncentrationen och den tid som fluoroforen exponeras för kvicksilverlampa. Denna begränsade kapacitet för optimering kan ge problem vid arbete-up användardefinierade markörer på CSS. En lösning som föreslås i detta manuskript (som beskrivs i detalj tidigare 16) är användningen av den låga antigendensitet CTC kit som omkopplar den FITC-och PE fluorescerande kanaler tillåter ett bättre åskådliggörande av markörer med låg antigentäthet. Oavsettvarav kit används (traditionell-eller låg antigen densitet CTC kit) finns det flera nödvändiga åtgärder som måste vidtas för att säkerställa lämplig markör sensitivitet, specificitet, och optimering. För det första måste analyskänslighet utvärderas i jämförelse med en väl validerad metod, såsom flödescytometri, som kommer att möjliggöra bestämning av den förväntade detektionsnivån (dvs. den procentandel av cellerna i cellpopulationen som uttrycker markören av intresse) hos användar definierad markör. För det andra måste analysen utvärderas för sin förmåga att detektera markören av intresse i cellinjer med olika nivåer av expression (dvs. höga och låga antigen tätheter) och dess specificitet skall valideras i en cellinje som är negativt för markören av intresse . I samtliga fall måste samtliga cellinjer testas med hjälp av en celler endast kontroll (ingen antikropp tillsatt), lämplig IgG-kontrollen, och antikroppen av intresse vid olika koncentrationer och exponeringstider för att avgöra most lämpliga inställningar som säkerställer optimering av användardefinierade markör. Det bör dock noteras att även om karakterisering av CTCs finns på CSS, för närvarande endast en användardefinierad markör av intresse kan utforskas i varje prov, samt att systemet är mycket begränsad när det gäller tillämpningar nedströms på grund av den hårda behandling av proverna.
Den unika bedside-till-stationär tillvägagångssätt utnyttjas i CTC forskning har gjort det möjligt för snabb inmatning av denna användbar analys in i den kliniska inställningen. Det har emellertid resulterat i en otillräcklig förståelse av den grundläggande biologin av dessa sällsynta celler. Därför behövs utveckling och optimering av analyser som möjliggör utvärdering av CTCs i preklinisk in vivo musmodeller av cancer. Detta manuskript beskriver ett anpassat CSS-protokoll som gör att CTCs som skall bedömas under 50 ^ volymer mus blod, idealisk för serie CTC insamling experimentella modeller. Detta manuskript demonstrates att CTC uppräkning med hjälp av detta protokoll kan jämföras med resultat som erhållits med hjälp av CSS i kombination med den traditionella CTC kit, med inga signifikanta skillnader i CTC uppsamlingskapacitet mellan automatiska och manuella separationstekniker. Dessutom, under utvecklingen av denna analys är det erkändes, som tidigare beskrivits i litteraturen 25, kan denna mus squamous epithelial kontamination cell gör korrekt identifiering av CTCs svårare och ibland omöjligt. Därför att bekämpa detta problem ett användardefinierat HLA-Alexa Fluor 488 lades till detta protokoll för att säkerställa att endast humana celler (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) håller motsvarande tilldelad som CTCs. Det är viktigt att notera att den LNCaP-cellinjen som användes i detta manuskript är HLAlow och därför HLA-Alexa Fluor 488 kan behöva titreras för cellinjer med olika HLA-expression. Även om vi har lagt till en HLA-Alexa Fluor 488 till våra protokoll för att säkerställa korrekt identifiering av CTCs, är det anmärkningsvärt att den stora majoriteten av mus skivepitelcancer epitelceller var lätta att identifiera genom morfologi och var begränsade i cellnummer (0,33 ± 0,24 events/50 pl, n = 9). Högre cell nummer (upp till 11 events/50 il) observerades endast vid blodinsamling (via hjärtpunktion) visat sig svårt och upprepade försök var nödvändiga. Därför föreslår vi att, om så önskas, om-system karakterisering av CTCs skulle kunna åstadkommas genom att utelämna denna markör. Dessutom, även om det inte beskrivs här, räknar vi med att insamlingen av CTCs och längre nedströms karakterisering av CTCs som använder andra metoder kan lätt uppnås som visat tidigare med hjälp av CSS 27,28.
Trots att CSS har använts kliniskt för att effektivt upptäcka CTCs i blodet av metastaserande bröst-, prostata-och kolorektal cancer patienter 4,10,29, har det flera limitations. I upp till 35% av patienter med olika metastaserande cancer, CTCs är omöjliga att upptäcka trots förekomsten av utbredd systemisk sjukdom 30. Denna avsaknad av detektion har föreslagits att vara som ett resultat av den epiteliala till mesenkymala övergång, en väl dokumenterad process känd för att öka cancerinvasion, metastas, och allmänt aggressivitet 31. Denna övergång har associerats med en signifikant minskning av epiteliala markörer, såsom EpCAM, och en motsvarande ökning av mesenkymala markörer 32. Flera studier har nyligen visat att förekomsten av dessa mesenkymala markörer i CTCs indikerar sämre prognos och att många av dessa celler saknar uttryck av epiteliala markörer som är nödvändiga för deras upptäckt med hjälp av CSS 24,33-38. Detta tyder på att standarden CSS-definitionen kan saknas några av de mest aggressiva CTCs.
Trots de beskrivna begränsningar, är det förväntade the-protokoll som beskrivs i detta manuskript är viktiga verktyg för förbättrad CTC-analys med hjälp av CSS, utveckling av nya CTC teknik, optimering av användardefinierade markörer och ökad förståelse för CTC biologi använder in vivo prekliniska musmodeller. Sammantaget kommer dessa protokoll utgör en användbar resurs för användare av denna plattform är intresserade av preklinisk och klinisk forskning avseende metastaser och CTCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren (ALA) fått finansiering som tillhandahålls av Janssen Oncology, vars moderbolag Johnson & Johnson äger också Janssen Diagnostik LLC, som producerar reagenser och instrument som används i den här artikeln.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for Innovation (# 13199), prostatacancer Kanada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, och givarstödet från John och Donna Bristol genom London Health Sciences Foundation (till ALA). LEL är uppburen av en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA stöds av en CIHR New Investigator Award och en tidig forskare Award från Ontario ministeriet för forskning och innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
