신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대뇌 피질은 함께 네트워크로 의사 결정, 감각 유도 행위 나 메모리 등 많은 높은인지 기능에 대한 책임은 여러 계층의 많은 별개의 세포 유형의 특징입니다. 그러한 복잡한 네트워크의 연결이 이러한 작업을 수행하는 방법을 이해하기 위해, 중요한 단계는 동물인지 관련 태스크를 수행 할 때 우선적으로, 네트워크 내의 각각의 세포 유형의 기능 (또는 전기 활동)을 결정하는 것이다. 또한, 역 대뇌 피질의 네트워크를 설계 할 수 있도록 개별 뉴런의 네트워크와 형태 학적 구조의 해부학 적 구조를 결정하는 것도 중요하다. 현재 사용 가능한 기술 혁신이 기록 된 신경 세포를 식별하는 사후의 가치있는 옵션과 함께 동물 행동, 깨어있는 세포 활동을 기록 할 수 있습니다. 여기, 우리는 기록 작업 potenti을 포함 juxtasomal의 biocytin 라벨링 기술을 보여알은 기존의 패치 피펫을 사용하여 세포 (또는 느슨한 패치) 구성에 못을 박는. juxtasomal 기록 구성, 마취 진정 깨어 헤드 고정, 심지어 자유롭게 움직이는 동물 포함한, 행동 조건에 걸쳐 비교적 안정하고 적용 가능하다. 따라서,이 방법은 각각의 뉴런과 궁극적으로, 전체 대뇌 피질의 저항기의 재건에 동물의 행동 중에 세포 형 특정 활동 전위 스파이크를 연결 할 수 있습니다. 이 비디오 원고에서, 우리는 juxtasomal 구성의 개별 뉴런은 사후 식별 및 형태 학적 재구성을위한 우레탄 마취 쥐에 biocytin으로 표시 할 수있는 방법을 보여줍니다.
서론
네트워크의 연결은 매우 구체적인 형태 및 생리 학적 특성 1-7 특징으로 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 결과적으로, 개별 셀 유형 (예를 들어 볼 Gentet 등. 8 Burgalossi 등. 9) 네트워크 내에서 전문적인 작업을 수행 할 수 있습니다. 우리는 신경 세포의 네트워크를 통해 세포 유형 특정 기능을 이해하기 시작하고 많이 발견되고 아직도있다. 이를 위해 많은 실험실은 생리 학적 매개 변수 1,10-15을 획득 한 한 동일한 신경 인구의 형태 학적 특성의 분석을 허용 실험적인 접근 방식을 구현하고 있습니다. 여기, 우리는 biocytin로 기록 된 신경 세포의 전기 충격과 함께 세포 (따라서 비 침습적) 구성에서 기존의 패치 피펫을 사용하여 전기 생리학 기록을 포함 juxtasomal 라벨링 기술 (16, 17)을 보여줍니다.이 방법의 가장 큰 장점은 비 침습적 자연 개별 신경 세포의 활동 전위 스파이크가 (예 : 투석) 세포의 세포 내 내용을 변경하지 않고 기록을 보장한다는 것입니다. 일렉트로에 이어, juxtasomal 접근 방식은 구조 (형태)에 기능 (생리)을 연결하는 사후 세포 식별 및 재건의 옵션을 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 동물의 준비
모든 실험 절차는 VU 대학 암스테르담, 네덜란드에 현지 윤리위원회는 네덜란드 법에 따라, 평가 후에 실시된다.
- 복강 내 주사 (0.9 % 염화나트륨, 1.6-1.7 g / kg의 20 %) 우레탄 이소 플루 란 (산소 2 ~ 3 %)에이어서 위 스타 쥐 (P25-P45, ♂ / ♀)를 마취. 핀치 철수, 눈꺼풀 반사 및 vibrissae 움직임을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다.
- 경우 우레탄의 추가적인 용량 (초기 용량의 10 %) 투여 동물 충분한 마취 깊이에 도달하지 않거나 vibrissae 기라는 실험 과정 동안 관찰 될 때마다.
- 가열 패드 탑재 고정대에 마취 된 동물을 놓고 직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에서 37.5 ± 0.5 ° C에서 동물의 체온을 유지한다. 고정대에 동물의 머리를 배치, 눈에 보이는 피부를 렌더링하는 가위를 사용하여 머리 꼭대기에 머리를 손질.
- 작업 현장에서 국소 마취를 위해 100 ㎕의 1 % 리도카인 피하 (0.9 % 염화나트륨의)를 주입하고 3-5 분을 기다립니다. 꼬리 - 투 - 주동이의 방향으로 절단하여 두개골의 표면을 덮고있는 피부를 제거하고 남은 조직을 청소합니다. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
개별 신경 세포의 3 차원 구조에 대한 자세한 지식은 신경 네트워크의 조직 원리를 해명 중요합니다. 우리의 방법은 이에 사후 신경 세포의 분류 및 수상 및 높은 해상도에서 단일 신경 세포의 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 허용, 생체 준비에서 높은 품질의 biocytin 라벨을 달성하기 위해 파이프 라인을 포함한다. juxtasomal 라벨의 품질에 따라, 뉴런은 희미한 매우 정확하게 기록 위치에 19, 26에 해당하는 위치에 강렬한 DAB 신호에 이르기까지 다양한 DAB-강도로 복구됩니다. 우리 실험실에서, 숙련 된 실험자 우레탄 마취 설치류 30 ~ 40 %의 성공 속도로 동작한다. 뇌, 2) 우수한 표시 품질을 채워 1) 하나의 뉴런이 하나의 신경 세포가 다음 기준을 충족하는 세 가지 중 실험에 돌기 및 축삭의 재건을 위해 선택되어 있음을 나타냅니다3) biocytin 신호가 축삭 돌기를 따라 일정 4) CYT C의 counterstaining이 신경 세포의 등록을 할 수.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
juxtasomal 방법은 행동 조건에서 하나의 단위에서 생체 활동 전위 급상승에 기록 할 수 있습니다 (마취 깨어 머리를 고정하거나 자유롭게 이동) biocytin-라벨 사후 세포 유형 분류 및 / 또는 3D 재건 기록 된 신경 세포의 옵션. 가장 큰 장점은 세포 (따라서 비 침습적) 구성의 생리 학적 파라미터를 획득하는 것입니다, 아직 biocytin 16,17,32과 세포 내 신경 세포에 라벨을 할 수있는. 라벨링 biocytin 이외에,이 기술은 DNA, RNA, 단백질, 또는 형광 염료 33,34 뉴런을 주입하는데 사용될 수있다. 이 방법의 가장 명백한 단점은 라벨의 시각적 품질 제어 아마도 부족하고 실험 기간 동안 라벨링 품질 검사의 그러므로 결코이다. 그러나, 기록 조건, 특히 활동 전위 모양 라벨링 절차의 성공 여부를 평가하기 위해 사용될 수있다. 채소에 대한전류 펄스 동안 급상승 주파수가 극적으로 증가 할 때 후부, 밀도 b.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
authros는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 PROFS에게 감사의 말씀을 전합니다. 광범위한 지원을위한 Huibert Mansvelder 버트 Sakmann, 유익한 토론 및 기술 지원에 대한 연결을 추적하고, 브렌든 Lodder을 제공하는 박사 마르셀 Oberlaender. 데이터는 관대 R. 브루노 (컬럼비아 대학., NY, USA)에서 제공하는 LabVIEW 용 ntrode VI를 사용하여 획득 하였다. 이 연구는 막스 플랑크 사회와 전산 신경 과학, 튀빙겐에 대한 번스타인 센터에 의해 지원되었다 (독일 연방 교육 연구부 (BMBF 재정 지원, FKZ : 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics 및인지 연구 센터 (CNCR) , 신경 과학 캠퍼스 암스테르담 (NCA), CPJdK (NWO - ALW 번호 822.02.013와 ENC-네트워크 # 1 P3-C3)와 VU 대학 암스테르담에 자금.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SM-6 제어 시스템 | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada 모델 EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| 압전 장치 | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView 수집 소프트웨어 | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi 흡수성 면봉 | Kettenbach | 30601 | |
| 말 심장의 사이토크롬 C | Sigma | C2506 | |
| 소 간의 카탈라아제 | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain 표준 ABC 키트 | 벡터 | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| 우레탄 | 시그마 | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| 리도카인 | 시그마 | L5647 | |
| 심플렉스 급속 치과 시멘트 | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | 시그마 | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| 분석 등급 글리세롤 | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | 시그마 알드리치 | 60130 | |
| CaCl | 시그마 알드리치 | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
참고문헌
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
