Summary
For at forstå strukturen af neuronale netværk, funktionelle og morfologiske karakterisering af individuelle neuroner er en nødvendighed. Her viser vi juxtasomal biocytin mærkning, som gør det muligt for elektrofysiologiske målinger i den ekstracellulære konfiguration, og alligevel bevare evnen til intracellulært mærke neuron til post hoc genopbygning af dendritiske og axonal arkitektur.
Abstract
Hjernebarken er præget af flere lag og mange forskellige celletyper, der sammen som et netværk er ansvarlige for mange højere kognitive funktioner, herunder beslutningstagning, sensorisk-styrede adfærd eller hukommelse. For at forstå hvordan sådanne indviklede neuronale netværk udføre sådanne opgaver, et afgørende skridt er at bestemme funktionen (eller elektrisk aktivitet) af de enkelte celletyper inden for netværket, fortrinsvis når dyret udfører en relevant kognitiv opgave. Derudover er det ligeledes vigtigt at bestemme den anatomiske struktur af nettet og den morfologiske arkitektur af de enkelte neuroner til at tillade reverse engineering kortikale netværk. Tekniske gennembrud til rådighed i dag tillade optagelse cellulære aktivitet i vågen, opfører dyrene med værdifuld mulighed for post hoc identificere de optagede neuroner. Her vil vi demonstrere juxtasomal biocytin mærkning teknik, som indebærer optagelse handling potential spiking i det ekstracellulære (eller løs-patch) konfiguration ved hjælp af konventionelle patch pipetter. Den juxtasomal optagelse konfiguration er relativt stabil og anvendelse på tværs af adfærdsmæssige forhold, herunder bedøvet, bedøvet, vågen hoved-faste, og selv i frit bevægelige dyr. Således er denne metode tillader forbinder celletypespecifik handling potentiale spiking under dyrs adfærd til genopbygning af de enkelte neuroner og i sidste ende, det hele kortikale mikrokredsløb. I denne video manuskript, viser vi, hvordan enkelte neuroner i juxtasomal konfiguration kan mærkes med biocytin i urethan-bedøvede rotte til post-hoc identifikation og morfologisk rekonstruktion.
Introduction
Neuronale netværk består af flere celletyper, karakteriseret ved meget specifikke morfologiske og fysiologiske egenskaber 1-7. Som en konsekvens, individuelle celletyper udføre specialiserede opgaver inden for netværket (se f.eks Gentet et al. 8 og Burgalossi et al. 9). Vi er kun lige begyndt at forstå celletype-specifikke funktioner på tværs af neuronale netværk og meget er stadig at blive opdaget. Til dette formål er der mange laboratorier gennemførelse eksperimentelle metoder, der tillader analyse af morfologiske egenskaber af den samme neuronale population hvorfra fysiologiske parametre er opnået 1,10-15. Her viser vi juxtasomal mærkningsteknik 16,17 som involverer elektrofysiologiske målinger ved anvendelse af konventionelle patch pipetter i det ekstracellulære (og dermed noninvasive)-konfiguration i kombination med elektroporation af den optagede neuron med biocytin. Denstor fordel ved denne fremgangsmåde er, at ikke-invasiv karakter sikrer, at virkningspotentiale spiking af individuelle neuroner er optaget uden at ændre (fx dialyse) det intracellulære indhold af cellen. Efterfulgt af elektroporation, giver juxtasomal tilgang mulighed for post hoc identifikation og genopbygning celle til at linke funktion (fysiologi) til struktur (morfologi). Typisk morfologisk rekonstruktion indebærer genopbygning af dendritiske og axonal morfologi, som kan udvides til kvantificering af rygsøjlen og / eller bouton tætheder eller endda genopbygningen af neuronal morfologi på nanometer opløsning ved hjælp af elektronmikroskopi. Den juxtasomal optagelse teknik kan bruges til in vivo optagelser af forskellige celletyper tværs kortikale lag eller i sub-kortikale områder i en række arter, selv om de fleste undersøgelser har anvendt teknikken i små gnavere såsom mus eller rotter. Vores forskning er fokuseret på optagelse og mærkning neuronerfra rotte primære somatosensoriske cortex (S1) og involverer visuel identifikation af indspillede neuroner 18, at dendritiske rekonstruktioner i kombination med præcis registrering på en standardiseret referenceramme reverse engineering kortikale netværk 4,19 og detaljeret rekonstruktion af axonal arkitektur at karakterisere celletype-specifikke lokale og langtrækkende projektion målene 20.
Sammenlignet med alternative in vivo optagelse teknikker (intracellulære eller hel-celle), juxtasomal optagelser er relativt stabile og kan derfor anvendes på tværs af adfærdsmæssige tilstande herunder bedøvet 21,22, sederet 14, vågen head-fast 23 eller endda frit bevægelige dyr 9 . Her viser vi juxtasomal mærkning i S1 af en urethan-bedøvede rotte, selvom vi understrege den generelle anvendelighed af denne teknik til mange præparater af valg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse af Animal
Alle eksperimentelle procedurer gennemføres i overensstemmelse med den hollandske lovgivning og efter evaluering af en lokal etisk komité på VU University Amsterdam, Holland.
- Bedøver en Wistar rotter (P25-P45, ♂ / ♀) med isofluran (2-3% i oxygen) og efterfølgende med urethan (20% i 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g / kg) ved intraperitoneal injektion. Vurdere dybden af anæstesi ved at overvåge tilbagetrækningen knibe, øjenlåg reflekser, og vibrissae bevægelser.
- Indgiv en ekstra dosis af urethan (10% af oprindelig dosis) i tilfælde dyret ikke når tilstrækkelig bedøvelse dybde eller når vibrissae trækninger observeres i løbet af forsøget.
- Placer bedøvede dyr på stereotaktisk ramme er udstyret med en varmepude, indsæt rektal temperatur sonde og vedligeholde dyrets kropstemperatur på 37,5 ± 0,5 ° C ved en varmepude.
- Der indsprøjtes 100 ul 1% lidocain (i 0,9% NaCl) subkutant til lokal anæstesi ved operationsstedet og vent 3-5 min. Fjern huden, der dækker overfladen af kraniet ved at skære i caudale-til-rostralt retning og rense resterende væv.
- Rengør kraniet i udstrakt grad med 0,9% NaCl og absorberende podninger.
- Bestem koordinaterne for målområdet på den venstre hjernehalvdel (for primær somatosensoriske cortex (S1): 2,5 mm posteriort og 5,5 mm lateralt til bregma). Markér placeringen på skallen med en kirurgisk hud tusch.
- Skrab knoglen forsigtigt ved et tandlægebor fra regionen af interesse, indtil knoglen bliver transparent og blodkar er klart synlige.
- Lav en 0,5 mm x 0,5 mm kraniotomi ved at skære et vindue i den indsnævrede kraniet med en skalpel (# 11), så man undgår skader på dura materog blodkar. Valgfrit: markerer kanterne af kraniotomi ved hjælp af et kirurgisk hud markør pen til at forbedre synligheden.
- Påfør et tyndt lag af superlim på det tørre kranie og derefter dental cement til at konstruere et bad (dvs. optagelse kammer) omslutter kraniotomi.
- Trim knurhår på den kontralaterale side til nøjagtig 5 mm fra knurhår hårsækken. Valgfrit: fremhæve de trimmede whiskers med sort mascara.
2. Juxtasomal Recordings og biocytin Mærkning
- Gør patch pipetter borosilikatglas med indvendig spids diameter på ~ 1 um at få elektroder med 3-5 MOhm modstand. Bemærk: Den ideelle pipette morfologi for juxtasomal optagelse er en gradvis slank konus, en lav konusvinkel og en ~ 1 um spids (figur 1).
- Afhængigt af optagelsen dybde (med hensyn til pial overflade) bør koniske dimensioner elektrode justeres. Kritisk vigtigt er, at than taper diameter skal være mindre end 75 um ved indgang i hjernen for at undgå mekaniske skader eller stress til optagelsen området. Dette indikerer, at der for overfladiske kortikale optagelser, er en tilspidsning på 300-500 um med en ydre diameter på maksimalt 75 um påkrævet (figur 1A), mens optagelser fra relativt dybe kortikale lag kræver en længere tilspidsning på 1500-1800 um, igen med maksimal ydre diameter på 75 m (ved 1.800 um fra elektroden spids).
- Indlæse patch-pipetten med normal rotte ringetonen (NRR) suppleret med 2% biocytin (se tabel 1 for opløsninger og reagenser) og montere patch-pipetten på hovedet fase fastgjort til en mikromanipulator.
- Indstille vinklen på elektrodeholderen til 34 ° i forhold til sagittalplanet at målrette D2 kolonne af rotte-S1.
- Slut hoved scenen til en forstærker i bro-tilstand (dvs. den aktuelle klemme).
- Placer plasteretpipetteres i tæt nærhed til kraniotomi. Fyld badekarret med 0,9% NaCl og bestemme den elektrode modstand, som bør være mellem 3-5 MOhm, vurderes ved anvendelse af en firkantet puls med positiv strøm indsprøjtning (1 nA, 200 msek on / off).
- Etablere overtryk på 100-150 mbar og fremme patch-pipetten i 1 um trin, mens anvendelse positiv strøm som firkantede pulser (1 NA, 200 msek on / off). Overvåg robust modstand forandring ved at etablere kontakt med dura mater. På dette tidspunkt, skal du indstille koordinaterne for mikromanipulator til 'nul' til at tillade nøjagtig dybde målinger.
- Advance i 1 um trin-mode, indtil patch pipette penetrerer dura mater angivet ved et pludseligt fald i elektrode modstand. Fjern Holdetrykket af pipetten.
- Søg efter enkelte enheder samtidig fremme i 1 um trin. Overvåg elektrodemodstand kontinuerligt ved at anvende 200 msek on / off pulser. En stigning i elektrodemodstand typicallieret indikerer nærhed af en enkelt neuron. Advance elektroden indtil positiv handling potentiale (AP) bølgeformer af ~ 2 mV registreres (figur 2A og 2B).
- Valgfrit: Optag spontane spiking mønster af neuron og bestemme whisker fremkaldte spiking ved for eksempel, kaudalt afbøje individuelle whiskers til 200 msek ved en vinkel på 3,3 ° ved hjælp af en piezoelektrisk anordning 18.
- Advance elektroden, indtil modstanden er 25-35 MOhm og pigge har amplituder 3-8 mV for at opnå optimale juxtasomal påfyldning. Start juxtasomal fyldning ved at anvende firkantede pulser af positiv strøm (1 nA, 200 ms on / off). Langsomt og gradvist øge den nuværende i trin på 0,1 nA mens overvågning af AP bølgeform og frekvens (figur 2A og 2B).
- Overvåg membranen åbning som en klar stigning i AP frekvens under den fase af blokken puls (figur 2C (figur 2C og 2D). Yderligere parametre omfatter øget støj eller en lille (1-5 mV) negativ DC skift.
- Øg eller reducer strøm (1 nA), mens påfyldning for at opretholde en stabil biocytin infusion. Reducere eller stoppe strømimpulserne ved pludselig stigning af AP frekvens for at undgå toksicitet af overskydende tilstrømning af ekstracellulære ioner, såsom natrium-ioner. Bemærk: hver neuron vil reagere forskelligt på den aktuelle injektion og juxtasomal mærkning af parametre skal justeres afhængigt af individuelle optageforholdene.
- Nøje overvåge signal efter at have stoppet den aktuelle injektion. Spike bølgeform efter en fyldning session er normalt bredere, og viser en stærkt reduceret efter hyperpolarisering. Vent til inddrivelse af neuron, hvilket er tydeligt, når det spike bølgeform vender tilbage til sine oprindelige egenskaber (dvs. forekomst afnormale efter-hyperpolarisering, figur 2).
- Gentag biocytin påfyldning sessioner efter fuldstændig genopretning af neuron til at øge biocytin belastning for forbedret farvning kvalitet.
- Træk patch-pipetten i trin på 1 um indtil spidsen amplitude aftager at reducere en eventuel mekanisk belastning til cellen. Vent mindst 1 time for biocytin at diffundere intracellulært mens nøje dyrets kropstemperatur og vejrtrækning.
3. Perfusion Animal og Fjernelse af Brain
- Forbered perfusionen setup, skylles, og preload slangen med 0,9% NaCl.
- Placer dyret på en kirurgisk bakke og sikkert med standard mærkning tape. Sørg for tilstrækkelig dybde anæstesi fod knivspids og øjenlåg reflekser skal være fraværende.
- Lav en medialt for laterale snit (5-6 cm) gennem bugvæggen lige under brystkassen og fortsætte i posterior-anterior retning for at eksponere brystbenet.Træk brystbenet fortil og omhyggeligt adskille lever fra mellemgulvet.
- Lave et lille snit i membranen, skære gennem den nederste ribben og fortsætte snit langs hele længden af bughulen for at blotlægge hjertet.
- Fjern hjertesækken.
- Stik nålen ind i venstre hjertekammer og lave et snit i højre atrium. Perfuse med 0,9% NaCI (~ 8 ml / min), indtil affarvning af leveren er færdig.
- Skift infusion til 4% paraformaldehyd (PFA), indtil stivhed forpote og underkæbe er tydelig.
- Halshugge rotten ved hjælp af en saks
- Fjerne de resterende nakkemusklerne og eksponere kraniet helt.
- Placer saksen i hjernestammen på den dorsale side og skære benet forsigtigt langs den sagittale sutur, fastholde rygleje.
- Fjern knoglerne fra begge sider af det sagittale sutur for at blotlægge hjernen ved hjælp af pincet. Fjern forsigtigt dura at undgå dAmage.
- Stik forsigtigt en stump spatel til den ventrale side af hjernen og fjerne hjernen forsigtigt.
- Post-fix hele hjernen natten over i PFA ved 4 ° C. Skift hjernen til 0,05 M fosfatbuffer (), og opbevares ved 4 ° C.
4.. Udskæring hjerne i Tangentiel Sektioner
- Tag hjernen ud af 0,05 M PB og sætte det på et filtrerpapir overfor forreste. Brug en skarp barberblad at afskære lillehjernen langs koronale plan og adskille halvkugler ved at skære langs midten sagittalplanet.
- Anvend superlim på monterings-platformen og monter venstre hjernehalvdel på sin sagittalplan med forreste mod højre. Fastgør montage platform i en vinkel på 45 ° på en vibratome og oversvømme hjernen i 0,05 M PB.
- Sikre et barberblad på vibratome og sørg for, at den første kontakt med hjernen overflade er i midten af den forreste-bageste plan halvkugle. Skær 24 100 umsektioner og samle dem i en plade med 24 brønde indeholdende 0,05 M PB.
5.. Histologiske Procedurer
- Udfør histologiske protokoller for cytochromoxidase farvning 24 og avidin-biotin-peroxidase fremgangsmåde ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåder 25. Valgfrit: visualisere biocytin med fluorescerende avidin / streptavidin-Alexa konjugater. Dette giver desuden dobbelt-farvning med retrograd eller anterograd sporing teknikker.
- Vask sektioner 5 x 5 min med 0,05 M PB og forberede 3-3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)-opløsning for cytochromoxidase farvning at visualisere tønder i lag 4 (L4) S1 (se tabel 2 for løsninger, og reagenser). Inkuber sektioner 6-12 fra pia i den forvarmede opløsning 30-45 min ved 37 ° C.
- Skyl sektioner med 0,05 M PB til 6 x 5 min og slukke endogen peroxidase aktivitet ved at inkubere alle sektioner i 3% H 2 2 i 0,05 M fosfatbuffer i 20 min ved stuetemperatur (RT).
- Skyl sektioner med 0,05 M PB for 5 x 10 min. Inkuber sektioner i ABC-opløsning (se tabel 3 for løsninger og reagenser) natten over ved 4 ° C.
- Skyl sektioner med 0,05 M PB i 5 x 10 minutter og forberede DAB-løsning til at visualisere biocytin fyldt neuron (se tabel 4 for opløsninger og reagenser). Inkuber sektioner i filtrerede opløsning til 45-60 min ved RT.
- Skyl sektioner med 0,05 M PB for 5 x 10 min. Mount afsnit om objektglas og dækglas med Mowiol (se tabel 5 for løsninger og reagenser).
- Bestem kvalitetsmærkning ved hjælp af lys mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljeret viden om 3D-strukturen af de enkelte neuroner er afgørende for at kunne belyse de organisatoriske principper for neuronale netværk. Vores metode indebærer en rørledning for at opnå høj kvalitet biocytin mærkning af en in vivo forberedelse, hvorved post-hoc neuronal klassifikation og detaljeret rekonstruktion af dendritiske og aksonal arkitektur af enkelte neuroner i høj opløsning. Afhængig af kvaliteten af juxtasomal mærkning er neuroner genvindes med forskellige DAB-intensiteter, der spænder fra svag til intense DAB signaler ved stillinger, der meget præcist svarer til optagelsen placering 19,26. I vores laboratorium, en uddannet eksperimentatoren opererer på en succes-rate på 30-40% i urethan bedøvede gnavere. Dette indikerer, at en neuron er valgt for dendritiske og aksonal genopbygning i én ud af tre forsøg, som derefter opfylder følgende kriterier: 1) kun én neuron fyldt i hjernen, 2) udmærket kvalitetsmærkning,3) biocytin signal er konstant langs axonale fremskrivninger og ikke falde på distale slutninger, 4) Cyt C kontrastfarvning lykkes at tillade neuronal registrering, og 5) ingen skader på hjernen skiver under histologi. Den begrænsende faktor er typisk biocytin mærkning utilstrækkelig, hvilket betyder, at i ~ 80% af alle forsøg (bedøvede og / eller vågen), vil den optagede neuron skal inddrives (soma og dendritter). Dette er tilstrækkeligt til celletype klassificering, men ikke for pålidelige og fuldstændige rekonstruktion af axonale arkitektur. I figur 3, viser vi to eksempler på biocytin-mærkede neuroner med DAB-signalet efter passende juxtasomal mærkning en spiny pyramideformet neuron (figur 3A) og en interneuron (figur 3B). Rekonstruktion af tilstødende tangentielle sektioner tillader seriel rekonstruktion at opnå fuld neuronal morfologi 18,22,23,27,28. Derudover histologisk farvning af anatomiske referencerammer (for eksempel iprimære somatosensoriske cortex) giver mulighed for registrering af enkelte neuroner standardiserede referencerammer 4,19. De to eksempler, der præsenteres her afspejler optimale betingelser til at klassificere og efterfølgende rekonstruere de morfologiske egenskaber med en manuel eller automatiseret system (Figur 4) 15,20,29-31.
Figur 1.. Elektrode egenskaber for juxtasomal biocytin mærkning. (A) Elektrode til juxtasomal optagelse af corticalneuroner på 300-500 um dybde med hensyn til pial overflade. (B) Elektrode til juxtasomal optagelse af corticalneuroner på 1500-1800 um optagelse dybde. Bemærk forskellen i taper længde mellem paneler (A) og (B). (
Figur 2. Elektrofysiologiske egenskaber under biocytin påfyldning. (A, B) Spontane virkningspotentialer observeres under anvendelse af firkantede pulser (200 msek, on / off) med positiv strøm, men med utilstrækkelig amplitude at indlæse neuron med biocytin. (C) Øget strømamplitude resulterer i åbning af den neuronale membran tillader biocytin-loading, synlig i spor som faselåst burst-spiking under on-fase of pulsen. (D) Den spike bølgeform under fyldning viser en øget bredde og reduceret efter hyperpolarisering. Spike amplitude er normaliseret til spike amplitude i B til sammenligning. (E, F) Efter en vellykket inddrivelse af neuron efter fyldet session kan observeres en normal spike bredde og frekvens. Spike amplitude er normaliseret til spike amplitude i B til sammenligning. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Biocytin-DAB mærkning fra juxtasomally fyldt neuroner i primær somatosensoriske cortex urethan bedøvede rotter. (A) Pyramidal neuron i tangentialvisning. Bemærk den fremtrædende forskel i diameter størrelse dendritter og axoner. (B) Hurtig spiking interneuron i tangential visning. Bemærk beaded struktur dendritter og axoner. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Digital rekonstruktion af juxtasomally mærket neuron. (A) Neuron projektion billede i høj opløsning (men lav forstørrelse) fås fra 100 um tangential skive lag 6 neuron rotte primære somatosensoriske cortex hjælp halvautomatisk imaging pipeline. (B) Det samme billede som i (A) med automatiseret digital rekonstruktion overlejret (Axon i blå, dendrite i rød, henholdsvis). (C) Beslag kasse fra (B) zoomet ind for at illustrere pålideligheden af axonal genopbygning ved hjælp juxtasomal mærkning. Bemærk Axon boutons hele længden af Axon, to boutons fremhæves af sorte pile. Klik her for at se større billede.
| mM | g / ltr | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl2 | 0,2033 |
| 5. | HEPES | 1,1915 |
| PH justeres til 7,2 med NaOH | ||
| Tilføj 20 mg/ml-1 biocytin |
Tabel 1. Normal Rat Ringer Suppleret med biocytin.
| 8 mg | Cytochrom C fra equin hjerte |
| 8 mg | Catalase fra okselever |
| 265 pi | 75 mg / ml DAB |
| Opløses i 40 ml 0,05 M PB | |
| Filter og forvarme opløsning ved 37 ° C | |
Tabel 2. Solution for cytochrom c oxidase farvning.
| 1 dråbe | Reagens A |
| 1 dråbe | Reagens B |
| 0,5 ml | 10% Triton X100 |
| ight = "21" style = "height: 21px;"> opløses i 9,5 ml 0,05 M PB (45 min i forvejen) | |
| Tilsættes 410 ul løsning / godt | |
| Protokol for ABC-løsning til en plade med 24 brønde. | |
Tabel 3. Løsning med Vectastain standard ABC-kit.
| 265 pi | 75 mg / ml DAB |
| 13.4 pi | 30% H 2 O 2 |
Tabel 4. Løsning til DAB farvning.
| 6 g | Analytisk kvalitet glycerol |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Manuelt røre 10 min til pels Mowiol med glycerol | |
| 6 ml | Destilleret H2O |
| Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH 8,5 |
| Inkuber i 50 ° C vandbad i 1 time - O / N, omrøres lejlighedsvis | |
| Centrifuger 15 min ved 5000 xg alikvot og opbevares ved -20 ° C | |
Tabel 5. Mowiol løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den juxtasomal metode gør det muligt at optage i vivo aktionspotentialets spiking fra enkelte enheder på tværs af adfærdsmæssige forhold (bedøvede, vågen hoved fast eller frit bevægelse) med mulighed for biocytin-mærkning af indspillet neuron til post hoc celletype klassificering og / eller 3D-rekonstruktion. Den største fordel er at opnå fysiologiske parametre i det ekstracellulære (og dermed noninvasive)-konfiguration, men alligevel være i stand til at mærke neuron intracellulært med biocytin 16,17,32. Ud over biocytin mærkning kan denne teknik anvendes til at injicere neuroner med DNA, RNA, proteiner eller fluorescerende farvestoffer 33,34. Den mest indlysende ulempe ved denne fremgangsmåde er måske manglen på visuel kontrol af mærkningen kvalitet, og således ingen mulighed for at kontrollere mærkning kvalitet under eksperimentet. Imidlertid kan bruges optageforholdene og især handling potentiale form til at vurdere succesen af proceduren mærkning. For Instance, at sandsynligheden for at inddrive et neuron med tæt biocytin-DAB etiket stiger, når den tilsatte frekvens under strømimpulserne dramatisk øger ledsaget med forsvinden af efter-hyperpolarisering og udvidelse af aktionspotentialet bølgeform (se figur 2). Derudover er kvaliteten af biocytin mærkning direkte korreleret til den summerede længde særskilt mærkning sessioner, således at flere lange påfyldning sessioner (> 60 sec), vil resultere i en bedre histologiske kvalitet i forhold til en enkelt kort påfyldning samling (<30 sek) . Endelig vil overlevelsestiden for sporstof diffusion kritisk bestemme mærkning intensitet distale rum. I almindelighed overlevelse cirka 1 time efter høj kvalitet elektroporation sikrer tilstrækkelig mærkning af langtrækkende intracortical axonale projektioner. Et eksempel på sådanne langtrækkende fremskrivninger er neuroner fra primær somatosensoriske cortex rager til sekundær somatosensoriske cortex eller dysgranularzoner og dermed projicere på områder, der er flere millimeter væk fra mærkning webstedet 4,20. Når axonale fremskrivninger af endnu større dimensioner undersøges (såsom thalamocortical prognoser), bør overlevelse tid øges 15. Vigtigt at indse, er, at elektroporation af neuron vil have en dybtgående indvirkning på den fysiologiske tilstand af neuron på grund af overdreven natrium tilstrømning fra elektroden løsningen. Således er det stærkt anbefales at blande fylde episoder med hvilende episoder til at tillade fuld tilbagebetaling af handling potentiale spiking og overvågning optageforhold efter påfyldning sessioner når biocytin får lov til at diffundere langs dendritiske og axonale arborizations 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De authros har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Profs. Huibert Mansvelder og Bert Sakmann for omfattende støtte, Dr. Marcel Oberlaender for frugtbare diskussioner og give neuronal opsporing, og Brendan Lodder til teknisk bistand. Data blev erhvervet ved hjælp af ntrode VI for LabView, generøst leveres af R. Bruno (Columbia Univ.., NY, USA). Denne forskning blev støttet af Max Planck Society og Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (finansieret af det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF, FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Center for Neurogenomics og kognitiv forskning (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), midler til CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 og ENC-Netværk # p3-c3) og VU University Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
