Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 정보 처리 중 감각 피질에서 급증하는 세포 유형별 활동 전위를 기록된 뉴런의 형태학적 정체성과 연결하는 것입니다. 이것은 먼저 병치된 소말 녹음을 위해 쥐를 외과적으로 준비함으로써 달성됩니다. 일단 준비되면, 전극은 자발적이고 감각적으로 유발된 스파이크 활동을 기록하고, 기록된 뉴런은 전류와 주사를 사용하여 비오시딘이 로드됩니다.

그 후, 뇌는 비오틴 염색을 위해 처리됩니다. 마지막으로, 비오틴으로 채워진 뉴런은 세포 유형 분류를 위해 후속 절편에서 디지털 방식으로 재구성됩니다. 궁극적으로, 개별 뉴런의 병치된 솜털 기록은 피질 네트워크 내의 감각 처리 및 구조 정보에 대한 연구를 가능하게 합니다.

이 방법은 감각 처리 중 개별 세포 유형 및 층의 역할은 무엇입니까? 일반적으로 개인은 충전 절차 중에 뉴런을 죽이는 것이 매우 쉽기 때문에 이 방법이 어려움을 겪을 필요가 있습니다. 최적의 품질의 파이펫을 준비함으로써 성공적인 바이오시딘 충진 가능성을 높일 수 있으며, 또한 협대역 전류 주입을 제어하기 위해 훈련된 눈이 필요합니다.

따라서 잘 채워진 뉴런의 회복 성공률을 높이려면 경험이 필요합니다. 시작하려면 마취된 위스타 쥐를 발열 패드가 장착된 입위 프레임에 놓습니다. 발가락 핀치 반사를 테스트하여 진정 깊이를 확인하십시오.

그런 다음 직장 프로브를 삽입하여 올바른 체온을 유지하십시오. 동물의 머리를 고정하고 수술 부위의 털을 제거합니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오.

수술 부위에 리도카인을 주입한 후 3분에서 5분 정도 기다렸다가 두개골 표면을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 다음으로, 남아있는 조직을 제거하고 0.9 % 염화나트륨 라이드로 두개골을 광범위하게 청소합니다. 좌반구에 있는 일차 체감각 피질의 좌표를 결정하고 수술용 피부 마커 펜으로 두개골의 위치를 표시합니다.

치과용 드릴을 사용하여 관심 부위의 뼈를 긁어냅니다. 뼈가 투명해지고 혈관이 명확하게 보일 때까지 뼈를 계속 긁어냅니다. 다음으로, 메스로 얇은 두개골에 작은 창을 자릅니다.

경막과 혈관이 손상되지 않도록 주의합니다. 수술용 피부 마커 펜을 사용하여 개두술의 가장자리를 표시합니다. 가시성을 높이려면 마른 두개골에 슈퍼 접착제를 얇게 바르고 치과 시멘트를 바르면 욕조를 만들 수 있습니다.

개두술을 닫을 때 반대쪽 수염을 정확히 5mm로 잘라 가시성을 높입니다. 녹음을 시작하기 전에 트리밍된 수염을 블랙 마스카라로 강조하고 Boro Silicic 유리로 패치 피펫을 만듭니다. 이상적인 피펫 형태는 점진적인 가느다란 테이퍼, 낮은 원뿔 각도 및 약 1미크론의 내부 팁 직경입니다.

패치 피펫에 2%비오틴을 보충한 일반 rad ringer를 로드하고 패치 피펫을 헤드 스테이지에 고정하고 microm 매니퓰레이터에 연결된 피펫 홀더에 장착합니다. 랫드 S 1의 D 2 열을 구체적으로 대상으로 지정하려면 시상면에 대해 전극 홀더의 각도를 34도로 설정합니다. 다음으로, 패치 피펫을 개두술에 가까운 곳에 놓습니다.

욕조에 0.9%염화나트륨을 채웁니다. 증폭기가 브리지 모드에 있는 상태에서 양전류 주입으로 사각 펄스를 적용하여 전극 저항을 결정합니다. 최적의 전극 저항은 3에서 5 메가 사이입니다.

100 - 150mbar의 과압을 설정하고 사각 펄스 형태의 양전류를 적용하면서 패치 피펫을 1미크론 단계로 전진시킵니다. 경막(dura mater)과 접촉할 때 강력한 저항 변화를 모니터링합니다. 이 시점에서 정확한 깊이 측정을 위해 마이크로 매니퓰레이터의 좌표를 0으로 설정합니다.

패치 피펫이 전극 저항의 급격한 강하로 표시된 경막을 관통할 때까지 1미크론 스텝 모드로 진행합니다. 피펫의 유지 압력을 제거합니다. 다음으로, 1미크론 단위로 진행하면서 단일 단위를 검색합니다.

200밀리초의 온 오프 펄스를 적용하여 전극 저항을 지속적으로 모니터링하고 전극 저항의 증가는 일반적으로 단일 뉴런의 근접성을 나타내며 양의 진행 동작까지 전극을 전진시킵니다.약 2밀리볼트의 전위 파형이 기록됩니다. 선택적으로 자발적인 스파이크 활동을 기록하고 juxta somal 충전을 위한 최적의 조건을 얻기 위해 pizo 전기 장치를 사용하여 개별 수염을 조금씩 편향시켜 수염이 취소된 스파이크 활동을 확인합니다.

저항이 25에서 35가 될 때까지 전극을 전진시킵니다. 메가 옴과 스파이크는 병치 솜털 충전을 시작하기 위해 3에서 8 밀리 볼트의 진폭을 가지고 있습니다. 1나노 암페어에서 시작하는 양의 제곱 전류 펄스를 적용합니다.

AP 파형과 주파수를 모니터링하면서 0.1 나노 암페어의 단계별로 전류를 천천히 점진적으로 증가시킵니다. 멤브레인 개구부를 모니터링하고, 블록 펄스의 켜짐 위상 동안 AP 주파수의 명확한 증가, 충전 중 스파이크 파형 형태는 과분극 후 증가 및 감소를 보여주고, 안정적인 비오틴 주입을 유지하기 위해 충전하는 동안 전류를 증가 또는 감소시키고, AP 주파수의 급격한 증가 시 전류 펄스를 줄이거나 중지합니다. 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과도한 유입에 의한 독성을 피하기 위해.

모든 뉴런은 채우기 절차에 다르게 반응한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 juxta somal 라벨링 매개변수는 기록 조건에 따라 조정해야 합니다. 전류 주입을 중지한 후 신호를 면밀히 모니터링하십시오.

충전 세션 후 스파이크 파형은 일반적으로 넓어지며 과분극 후 뉴런의 복구를 기다린 후 크게 감소하는 것을 보여주며, 이는 스파이크 파형이 세포에 대한 기계적 스트레스를 줄이기 위해 원래 특성으로 돌아갈 때 분명합니다. 스파이크 진폭이 감소할 때까지 1미크론 단위로 패치 피펫을 집어넣고, 비오틴이 세포 내로 확산될 때까지 최소 1시간 동안 기다리면서 동물의 체온과 호흡을 면밀히 모니터링합니다. 마지막으로, 뇌 샘플을 얻어 처리하여 juxta somal labeling의 품질을 밝힙니다.

이 이미지는 원발성 체감각 피질에서 병치된 뭉치로 채워진 뉴런의 이미지를 보여줍니다. 파라메탈 뉴런의 이러한 접선 관점은 수상돌기와 축삭돌기 사이의 크기 차이를 보여줍니다. 병치된 소말리아인(juxta Somali)이라고 표시된 뉴런의 디지털 재구성에서 뉴런 투영 이미지는 고해상도이지만 저배율로 표시되며, 자동화된 디지털 재구성으로 각각 파란색의 축삭돌기, 빨간색의 수상돌기가 겹쳐져 있습니다.

여기서 상자 영역은 축삭의 길이 전체에 걸쳐 축삭 부톤을 표시하도록 확장됩니다. 이 최종 애니메이션에서는 쥐의 1차 체감각 피질에서 5개 두께의 초금속 뉴런 1층에 대한 재구성 파이프라인을 예시합니다. 이 파이프라인은 100배 배율에서 수지상 및 축삭 형태를 재구성하고 4배 배율에서 배럴 윤곽을 재구성하는 것을 수반합니다.

그 결과 완전한 3D 재구성이 가능하며, 이후 표준화된 참조 프레임에 등록되어 형태학적 특성의 정량적 분석을 수행합니다. 따라서 in vivo 병치된 소말 라벨링은 완전한 3D 형태학의 신뢰할 수 있는 재구성을 위한 탁월한 라벨링 품질을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 우레탄 마취 동물에 대한 방법을 보여주었습니다.

그러나 Jux Somal 기록은 깨어 있는 머리가 구속된 동물에서도 환경을 적극적으로 탐색하는 동안 개별 세포 유형 및 층의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전후 식별 및 형태학적 재구성을 위해 개별 뉴런에 Biocidin 라벨링을 수행하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.