Name: Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 쥐 두피 뉴런의 구조-기능 관계를 연구하는 생체소마 생화시틴 라벨링 기법을. 이 방법은 감각 처리 중 개별 뉴런의 활동과 형태를 연결하여 신경망 이해를 돕습니다.

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우리는 PROFS에게 감사의 말씀을 전합니다. 광범위한 지원을위한 Huibert Mansvelder 버트 Sakmann, 유익한 토론 및 기술 지원에 대한 연결을 추적하고, 브렌든 Lodder을 제공하는 박사 마르셀 Oberlaender. 데이터는 관대 R. 브루노 (컬럼비아 대학., NY, USA)에서 제공하는 LabVIEW 용 ntrode VI를 사용하여 획득 하였다. 이 연구는 막스 플랑크 사회와 전산 신경 과학, 튀빙겐에 대한 번스타인 센터에 의해 지원되었다 (독일 연방 교육 연구부 (BMBF 재정 지원, FKZ : 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics 및인지 연구 센터 (CNCR) , 신경 과학 캠퍼스 암스테르담 (NCA), CPJdK (NWO - ALW 번호 822.02.013와 ENC-네트워크 # 1 P3-C3)와 VU 대학 암스테르담에 자금.

1. 동물의 준비 모든 실험 절차는 VU 대학 암스테르담, 네덜란드에 현지 윤리위원회는 네덜란드 법에 따라, 평가 후에 실시된다. <ol><li> 복강 내 주사 (0.9 % 염화나트륨, 1.6-1.7 g / kg의 20 %) 우레탄 이소 플루 란 (산소 2 ~ 3 %)에이어서 위 스타 쥐 (P25-P45, ♂ / ♀)를 마취. 핀치 철수, 눈꺼풀 반사 및 vibrissae 움직임을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다. </li><li> 경우 우레탄의 추가적인 용량 (초기 용량의 10 %) 투여 동물 충분한 마취 깊이에 도달하지 않거나 vibrissae 기라는 실험 과정 동안 관찰 될 때마다. </li><li> 가열 패드 탑재 고정대에 마취 된 동물을 놓고 직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에서 37.5 ± 0.5 ° C에서 동물의 체온을 유지한다. </li><l난&gt; 고정대에 동물의 머리를 배치, 눈에 보이는 피부를 렌더링하는 가위를 사용하여 머리 꼭대기에 머리를 손질. </li><li> 작업 현장에서 국소 마취를 위해 100 ㎕의 1 % 리도카인 피하 (0.9 % 염화나트륨의)를 주입하고 3-5 분을 기다립니다. 꼬리 - 투 - 주동이의 방향으로 절단하여 두개골의 표면을 덮고있는 피부를 제거하고 남은 조직을 청소합니다. </li><li> 0.9 % 염화나트륨과 흡수성 면봉으로 광범위하게 두개골을 청소합니다. </li><li> (: 2.5 mm 후방 및 브레 그마에 측면 5.5 mm 차 체 감각 피질 (S1)에 대한) 왼쪽 반구의 대상 영역의 좌표를 결정합니다. 외과 피부 마커 펜으로 두개골의 위치를​​ 표시합니다. </li><li> 뼈가 투명하게하고 혈관이 선명하게 보일 때까지 관심 영역에서 치과 드릴로 부드럽게 뼈를 다 쳤어요. </li><li> 경막의 손상을 방지, 메스 (# 11)와 얇아진 두개골의 창을 절단하여 0.5 mm × 0.5 mm의 개두술을혈관. 선택적 : 시인성을 향상시키기 위해 외과 피부 마커 펜을 사용 개두의 가장자리를 표시한다. </li><li> 개두술을 둘러싸는 목욕 (즉, 기록 챔버)를 구성하기 위해 건조 두개골 후 치과 시멘트에 순간 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 수염 뿌리에서 정확히 5 mm로 반대쪽에 수염을 손질. 옵션 : 블랙 마스카라 손질 수염을 강조 표시합니다. </li></ol> 2. Juxtasomal 녹음 및 Biocytin 라벨링 <ol><li> 3-5 MΩ의 저항 전극을 얻기 위해 ~ 1 μm의 내부 팁 직경 붕규산 유리의 패치 피펫을 확인합니다. 참고 : juxtasomal 녹화를위한 이상적인 피펫 형태는 점진적으로 슬림 테이퍼, 낮은 원뿔 각도, 그리고 ~ 1 μm의 팁 (그림 1)입니다. </li><li> (pial 표면에 대해)의 기록 깊이에 따라, 기록 전극의 테이퍼 치수는 조정되어야한다. 매우 중요한 그 t이다그 직경은 기록 영역에 대한 기계적 손상 또는 스트레스를 피하기 위해 뇌의 엔트리 포인트에서 75 μM 미만이어야 테이퍼. 상대적으로 깊은 대뇌 피질의 층에서의 기록이 최대한 외부로 다시 1,500 ~ 1,800 ㎛의 긴 테이퍼를 필요로하는 반면 이것은 피상적 인 대뇌 피질의 녹음을 위해, 최대로 75 μM의 외부 직경 300 ~ 500 ㎛의 테이퍼 (그림 1A)를 필요하다는 것을 나타냅니다 (전극 팁에서 1,800 μm의에서) 75 μm의 직경. </li><li> 정상 쥐의 벨소리 (NRR)와 패치 피펫을로드 2 % biocytin 보충 (솔루션 및 시약 표 1 참조)과 미세 조작기에 고정 된 머리 무대에 패치 피펫을 탑재합니다. </li><li> 특히 쥐 S1의 D2 열을 대상으로 시상면에 대하여 34 °에 전극 홀더의 각도를 설정합니다. </li><li> 브리지 모드에서 증폭기 (즉, 현재 클램프)에 머리 단계를 연결합니다. </li><li> 패치의 위치를개두술에 근접 피펫. 0.9 % NaCl로 목욕을 입력하고 긍정적 인 전류 주입 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)과 사각 펄스를 적용하여 평가 3-5 MΩ, 사이 여야 전극 저항을 결정합니다. </li><li> 사각 펄스 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)로 양의 전류를 적용하는 동안 100 ~ 150 밀리바의 과압을 설정하고 1 μm의 단계에서 패치 피펫을 진행. 경막과의 접촉을 수립시 강력한 저항 변화를 모니터링합니다. 이 시점에서, 정확한 깊이 측정을 할 수 있도록 &#39;제로&#39;에 미세 조작기의 좌표를 설정합니다. </li><li> 패치 피펫 전극 저항의 급격한 하락에 의해 지시 된 뇌경막을 침투 할 때까지 1 μm의 스텝 모드에서 진행. 피펫의 유지 압력을 제거합니다. </li><li> 1 μm의 단계로 발전하면서 하나의 장치를 검색합니다. / 오프 펄스에서 200 밀리 초를 적용하여 지속적으로 전극 저항을 모니터링합니다. 전극 저항의 증가 typic동맹은 단일 신경 세포의 근접을 나타냅니다. 긍정적 인 활동 전위 (AP) ~ 2 측정 값의 파형 (그림 2A와 2B)을 기록 할 때까지 전극을 사전. </li><li> 선택 사항 : 신경 세포의 자발적인 급상승 패턴을 기록하고 확인 수염 - 유발 꼬리 쪽 압전 소자 (18)를 사용하여 3.3 °의 각도로 200 밀리 초에 대한 개별 수염 편향, 예를 들어,에 의해 요동 치고. </li><li> 저항이 25 ~ 35 MΩ과 스파이크 juxtasomal 작성의 최적 조건을 얻기 위해 3-8 값의 진폭을 때까지 전극을 사전. 양의 전류 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)의 사각 펄스를 적용하여 juxtasomal 충전을 시작합니다. AP 파형 및 주파수 (그림 2A와 2B)를 모니터링하면서 천천히하고 점차적으로 0.1 nA의 단계에 의해 전류를 증가시킨다. </li><li> 블록 펄스 (그림 2C의 온 단계에서 AP의 주파수에있는 명확한 증가로 막 개방을 모니터 </강한&gt;). 작성하는 동안 스파이크 파형은 증가 폭이 감소 후 과분극 (그림 2C와 2D)를 보여줍니다. 추가 매개 변수를 증가 잡음이나 작은 (1-5 MV) 음의 DC의 변화를 포함한다. </li><li> 증가 또는 안정 biocytin 주입을 유지하기 위해 작성하는 동안 (1 NA) 전류를 감소시킨다. 축소 또는 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과잉 유입하여 독성을 피하기 위하여 AP 주파수의 급격한 증가에 따라 전류 펄스를 멈춘다. 참고 : 모든 신경 세포가 표시 매개 변수는 개별 촬영 조건에 따라 조정해야 할 현재의 주입 및 juxtasomal에 다르게 반응합니다. </li><li> 밀접 전류 주입을 정지 한 후에 신호를 모니터링한다. 충전 세션 후 스파이크 파형은 일반적으로 확대하고 강력한 과분극 후 감소를 보여줍니다. 스파이크 파형 (원래 속성의 즉 존재를 반환 할 때 명백한 신경 세포의 복구를 기다립니다정상 후 과분극, 그림 2). </li><li> 개선 된 염색 품질 biocytin 부하를 증가시키는 신경 세포의 완전한 복구 후 세션을 작성 biocytin 반복합니다. </li><li> 스파이크 진폭이 세포에 기계적 스트레스를 줄이기 위해 감소 할 때까지 1 μm의 단계로 패치 피펫을 철회. 밀접하게 동물의 체온을 모니터링하고 호흡하면서 세포 내 확산 biocytin 적어도 1 시간을 기다립니다. </li></ol> 3. 동물을 관류하고 뇌를 제거 <ol><li> , 관류 설치를 준비 린스, 0.9 % NaCl로 튜브를 미리로드. </li><li> 수술 트레이에 동물을 배치하고 표준 라벨 테이프로 고정합니다. 마취의 충분한 깊이를 확인, 발 핀치와 눈꺼풀 반사가 존재해야한다. </li><li> 다만 갈비뼈 아래 복부 벽을 절개 (5-6 센티미터) 옆쪽과 흉골을 노출 후방 - 전방 방향으로 진행 중간을 확인합니다.전방 흉골을 당겨 조심스럽게 진동판에서 간을 구분합니다. </li><li> 하부 리브 통해 잘라 다이어프램에 작은 절개를하고 심장을 노출 복강의 전체 길이를 따라 절개를 계속한다. </li><li> 심낭을 제거합니다. </li><li> 좌심실에 바늘을 삽입하고 우심방 절개를합니다. 간장의 탈색이 완료 될 때까지 0.9 %의 NaCl (~ 13 ㎖ / 분)로 Perfuse. </li><li> 앞 발 강성까지 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 주입을 전환하고 아래턱은 명백하다. </li><li> 가위를 사용하여 쥐의 목을 벨 </li><li> 나머지 목 근육을 제거하고 완벽하게 두개골을 노출합니다. </li><li> 등의 측면에서 뇌간에있는 가위를 놓고 지느러미 위치를 유지, 시상 봉합을 따라 조심스럽게 뼈를 잘라. </li><li> 집게를 사용하여 뇌를 노출하는 시​​상 봉합의 양쪽에서 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 개발을 방지하기 위해 경질을 제거amage. </li><li> 조심스럽게 두뇌의 복부 측면에 무딘 주걱을 삽입하고 부드럽게 뇌를 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 PFA에 전체 뇌 하룻밤 후 수정 0.05 M 인산염 완충액 (PB)에 뇌를 전환하고 4 ℃에서 저장 </li></ol> 4. 접선 섹션의 뇌 슬라이스 <ol><li> 0.05 M PB 중 뇌를 가지고 앞쪽에 직면 여과지에 넣어. 관상면을 따라 소뇌을 차단하고, 중간 시상면을 따라 절단하여 반구를 분리하기 위해 날카로운 면도날을 사용합니다. </li><li> 설치 플랫폼에 순간 접착제를 적용하고 전방 오른쪽에 직면과의 시상면의 왼쪽 반구를 탑재합니다. vibratome에 45 °의 각도로 장착 플랫폼을 확보하고 0.05 M PB의 머리를 물속에. </li><li> vibratome에 면도날을 보호하고 뇌 표면과 첫 접촉은 반구의 전후방 평면의 중앙에 있는지 확인합니다. (24) 100 μm의 컷섹션 0.05 M PB를 포함하는 24 웰 플레이트에서 그들을 수집합니다. </li></ol> 5. 조직 학적 절차 <ol><li> 앞에서 설명한 방법 (25)에 따라 시토크롬 산화 효소 염색 (24)와 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 방법에 대한 조직 학적 프로토콜을 수행합니다. 선택 사항 : 형광 아비딘 / 스트렙 타비 딘 - 알렉사 복합체를 사용하여 biocytin 시각화. 이것은 또한 역 행성 또는 선행 성 추적 기술과 이중 염색을 할​​ 수 있습니다. </li><li> 0.05 M PB와 3-3&#39;-디아 미노의 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션을 표 2 참조 (층 4 S1의 (L4)에서 배럴을 시각화하는 시토크롬 산화 효소 염색에 대한 솔루션을 함유를 준비하고 씻을 섹션 5 × 5 분 시약). 37 ℃에서 30 ~ 45 분 동안 예열 된 용액에서 PIA의 섹션 6-12을 품어 </li><li> 6 × 5 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어 3 % H 2의 모든 섹션을 배양하여 내인성 과산화 효소 활성을 끄다 </서브&gt; O 실온 (RT)에서 20 분 동안 0.05 M PB 2. </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 4 ℃에서 하룻밤 (솔루션 및 시약 표 3 참조) ABC-솔루션 섹션을 품어 </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 헹구고 (솔루션 및 시약 표 4 참조) biocytin 가득한 신경 세포를 시각화하는 DAB-솔루션을 준비합니다. 실온에서 45 ~ 60 분 동안 필터링 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 현미경 슬라이드와 MOWIOL와 커버 슬립 (솔루션 및 시약 표 5 참조)에 마운트 부분. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 라벨의 품질을 결정합니다. </li></ol>

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authros는 공개 아무것도 없어.

juxtasomal 방법은 행동 조건에서 하나의 단위에서 생체 활동 전위 급상승에 기록 할 수 있습니다 (마취 깨어 머리를 고정하거나 자유롭게 이동) biocytin-라벨 사후 세포 유형 분류 및 / 또는 3D 재건 기록 된 신경 세포의 옵션. 가장 큰 장점은 세포 (따라서 비 침습적) 구성의 생리 학적 파라미터를 획득하는 것입니다, 아직 biocytin 16,17,32과 세포 내 신경 세포에 라벨을 할 수있는. 라벨링 biocytin 이외에,이 기술은 DNA, RNA, 단백질, 또는 형광 염료 33,34 뉴런을 주입하는데 사용될 수있다. 이 방법의 가장 명백한 단점은 라벨의 시각적 품질 제어 아마도 부족하고 실험 기간 동안 라벨링 품질 검사의 그러므로 결코이다. 그러나, 기록 조건, 특히 활동 전위 모양 라벨링 절차의 성공 여부를 평가하기 위해 사용될 수있다. 채소에 대한전류 펄스 동안 급상승 주파수가 극적으로 증가 할 때 후부, 밀도 b...

네트워크의 연결은 매우 구체적인 형태 및 생리 학적 특성 1-7 특징으로 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 결과적으로, 개별 셀 유형 (예를 들어 볼 Gentet 등. 8 Burgalossi 등. 9) 네트워크 내에서 전문적인 작업을 수행 할 수 있습니다. 우리는 신경 세포의 네트워크를 통해 세포 유형 특정 기능을 이해하기 시작하고 많이 발견되고 아직도있다. 이를 위해 많은 실험실은 생리 학적 매개 변수 1,10-15을 획득 한 한 동일한 신경 인구의 형태 학적 특성의 분석을 허용 실험적인 접근 방식을 구현하고 있습니다. 여기, 우리는 biocytin로 기록 된 신경 세포의 전기 충격과 함께 세포 (따라서 비 침습적) 구성에서 기존의 패치 피펫을 사용하여 전기 생리학 기록을 포함 juxtasomal 라벨링 기술 (16, 17)을 보여줍니다.이 방법의 가장 큰 장점은 비 침습적 자연 개별 신경 세포의 활동 전위 스파이크가 (예 : 투석) 세포의 세포 내 내용을 변경하지 않고 기록을 보장한다는 것입니다. 일렉트로에 이어, juxtasomal 접근 방식은 구조 (형태)에 기능 (생리)을 연결하는 사후 세포 식별 및 재건의 옵션을 제공합니다. 일반적으로, 형태 학적 재구성은 척추 및 / 또는 Bouton에서 밀도의 정량 또는 전자 현미경을 사용하여 나노 미터 해상도의 연결 형태의도 재건에 확장 될 수있다 돌기 및 축삭 형태의 재건을 포함한다. 대부분의 연구는 생쥐 나 쥐와 같은 작은 설치류의 기술을 적용하고 있지만 juxtasomal 기록 기술은 대뇌 피질의 층에 걸쳐 생물 종의 범위에있는 하위 대뇌 피질의 영역에서 다양한 세포 유형의 생체 내 녹음에 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 신경 세포를 기록하고 라벨에 초점을 맞추고 있습니다쥐 차 체성 감각 피질 (S1)에서 기록 뉴런 (18)의 시각적 식별을 포함, 표준화 된 참조 프레임의 정확한 등록과 함께 수상 복원 세포 유형 특정 지역의 특성을 대뇌 피질의 네트워크 4,19 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 리버스 엔지니어링 장거리 투사 (20)를 대상으로합니다. 웨이크 헤드 고정 (23), 또는 자유롭게 움직이는 동물 9보기, 대체 생체 기록하는 기술 (세포 내 또는 전체 세포)에 비해 juxtasomal 녹음은 상대적으로 안정적이고, 따라서 마취 21,22 포함한 행동 상태에 걸쳐 적용 할 수있는, (14)을 침착 . 우리는 선택의 많은 준비를이 기술의 일반적인 적용을 강조하지만 여기서 우리는, 우레탄 마취 쥐의 S1에서 juxtasomal 라벨을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>SM-6 제어 시스템</td><td>Luigs Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 23 XYZ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 amplifier</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp-2B amplifier</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osada 모델 EXL-M40</td><td>Osada, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>압전 장치</td><td>Physik Instrumente</td><td>PL140.10</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td></td><td>LabView 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Ntrode Virtual Instrument&nbsp;</td><td>R. Bruno, Columbia Univ., NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sugi 흡수성 면봉</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>말 심장의 사이토크롬 C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>소 간의 카탈라아제</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>7047</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain 표준 ABC 키트</td><td>벡터</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>우레탄</td><td>시그마</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachemie</td><td>45.112.110</td><td></td></tr><tr><td>리도카인</td><td>시그마</td><td>L5647</td><td></td></tr><tr><td>심플렉스 급속 치과 시멘트</td><td>Kemdent</td><td>ACR308/ACR924</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molekula</td><td>36219518</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>시그마</td><td>T4661</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>분석 등급 글리세롤</td><td>Fluka</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>CaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>22,350-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63072</td><td></td></tr></tbody></table>

juxtasomal biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

대뇌 피질은 함께 네트워크로 의사 결정, 감각 유도 행위 나 메모리 등 많은 높은인지 기능에 대한 책임은 여러 계층의 많은 별개의 세포 유형의 특징입니다. 그러한 복잡한 네트워크의 연결이 이러한 작업을 수행하는 방법을 이해하기 위해, 중요한 단계는 동물인지 관련 태스크를 수행 할 때 우선적으로, 네트워크 내의 각각의 세포 유형의 기능 (또는 전기 활동)을 결정하는 것이다. 또한, 역 대뇌 피질의 네트워크를 설계 할 수 있도록 개별 뉴런의 네트워크와 형태 학적 구조의 해부학 적 구조를 결정하는 것도 중요하다. 현재 사용 가능한 기술 혁신이 기록 된 신경 세포를 식별하는 사후의 가치있는 옵션과 함께 동물 행동, 깨어있는 세포 활동을 기록 할 수 있습니다. 여기, 우리는 기록 작업 potenti을 포함 juxtasomal의 biocytin 라벨링 기술을 보여알은 기존의 패치 피펫을 사용하여 세포 (또는 느슨한 패치) 구성에 못을 박는. juxtasomal 기록 구성, 마취 진정 깨어 헤드 고정, 심지어 자유롭게 움직이는 동물 포함한, 행동 조건에 걸쳐 비교적 안정하고 적용 가능하다. 따라서,이 방법은 각각의 뉴런과 궁극적으로, 전체 대뇌 피질의 저항기의 재건에 동물의 행동 중에 세포 형 특정 활동 전위 스파이크를 연결 할 수 있습니다. 이 비디오 원고에서, 우리는 juxtasomal 구성의 개별 뉴런은 사후 식별 및 형태 학적 재구성을위한 우레탄 마취 쥐에 biocytin으로 표시 할 수있는 방법을 보여줍니다.

개별 신경 세포의 3 차원 구조에 대한 자세한 지식은 신경 네트워크의 조직 원리를 해명 중요합니다. 우리의 방법은 이에 사후 신경 세포의 분류 및 수상 및 높은 해상도에서 단일 신경 세포의 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 허용, 생체 준비에서 높은 품질의 biocytin 라벨을 달성하기 위해 파이프 라인을 포함한다. juxtasomal 라벨의 품질에 따라, 뉴런은 희미한 매우 정확하게 기록 위치에 19, 26에 해당하는 위치에 강렬한 DAB 신호에 이르기까지 다양한 DAB-강도로 복구됩니다. 우리 실험실에서, 숙련 된 실험자 우레탄 마취 설치류 30 ~ 40 %의 성공 속도로 동작한다. 뇌, 2) 우수한 표시 품질을 채워 1) 하나의 뉴런이 하나의 신경 세포가 다음 기준을 충족하는 세 가지 중 실험에 돌기 및 축삭의 재건을 위해 선택되어 있음을 나타냅니다3) biocytin 신호가 축삭 돌기를 따라 일정 4) CYT C의 counterstaining이 신경 세포의 등록을 할 수...

신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 정보 처리 과정 중 감각 피질에서 나타나는 세포 유형 특이적 활동 전위 스파이킹을 기록된 뉴런의 형태학적 정체성과 연결하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐를 수술적으로 준비하여 세포체 인접 기록(juxta somal recording)이 가능하도록 합니다. 준비가 완료되면 전극을 통해 자발적 및 감각 유발 스파이킹 활동을 기록하며, 전류 주입 및 주입법을 사용하여 기록된 뉴런에 biocidin을 충전합니다.그 후, 뇌 조직을 비오틴 염색을 위해 처리합니다. 마지막으로, 비오틴이 채워진 뉴런을 연속 절편으로부터 디지털로 재구성하여 세포 유형을 분류합니다. 궁극적으로, 개별 뉴런의 세포체 인접 기록(juxtasomal recording)을 통해 피질 네트워크 내의 감각 처리 및 구조적 정보를 연구할 수 있습니다.이 방법은 감각 처리 과정에서 개별 세포 유형과 층의 역할은 무엇인가와 같은 신경과학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 필요한 연구자들은 충전 과정 중에 뉴런이 매우 쉽게 사멸하기 때문에 어려움을 겪습니다. 최적의 품질의 피펫을 준비함으로써 biocidin 충전의 성공 확률을 높일 수 있으며, 또한 좁은 대역의 전류 주입을 제어하기 위해 숙련된 관찰력이 필요합니다.따라서, 충분히 충전된 뉴런을 회수하는 성공률을 높이기 위해서는 숙련된 경험이 필요합니다. 먼저, 가열 패드가 장착된 정위 고정 장치에 마취된 Wistar 쥐를 놓습니다. 발가락 꼬집기 반사를 테스트하여 진정 깊이를 확인합니다.그다음 직장 프로브를 삽입하여 적절한 체온을 유지합니다. 동물의 머리를 고정하고 수술 부위의 털을 제거합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 도포합니다.수술 부위에 리도카인을 주입한 후 3~5분 동안 기다렸다가 두개골 표면을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 다음으로 남아 있는 조직을 모두 제거하고 0.9% sodium chloride 용액으로 두개골을 충분히 세척합니다. 좌반구의 일차 체성감각 피질 좌표를 결정하고 수술용 피부 마커 펜으로 두개골에 해당 위치를 표시합니다.치과용 드릴을 사용하여 관심 영역의 뼈를 긁어냅니다. 뼈가 투명해지고 혈관이 명확하게 보일 때까지 계속해서 긁어냅니다. 다음으로, 메스를 사용하여 얇아진 두개골에 작은 창을 냅니다.경막과 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 수술용 피부 마커 펜을 사용하여 개두술 부위의 가장자리를 표시합니다. 시야를 확보하기 위해 건조한 두개골 위에 순간접착제를 얇게 바른 후, 치과용 시멘트를 사용하여 배스(bath)를 구축합니다.두개골 절개술을 마무리하며, 가시성을 높이기 위해 반대편의 수염을 정확히 5mm 길이로 다듬습니다. 기록을 시작하기 전, 다듬은 수염을 검은색 마스카라로 강조합니다. Boro Silicic 유리로 패치 피펫을 제작합니다. 이상적인 피펫 형태는 점진적으로 가느다란 테이퍼, 낮은 원추 각도, 그리고 약 1µm의 내부 팁 직경을 갖는 것입니다.2% biotin이 첨가된 normal rad ringer를 패치 피펫에 채우고, 헤드 스테이지에 고정되어 마이크로 조작기에 연결된 피펫 홀더에 패치 피펫을 장착합니다. 쥐 S1의 D2 컬럼을 정확하게 타겟팅하기 위해, 전극 홀더의 각도를 시상면 기준 34도로 설정합니다. 다음으로, 패치 피펫을 두개골 절개 부위와 가까운 위치에 배치합니다.욕조를 0.9% sodium chloride로 채웁니다. 증폭기를 브리지 모드로 설정하고, 양전류 주입 방식의 사각 펄스를 가하여 전극 저항을 측정합니다. 최적의 전극 저항 값은 3~5 MΩ 사이입니다.100에서 150 millibar의 과압을 설정하고, 사각 펄스 형태의 양전류를 가하면서 패치 피펫을 1 micron 단계로 전진시킵니다. 경질막과 접촉 시 발생하는 급격한 저항 변화를 모니터링하십시오. 이 시점에서 정확한 깊이 측정이 가능하도록 마이크로 조절기의 좌표를 0으로 설정합니다.전극 저항이 갑자기 떨어지며 패치 피펫이 경막을 관통할 때까지 1µm 단계로 전진합니다. 피펫의 유지 압력을 제거하십시오. 그다음, 1µm 단계로 전진하며 단일 유닛을 탐색합니다.200 millisecond 간격의 온-오프 펄스를 인가하여 전극 저항을 지속적으로 모니터링하며, 일반적으로 전극 저항의 증가는 단일 뉴런의 근접을 나타냅니다. 약 2 millivolts의 양성 활동 전위 파형이 기록될 때까지 전극을 전진시킵니다. 선택적으로 자발적 스파이킹 활동을 기록하고, 압전 소자를 사용하여 개별 수염을 가볍게 굴절시켜 수염 자극에 의한 스파이킹 활동을 확인함으로써 juxtasomal filling을 위한 최적의 조건을 확보합니다.저항이 25~35 MΩ이 되고 스파이크 진폭이 3~8 mV가 될 때까지 전극을 전진시켜 세포체 주변 충전(juxtasomal filling)을 시작합니다. 1 nA부터 시작하여 양의 제곱파 전류 펄스를 가합니다.AP 파형과 빈도를 모니터링하면서 전류를 0.1 nA씩 천천히 단계적으로 증가시킵니다. 블록 펄스의 온(on) 단계 동안 AP 빈도가 명확히 증가하는 것을 통해 막 개방을 모니터링하십시오. 충전 중 스파이크 파형은 폭이 증가하고 후과분극이 감소하는 양상을 보입니다. 안정적인 비오틴 주입을 유지하기 위해 충전 중 전류를 증가시키거나 감소시키십시오. AP 빈도가 갑자기 증가하면 전류 펄스를 줄이거나 중단하십시오. 이는 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과도한 유입으로 인한 독성을 방지하기 위함입니다.모든 뉴런은 충전 과정에 대해 서로 다르게 반응한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 세포체 주변 표지(juxtasomal labeling) 파라미터는 기록 조건에 따라 조정해야 합니다. 전류 주입을 중단한 후 신호를 면밀히 모니터링하십시오.충전 세션 후의 스파이크 파형은 보통 넓어지며, 세포에 가해지는 기계적 스트레스를 줄이기 위해 스파이크 파형이 원래의 특성으로 돌아올 때까지 뉴런의 회복을 기다리면 후과분극이 크게 감소하는 것이 나타납니다. 스파이크 진폭이 감소할 때까지 패치 피펫을 1 µm씩 단계적으로 후퇴시키고, 동물의 체온과 호흡을 면밀히 모니터링하면서 biotin이 세포 내로 확산될 때까지 최소 1시간 동안 기다립니다. 마지막으로 뇌 샘플을 채취하고 처리하여 세포체 주변 표지의 품질을 확인합니다.이 이미지들은 일차 체성감각 피질에서 세포체 주변 충전법(juxtasomal filling)으로 염색된 신경세포들의 모습을 보여줍니다. 이 두정엽 신경세포의 접선 방향 뷰는 수지상 돌기와 축삭의 크기 차이를 잘 보여줍니다. 이 세포체 주변 표지 신경세포의 디지털 재구성 이미지에서, 신경세포 투영 이미지는 고해상도 및 저배율로 표시되어 있으며, 자동 디지털 재구성을 통해 축삭은 파란색으로, 수지상 돌기는 빨간색으로 각각 겹쳐서 나타나 있습니다.여기서는 박스 영역을 확장하여 축삭 전체 길이에 걸쳐 나타나는 축삭 버튼을 보여줍니다. 이 마지막 애니메이션에서는 쥐의 일차 체성감각 피질에서 유래한 5층 두꺼운 깃털 모양 부수세포(thick tufted parametal neuron) 하나에 대한 재구성 파이프라인을 예시로 보여줍니다. 이 파이프라인은 100배 배율에서의 수지상 돌기 및 축삭 형태 재구성과 4배 배율에서의 배럴 윤곽 재구성을 포함합니다.결과물은 전체 3D 재구성 모델이며, 이후 형태학적 특성의 정량적 분석을 수행하기 위해 표준화된 기준 좌표계에 등록됩니다. 따라서 생체 내 juxta somal 라벨링은 전체 3D 형태를 신뢰성 있게 재구성할 수 있는 탁월한 라벨링 품질을 제공합니다. 본 영상에서는 우레탄으로 마취된 동물에서 이 방법을 시연하였습니다.하지만 Jux Somal 기록은 각 세포 유형과 층이 환경을 능동적으로 탐색하는 동안 수행하는 역할을 연구하기 위해, 머리가 고정된 각성 상태의 동물에게도 적용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 사후 식별 및 형태학적 재구성을 위해 개별 뉴런에 Biocidin 표지를 수행하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은...

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

이 비디오는 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런을 포함하는 고정된 쥐의 뇌 절편을 염색하는 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 아비딘-비오틴 복합체(ABC)를 사용한 배양, HRP 및 발색 기질로 염색, 사산화오스뮴으로 구조 보존, 이미징을 위해 조직을 수지에 삽입하는 것이 포함됩니다.

시각화를 위한 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 중간뉴런 라벨링

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

이 프로토콜은 경보를 발하는 쥐의 피질하 뇌 구조에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 머리 억제 메커니즘의 설계 및 외과적 이식을 설명합니다.  이 책은 병치세포 구성에서 단일 뉴런을 분리하고 해부학적 위치를 효율적으로 식별하는 절차를 설명합니다.

경고, 헤드 억제 쥐의 하위 대뇌 피질의 뇌 구조 내에서 Juxtacellular 모니터링 및 현지화 단일의 뉴런

이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

배우세요 쥐 두피 뉴런의 구조-기능 관계를 연구하는 생체소마 생화시틴 라벨링 기법을. 이 방법은 감각 처리 중 개별 뉴런의 활동과 형태를 연결하여 신경망 이해를 돕습니다.

Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

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