Juxtasomal Biocytin 레이블은 개별 두피 뉴런의 구조 - 기능 관계를 연구하는

본 실험 절차의 전체적인 목표는 정보 처리 과정 중 감각 피질에서 나타나는 세포 유형 특이적 활동 전위 스파이킹을 기록된 뉴런의 형태학적 정체성과 연결하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐를 수술적으로 준비하여 세포체 인접 기록(juxta somal recording)이 가능하도록 합니다. 준비가 완료되면 전극을 통해 자발적 및 감각 유발 스파이킹 활동을 기록하며, 전류 주입 및 주입법을 사용하여 기록된 뉴런에 biocidin을 충전합니다.

그 후, 뇌 조직을 비오틴 염색을 위해 처리합니다. 마지막으로, 비오틴이 채워진 뉴런을 연속 절편으로부터 디지털로 재구성하여 세포 유형을 분류합니다. 궁극적으로, 개별 뉴런의 세포체 인접 기록(juxtasomal recording)을 통해 피질 네트워크 내의 감각 처리 및 구조적 정보를 연구할 수 있습니다.

이 방법은 감각 처리 과정에서 개별 세포 유형과 층의 역할은 무엇인가와 같은 신경과학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 필요한 연구자들은 충전 과정 중에 뉴런이 매우 쉽게 사멸하기 때문에 어려움을 겪습니다. 최적의 품질의 피펫을 준비함으로써 biocidin 충전의 성공 확률을 높일 수 있으며, 또한 좁은 대역의 전류 주입을 제어하기 위해 숙련된 관찰력이 필요합니다.

따라서, 충분히 충전된 뉴런을 회수하는 성공률을 높이기 위해서는 숙련된 경험이 필요합니다. 먼저, 가열 패드가 장착된 정위 고정 장치에 마취된 Wistar 쥐를 놓습니다. 발가락 꼬집기 반사를 테스트하여 진정 깊이를 확인합니다.

그다음 직장 프로브를 삽입하여 적절한 체온을 유지합니다. 동물의 머리를 고정하고 수술 부위의 털을 제거합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 도포합니다.

수술 부위에 리도카인을 주입한 후 3~5분 동안 기다렸다가 두개골 표면을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 다음으로 남아 있는 조직을 모두 제거하고 0.9% sodium chloride 용액으로 두개골을 충분히 세척합니다. 좌반구의 일차 체성감각 피질 좌표를 결정하고 수술용 피부 마커 펜으로 두개골에 해당 위치를 표시합니다.

치과용 드릴을 사용하여 관심 영역의 뼈를 긁어냅니다. 뼈가 투명해지고 혈관이 명확하게 보일 때까지 계속해서 긁어냅니다. 다음으로, 메스를 사용하여 얇아진 두개골에 작은 창을 냅니다.

경막과 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 수술용 피부 마커 펜을 사용하여 개두술 부위의 가장자리를 표시합니다. 시야를 확보하기 위해 건조한 두개골 위에 순간접착제를 얇게 바른 후, 치과용 시멘트를 사용하여 배스(bath)를 구축합니다.

두개골 절개술을 마무리하며, 가시성을 높이기 위해 반대편의 수염을 정확히 5mm 길이로 다듬습니다. 기록을 시작하기 전, 다듬은 수염을 검은색 마스카라로 강조합니다. Boro Silicic 유리로 패치 피펫을 제작합니다. 이상적인 피펫 형태는 점진적으로 가느다란 테이퍼, 낮은 원추 각도, 그리고 약 1µm의 내부 팁 직경을 갖는 것입니다.

2% biotin이 첨가된 normal rad ringer를 패치 피펫에 채우고, 헤드 스테이지에 고정되어 마이크로 조작기에 연결된 피펫 홀더에 패치 피펫을 장착합니다. 쥐 S1의 D2 컬럼을 정확하게 타겟팅하기 위해, 전극 홀더의 각도를 시상면 기준 34도로 설정합니다. 다음으로, 패치 피펫을 두개골 절개 부위와 가까운 위치에 배치합니다.

욕조를 0.9% sodium chloride로 채웁니다. 증폭기를 브리지 모드로 설정하고, 양전류 주입 방식의 사각 펄스를 가하여 전극 저항을 측정합니다. 최적의 전극 저항 값은 3~5 MΩ 사이입니다.

100에서 150 millibar의 과압을 설정하고, 사각 펄스 형태의 양전류를 가하면서 패치 피펫을 1 micron 단계로 전진시킵니다. 경질막과 접촉 시 발생하는 급격한 저항 변화를 모니터링하십시오. 이 시점에서 정확한 깊이 측정이 가능하도록 마이크로 조절기의 좌표를 0으로 설정합니다.

전극 저항이 갑자기 떨어지며 패치 피펫이 경막을 관통할 때까지 1µm 단계로 전진합니다. 피펫의 유지 압력을 제거하십시오. 그다음, 1µm 단계로 전진하며 단일 유닛을 탐색합니다.

200 millisecond 간격의 온-오프 펄스를 인가하여 전극 저항을 지속적으로 모니터링하며, 일반적으로 전극 저항의 증가는 단일 뉴런의 근접을 나타냅니다. 약 2 millivolts의 양성 활동 전위 파형이 기록될 때까지 전극을 전진시킵니다. 선택적으로 자발적 스파이킹 활동을 기록하고, 압전 소자를 사용하여 개별 수염을 가볍게 굴절시켜 수염 자극에 의한 스파이킹 활동을 확인함으로써 juxtasomal filling을 위한 최적의 조건을 확보합니다.

저항이 25~35 MΩ이 되고 스파이크 진폭이 3~8 mV가 될 때까지 전극을 전진시켜 세포체 주변 충전(juxtasomal filling)을 시작합니다. 1 nA부터 시작하여 양의 제곱파 전류 펄스를 가합니다.

AP 파형과 빈도를 모니터링하면서 전류를 0.1 nA씩 천천히 단계적으로 증가시킵니다. 블록 펄스의 온(on) 단계 동안 AP 빈도가 명확히 증가하는 것을 통해 막 개방을 모니터링하십시오. 충전 중 스파이크 파형은 폭이 증가하고 후과분극이 감소하는 양상을 보입니다. 안정적인 비오틴 주입을 유지하기 위해 충전 중 전류를 증가시키거나 감소시키십시오. AP 빈도가 갑자기 증가하면 전류 펄스를 줄이거나 중단하십시오. 이는 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과도한 유입으로 인한 독성을 방지하기 위함입니다.

모든 뉴런은 충전 과정에 대해 서로 다르게 반응한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 세포체 주변 표지(juxtasomal labeling) 파라미터는 기록 조건에 따라 조정해야 합니다. 전류 주입을 중단한 후 신호를 면밀히 모니터링하십시오.

충전 세션 후의 스파이크 파형은 보통 넓어지며, 세포에 가해지는 기계적 스트레스를 줄이기 위해 스파이크 파형이 원래의 특성으로 돌아올 때까지 뉴런의 회복을 기다리면 후과분극이 크게 감소하는 것이 나타납니다. 스파이크 진폭이 감소할 때까지 패치 피펫을 1 µm씩 단계적으로 후퇴시키고, 동물의 체온과 호흡을 면밀히 모니터링하면서 biotin이 세포 내로 확산될 때까지 최소 1시간 동안 기다립니다. 마지막으로 뇌 샘플을 채취하고 처리하여 세포체 주변 표지의 품질을 확인합니다.

이 이미지들은 일차 체성감각 피질에서 세포체 주변 충전법(juxtasomal filling)으로 염색된 신경세포들의 모습을 보여줍니다. 이 두정엽 신경세포의 접선 방향 뷰는 수지상 돌기와 축삭의 크기 차이를 잘 보여줍니다. 이 세포체 주변 표지 신경세포의 디지털 재구성 이미지에서, 신경세포 투영 이미지는 고해상도 및 저배율로 표시되어 있으며, 자동 디지털 재구성을 통해 축삭은 파란색으로, 수지상 돌기는 빨간색으로 각각 겹쳐서 나타나 있습니다.

여기서는 박스 영역을 확장하여 축삭 전체 길이에 걸쳐 나타나는 축삭 버튼을 보여줍니다. 이 마지막 애니메이션에서는 쥐의 일차 체성감각 피질에서 유래한 5층 두꺼운 깃털 모양 부수세포(thick tufted parametal neuron) 하나에 대한 재구성 파이프라인을 예시로 보여줍니다. 이 파이프라인은 100배 배율에서의 수지상 돌기 및 축삭 형태 재구성과 4배 배율에서의 배럴 윤곽 재구성을 포함합니다.

결과물은 전체 3D 재구성 모델이며, 이후 형태학적 특성의 정량적 분석을 수행하기 위해 표준화된 기준 좌표계에 등록됩니다. 따라서 생체 내 juxta somal 라벨링은 전체 3D 형태를 신뢰성 있게 재구성할 수 있는 탁월한 라벨링 품질을 제공합니다. 본 영상에서는 우레탄으로 마취된 동물에서 이 방법을 시연하였습니다.

하지만 Jux Somal 기록은 각 세포 유형과 층이 환경을 능동적으로 탐색하는 동안 수행하는 역할을 연구하기 위해, 머리가 고정된 각성 상태의 동물에게도 적용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 사후 식별 및 형태학적 재구성을 위해 개별 뉴런에 Biocidin 표지를 수행하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.