Summary
신경 네트워크의 구조를 이해하기 위해, 개별 뉴런의 기능적, 형태 적 특성이 필요하다. 여기, 우리는 juxtasomal biocytin의 세포 구성에 전기 생리학 녹음을 할 수 있습니다 라벨, 아직 세포 내에서 돌기 및 축삭 아키텍처의 사후 재건 신경 레이블을 할 수있는 능력을 유지을 보여줍니다.
Abstract
대뇌 피질은 함께 네트워크로 의사 결정, 감각 유도 행위 나 메모리 등 많은 높은인지 기능에 대한 책임은 여러 계층의 많은 별개의 세포 유형의 특징입니다. 그러한 복잡한 네트워크의 연결이 이러한 작업을 수행하는 방법을 이해하기 위해, 중요한 단계는 동물인지 관련 태스크를 수행 할 때 우선적으로, 네트워크 내의 각각의 세포 유형의 기능 (또는 전기 활동)을 결정하는 것이다. 또한, 역 대뇌 피질의 네트워크를 설계 할 수 있도록 개별 뉴런의 네트워크와 형태 학적 구조의 해부학 적 구조를 결정하는 것도 중요하다. 현재 사용 가능한 기술 혁신이 기록 된 신경 세포를 식별하는 사후의 가치있는 옵션과 함께 동물 행동, 깨어있는 세포 활동을 기록 할 수 있습니다. 여기, 우리는 기록 작업 potenti을 포함 juxtasomal의 biocytin 라벨링 기술을 보여알은 기존의 패치 피펫을 사용하여 세포 (또는 느슨한 패치) 구성에 못을 박는. juxtasomal 기록 구성, 마취 진정 깨어 헤드 고정, 심지어 자유롭게 움직이는 동물 포함한, 행동 조건에 걸쳐 비교적 안정하고 적용 가능하다. 따라서,이 방법은 각각의 뉴런과 궁극적으로, 전체 대뇌 피질의 저항기의 재건에 동물의 행동 중에 세포 형 특정 활동 전위 스파이크를 연결 할 수 있습니다. 이 비디오 원고에서, 우리는 juxtasomal 구성의 개별 뉴런은 사후 식별 및 형태 학적 재구성을위한 우레탄 마취 쥐에 biocytin으로 표시 할 수있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
네트워크의 연결은 매우 구체적인 형태 및 생리 학적 특성 1-7 특징으로 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 결과적으로, 개별 셀 유형 (예를 들어 볼 Gentet 등. 8 Burgalossi 등. 9) 네트워크 내에서 전문적인 작업을 수행 할 수 있습니다. 우리는 신경 세포의 네트워크를 통해 세포 유형 특정 기능을 이해하기 시작하고 많이 발견되고 아직도있다. 이를 위해 많은 실험실은 생리 학적 매개 변수 1,10-15을 획득 한 한 동일한 신경 인구의 형태 학적 특성의 분석을 허용 실험적인 접근 방식을 구현하고 있습니다. 여기, 우리는 biocytin로 기록 된 신경 세포의 전기 충격과 함께 세포 (따라서 비 침습적) 구성에서 기존의 패치 피펫을 사용하여 전기 생리학 기록을 포함 juxtasomal 라벨링 기술 (16, 17)을 보여줍니다.이 방법의 가장 큰 장점은 비 침습적 자연 개별 신경 세포의 활동 전위 스파이크가 (예 : 투석) 세포의 세포 내 내용을 변경하지 않고 기록을 보장한다는 것입니다. 일렉트로에 이어, juxtasomal 접근 방식은 구조 (형태)에 기능 (생리)을 연결하는 사후 세포 식별 및 재건의 옵션을 제공합니다. 일반적으로, 형태 학적 재구성은 척추 및 / 또는 Bouton에서 밀도의 정량 또는 전자 현미경을 사용하여 나노 미터 해상도의 연결 형태의도 재건에 확장 될 수있다 돌기 및 축삭 형태의 재건을 포함한다. 대부분의 연구는 생쥐 나 쥐와 같은 작은 설치류의 기술을 적용하고 있지만 juxtasomal 기록 기술은 대뇌 피질의 층에 걸쳐 생물 종의 범위에있는 하위 대뇌 피질의 영역에서 다양한 세포 유형의 생체 내 녹음에 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 신경 세포를 기록하고 라벨에 초점을 맞추고 있습니다쥐 차 체성 감각 피질 (S1)에서 기록 뉴런 (18)의 시각적 식별을 포함, 표준화 된 참조 프레임의 정확한 등록과 함께 수상 복원 세포 유형 특정 지역의 특성을 대뇌 피질의 네트워크 4,19 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 리버스 엔지니어링 장거리 투사 (20)를 대상으로합니다.
웨이크 헤드 고정 (23), 또는 자유롭게 움직이는 동물 9보기, 대체 생체 기록하는 기술 (세포 내 또는 전체 세포)에 비해 juxtasomal 녹음은 상대적으로 안정적이고, 따라서 마취 21,22 포함한 행동 상태에 걸쳐 적용 할 수있는, (14)을 침착 . 우리는 선택의 많은 준비를이 기술의 일반적인 적용을 강조하지만 여기서 우리는, 우레탄 마취 쥐의 S1에서 juxtasomal 라벨을 보여줍니다.
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Protocol
1. 동물의 준비
모든 실험 절차는 VU 대학 암스테르담, 네덜란드에 현지 윤리위원회는 네덜란드 법에 따라, 평가 후에 실시된다.
- 복강 내 주사 (0.9 % 염화나트륨, 1.6-1.7 g / kg의 20 %) 우레탄 이소 플루 란 (산소 2 ~ 3 %)에이어서 위 스타 쥐 (P25-P45, ♂ / ♀)를 마취. 핀치 철수, 눈꺼풀 반사 및 vibrissae 움직임을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다.
- 경우 우레탄의 추가적인 용량 (초기 용량의 10 %) 투여 동물 충분한 마취 깊이에 도달하지 않거나 vibrissae 기라는 실험 과정 동안 관찰 될 때마다.
- 가열 패드 탑재 고정대에 마취 된 동물을 놓고 직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에서 37.5 ± 0.5 ° C에서 동물의 체온을 유지한다.
- 작업 현장에서 국소 마취를 위해 100 ㎕의 1 % 리도카인 피하 (0.9 % 염화나트륨의)를 주입하고 3-5 분을 기다립니다. 꼬리 - 투 - 주동이의 방향으로 절단하여 두개골의 표면을 덮고있는 피부를 제거하고 남은 조직을 청소합니다.
- 0.9 % 염화나트륨과 흡수성 면봉으로 광범위하게 두개골을 청소합니다.
- (: 2.5 mm 후방 및 브레 그마에 측면 5.5 mm 차 체 감각 피질 (S1)에 대한) 왼쪽 반구의 대상 영역의 좌표를 결정합니다. 외과 피부 마커 펜으로 두개골의 위치를 표시합니다.
- 뼈가 투명하게하고 혈관이 선명하게 보일 때까지 관심 영역에서 치과 드릴로 부드럽게 뼈를 다 쳤어요.
- 경막의 손상을 방지, 메스 (# 11)와 얇아진 두개골의 창을 절단하여 0.5 mm × 0.5 mm의 개두술을혈관. 선택적 : 시인성을 향상시키기 위해 외과 피부 마커 펜을 사용 개두의 가장자리를 표시한다.
- 개두술을 둘러싸는 목욕 (즉, 기록 챔버)를 구성하기 위해 건조 두개골 후 치과 시멘트에 순간 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다.
- 수염 뿌리에서 정확히 5 mm로 반대쪽에 수염을 손질. 옵션 : 블랙 마스카라 손질 수염을 강조 표시합니다.
2. Juxtasomal 녹음 및 Biocytin 라벨링
- 3-5 MΩ의 저항 전극을 얻기 위해 ~ 1 μm의 내부 팁 직경 붕규산 유리의 패치 피펫을 확인합니다. 참고 : juxtasomal 녹화를위한 이상적인 피펫 형태는 점진적으로 슬림 테이퍼, 낮은 원뿔 각도, 그리고 ~ 1 μm의 팁 (그림 1)입니다.
- (pial 표면에 대해)의 기록 깊이에 따라, 기록 전극의 테이퍼 치수는 조정되어야한다. 매우 중요한 그 t이다그 직경은 기록 영역에 대한 기계적 손상 또는 스트레스를 피하기 위해 뇌의 엔트리 포인트에서 75 μM 미만이어야 테이퍼. 상대적으로 깊은 대뇌 피질의 층에서의 기록이 최대한 외부로 다시 1,500 ~ 1,800 ㎛의 긴 테이퍼를 필요로하는 반면 이것은 피상적 인 대뇌 피질의 녹음을 위해, 최대로 75 μM의 외부 직경 300 ~ 500 ㎛의 테이퍼 (그림 1A)를 필요하다는 것을 나타냅니다 (전극 팁에서 1,800 μm의에서) 75 μm의 직경.
- 정상 쥐의 벨소리 (NRR)와 패치 피펫을로드 2 % biocytin 보충 (솔루션 및 시약 표 1 참조)과 미세 조작기에 고정 된 머리 무대에 패치 피펫을 탑재합니다.
- 특히 쥐 S1의 D2 열을 대상으로 시상면에 대하여 34 °에 전극 홀더의 각도를 설정합니다.
- 브리지 모드에서 증폭기 (즉, 현재 클램프)에 머리 단계를 연결합니다.
- 패치의 위치를개두술에 근접 피펫. 0.9 % NaCl로 목욕을 입력하고 긍정적 인 전류 주입 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)과 사각 펄스를 적용하여 평가 3-5 MΩ, 사이 여야 전극 저항을 결정합니다.
- 사각 펄스 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)로 양의 전류를 적용하는 동안 100 ~ 150 밀리바의 과압을 설정하고 1 μm의 단계에서 패치 피펫을 진행. 경막과의 접촉을 수립시 강력한 저항 변화를 모니터링합니다. 이 시점에서, 정확한 깊이 측정을 할 수 있도록 '제로'에 미세 조작기의 좌표를 설정합니다.
- 패치 피펫 전극 저항의 급격한 하락에 의해 지시 된 뇌경막을 침투 할 때까지 1 μm의 스텝 모드에서 진행. 피펫의 유지 압력을 제거합니다.
- 1 μm의 단계로 발전하면서 하나의 장치를 검색합니다. / 오프 펄스에서 200 밀리 초를 적용하여 지속적으로 전극 저항을 모니터링합니다. 전극 저항의 증가 typic동맹은 단일 신경 세포의 근접을 나타냅니다. 긍정적 인 활동 전위 (AP) ~ 2 측정 값의 파형 (그림 2A와 2B)을 기록 할 때까지 전극을 사전.
- 선택 사항 : 신경 세포의 자발적인 급상승 패턴을 기록하고 확인 수염 - 유발 꼬리 쪽 압전 소자 (18)를 사용하여 3.3 °의 각도로 200 밀리 초에 대한 개별 수염 편향, 예를 들어,에 의해 요동 치고.
- 저항이 25 ~ 35 MΩ과 스파이크 juxtasomal 작성의 최적 조건을 얻기 위해 3-8 값의 진폭을 때까지 전극을 사전. 양의 전류 (1 nA의 온 / 오프, 200 밀리 초)의 사각 펄스를 적용하여 juxtasomal 충전을 시작합니다. AP 파형 및 주파수 (그림 2A와 2B)를 모니터링하면서 천천히하고 점차적으로 0.1 nA의 단계에 의해 전류를 증가시킨다.
- 블록 펄스 (그림 2C의 온 단계에서 AP의 주파수에있는 명확한 증가로 막 개방을 모니터 (그림 2C와 2D)를 보여줍니다. 추가 매개 변수를 증가 잡음이나 작은 (1-5 MV) 음의 DC의 변화를 포함한다.
- 증가 또는 안정 biocytin 주입을 유지하기 위해 작성하는 동안 (1 NA) 전류를 감소시킨다. 축소 또는 나트륨 이온과 같은 세포 외 이온의 과잉 유입하여 독성을 피하기 위하여 AP 주파수의 급격한 증가에 따라 전류 펄스를 멈춘다. 참고 : 모든 신경 세포가 표시 매개 변수는 개별 촬영 조건에 따라 조정해야 할 현재의 주입 및 juxtasomal에 다르게 반응합니다.
- 밀접 전류 주입을 정지 한 후에 신호를 모니터링한다. 충전 세션 후 스파이크 파형은 일반적으로 확대하고 강력한 과분극 후 감소를 보여줍니다. 스파이크 파형 (원래 속성의 즉 존재를 반환 할 때 명백한 신경 세포의 복구를 기다립니다정상 후 과분극, 그림 2).
- 개선 된 염색 품질 biocytin 부하를 증가시키는 신경 세포의 완전한 복구 후 세션을 작성 biocytin 반복합니다.
- 스파이크 진폭이 세포에 기계적 스트레스를 줄이기 위해 감소 할 때까지 1 μm의 단계로 패치 피펫을 철회. 밀접하게 동물의 체온을 모니터링하고 호흡하면서 세포 내 확산 biocytin 적어도 1 시간을 기다립니다.
3. 동물을 관류하고 뇌를 제거
- , 관류 설치를 준비 린스, 0.9 % NaCl로 튜브를 미리로드.
- 수술 트레이에 동물을 배치하고 표준 라벨 테이프로 고정합니다. 마취의 충분한 깊이를 확인, 발 핀치와 눈꺼풀 반사가 존재해야한다.
- 다만 갈비뼈 아래 복부 벽을 절개 (5-6 센티미터) 옆쪽과 흉골을 노출 후방 - 전방 방향으로 진행 중간을 확인합니다.전방 흉골을 당겨 조심스럽게 진동판에서 간을 구분합니다.
- 하부 리브 통해 잘라 다이어프램에 작은 절개를하고 심장을 노출 복강의 전체 길이를 따라 절개를 계속한다.
- 심낭을 제거합니다.
- 좌심실에 바늘을 삽입하고 우심방 절개를합니다. 간장의 탈색이 완료 될 때까지 0.9 %의 NaCl (~ 13 ㎖ / 분)로 Perfuse.
- 앞 발 강성까지 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 주입을 전환하고 아래턱은 명백하다.
- 가위를 사용하여 쥐의 목을 벨
- 나머지 목 근육을 제거하고 완벽하게 두개골을 노출합니다.
- 등의 측면에서 뇌간에있는 가위를 놓고 지느러미 위치를 유지, 시상 봉합을 따라 조심스럽게 뼈를 잘라.
- 집게를 사용하여 뇌를 노출하는 시상 봉합의 양쪽에서 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 개발을 방지하기 위해 경질을 제거amage.
- 조심스럽게 두뇌의 복부 측면에 무딘 주걱을 삽입하고 부드럽게 뇌를 제거합니다.
- 4 ° C에서 PFA에 전체 뇌 하룻밤 후 수정 0.05 M 인산염 완충액 (PB)에 뇌를 전환하고 4 ℃에서 저장
4. 접선 섹션의 뇌 슬라이스
- 0.05 M PB 중 뇌를 가지고 앞쪽에 직면 여과지에 넣어. 관상면을 따라 소뇌을 차단하고, 중간 시상면을 따라 절단하여 반구를 분리하기 위해 날카로운 면도날을 사용합니다.
- 설치 플랫폼에 순간 접착제를 적용하고 전방 오른쪽에 직면과의 시상면의 왼쪽 반구를 탑재합니다. vibratome에 45 °의 각도로 장착 플랫폼을 확보하고 0.05 M PB의 머리를 물속에.
- vibratome에 면도날을 보호하고 뇌 표면과 첫 접촉은 반구의 전후방 평면의 중앙에 있는지 확인합니다. (24) 100 μm의 컷섹션 0.05 M PB를 포함하는 24 웰 플레이트에서 그들을 수집합니다.
5. 조직 학적 절차
- 앞에서 설명한 방법 (25)에 따라 시토크롬 산화 효소 염색 (24)와 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 방법에 대한 조직 학적 프로토콜을 수행합니다. 선택 사항 : 형광 아비딘 / 스트렙 타비 딘 - 알렉사 복합체를 사용하여 biocytin 시각화. 이것은 또한 역 행성 또는 선행 성 추적 기술과 이중 염색을 할 수 있습니다.
- 0.05 M PB와 3-3'-디아 미노의 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션을 표 2 참조 (층 4 S1의 (L4)에서 배럴을 시각화하는 시토크롬 산화 효소 염색에 대한 솔루션을 함유를 준비하고 씻을 섹션 5 × 5 분 시약). 37 ℃에서 30 ~ 45 분 동안 예열 된 용액에서 PIA의 섹션 6-12을 품어
- 6 × 5 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어 3 % H 2의 모든 섹션을 배양하여 내인성 과산화 효소 활성을 끄다 2.
- 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 4 ℃에서 하룻밤 (솔루션 및 시약 표 3 참조) ABC-솔루션 섹션을 품어
- 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 헹구고 (솔루션 및 시약 표 4 참조) biocytin 가득한 신경 세포를 시각화하는 DAB-솔루션을 준비합니다. 실온에서 45 ~ 60 분 동안 필터링 솔루션 섹션을 품어.
- 5 × 10 분 동안 0.05 M PB로 섹션을 씻어. 현미경 슬라이드와 MOWIOL와 커버 슬립 (솔루션 및 시약 표 5 참조)에 마운트 부분.
- 광학 현미경을 사용하여 라벨의 품질을 결정합니다.
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Representative Results
개별 신경 세포의 3 차원 구조에 대한 자세한 지식은 신경 네트워크의 조직 원리를 해명 중요합니다. 우리의 방법은 이에 사후 신경 세포의 분류 및 수상 및 높은 해상도에서 단일 신경 세포의 축삭 아키텍처의 자세한 재건을 허용, 생체 준비에서 높은 품질의 biocytin 라벨을 달성하기 위해 파이프 라인을 포함한다. juxtasomal 라벨의 품질에 따라, 뉴런은 희미한 매우 정확하게 기록 위치에 19, 26에 해당하는 위치에 강렬한 DAB 신호에 이르기까지 다양한 DAB-강도로 복구됩니다. 우리 실험실에서, 숙련 된 실험자 우레탄 마취 설치류 30 ~ 40 %의 성공 속도로 동작한다. 뇌, 2) 우수한 표시 품질을 채워 1) 하나의 뉴런이 하나의 신경 세포가 다음 기준을 충족하는 세 가지 중 실험에 돌기 및 축삭의 재건을 위해 선택되어 있음을 나타냅니다3) biocytin 신호가 축삭 돌기를 따라 일정 4) CYT C의 counterstaining이 신경 세포의 등록을 할 수 있도록 성공, 원심 끝에서 감소하지 않고, 조직 검사 중 뇌 조각 5) 손상되지 않습니다. 제한 요인은 모든 실험 (마취 및 / 또는 깨어)의 80 % ~에 기록 된 신경 세포 (소마와 수상 돌기)를 복구 할 것을 의미, 일반적으로 부족 biocytin 라벨입니다. 이것은 세포 유형 분류를위한 아니지만 축삭 아키텍처의 신뢰성과 완전 재구성을 위해 충분하다. 하나의 가시 피라미드 신경 세포 (그림 3A)와 하나의 interneuron의 (그림 3B), 그림 3에서, 우리는 적절한 juxtasomal 라벨링 후 DAB 신호 biocytin 표지 된 신경 세포의 두 가지 예를 보여줍니다. 인접 접선 섹션의 재건은 전체 신경 세포의 형태학 18,22,23,27,28를 얻기 위해 시리얼 재구성 할 수 있습니다. 예를 들어 해부학 적 참조 프레임 또한, 조직 학적 염색 (에차 체성 감각 피질) 표준화 된 참조 프레임 4,19에 하나의 뉴런을 등록 할 수 있습니다. 여기에 제시된 두 가지 예는 분류하고 이후에 수동 또는 자동 시스템과 형태 학적 특성 (그림 4) 15,20,29-31을 재구성하는 최적의 조건을 반영합니다.
라벨 biocytin juxtasomal 그림 1. 전극 특성. (A) pial 표면에 대하여 300 ~ 500 μm의 깊이에서 대뇌 피질의 뉴런의 juxtasomal 기록을위한 전극. (B) 1,500 ~ 1,800 μm의 기록 깊이에서 대뇌 피질의 뉴런의 juxtasomal 기록을위한 전극. 패널 (A)와 (B) 간의 테이퍼 길이 차이를 참고. (
그림 2. biocytin 충전시 전기 생리학 속성은. (A, B) 자발적인 활동 전위는 biocytin에 신경을로드 양의 전류 (온 / 오프 200 밀리 초) 사각 펄스의 응용 프로그램 중에 불충분 한 진폭 관찰된다. (C) 허용하는 신경 세포의 막 개방의 현재 진폭 결과를 증가 biocytin 로딩,에 상 O 동안 위상 동기 버스트 스파이크로 추적에 표시F 펄스. (D) 작성하는 동안 스파이크 파형은 증가 폭을 보여주고 과분극 후 감소. 스파이크 진폭 비교를 위해 B의 진폭을 스파이크로 정규화됩니다. 일반 스파이크 폭과 주파수를 관찰 할 수있다 충전 세션 이후의 신경 세포를 성공적으로 복구 한 후 (E, F). 스파이크 진폭 비교를 위해 B의 진폭을 스파이크로 정규화됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 우레탄 마취 쥐의 차 체성 감각 피질 juxtasomally 못 뉴런에서 Biocytin-DAB 라벨. 접선의 (A) 피라미드 신경 세포보기. 수상 돌기 및 축삭의 직경 크기에 눈에 띄는 차이가 있습니다. 접선보기 (B) 패스트 요동 치고 interneuron의. 수상 돌기 및 축삭의 구슬로 장식 된 구조를합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
juxtasomally 레이블 신경 세포의 그림 4. 디지털 재건. (A) 신경 돌기의 높은 해상도 이미지 (그러나 낮은 배율) 반 자동화 이미징 파이프 라인을 사용하여 쥐 차 체성 감각 피질의 층 (6) 신경 세포의 100 μm의 접선 조각에서 얻을. (B) 자동 디지털 복원과 (A)과 동일한 이미지는 파란색, dendr에 (축삭을 입혔다) 각각 빨간색으로 ITE. (B)에서 (C) 브라켓 상자 juxtasomal 라벨을 사용하여 축삭 재건의 안정성을 설명하기 위해 확대 한. 축삭의 길이에 걸쳐 축삭 BOUTONS 주, 2 개의 BOUTONS 검은 화살표로 강조 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| mM의 | g / 리터 | |
| 135 | 염화나트륨 | 7.8894 |
| 5.4 | 의 KCl | 0.40257 |
| 1.8 | 염화칼슘 | 0.26464 | |
| 1 | MgCl2를 | 0.2033 |
| 5 | HEPES | 1.1915 |
| NaOH로 7.2로 산도를 조정 | ||
| 20 mg/ml-1 biocytin 추가 |
표 1. 정상 쥐 벨소리는 Biocytin 보충.
| 8 밀리그램 | 말 마음에서 시토크롬 C |
| 8 밀리그램 | Catalas소의 간에서 전자 |
| 265 μL | 75 ㎎ / ㎖ DAB |
| 40 ㎖ 0.05M PB에 용해 | |
| 37 ° C에서 필터 예열 솔루션 | |
표 2. 시토크롬 C 산화 효소 염색을위한 솔루션을 제공합니다.
| 1 방울 | 시약 |
| 1 방울 | 시약 B |
| 0.5 ㎖ | 10 % 트리톤 (Triton) X100 |
| 광명 = "21"스타일 = "높이 : 21px;"> 9.5 ㎖의 0.05M의 PB에 용해 (미리 45 분) | |
| 410 ㎕의 솔루션을 추가 /도 | |
| 한 24 웰 플레이트 ABC-솔루션을위한 프로토콜. | |
표 3. Vectastain 표준 ABC-키트 솔루션입니다.
| 265 μL | 75 ㎎ / ㎖ DAB |
| 13.4 μL | 30 % H 2 O 2 |
표 4. DAB 염색에 대한 솔루션을 제공합니다.
| 6g | 분석 학년 글리세롤 |
| 2.4 g | MOWIOL 4-88 |
| 수동 글리세롤 코트 MOWIOL 10 분 교반 | |
| 6 ML | 증류수 H 2 O |
| 2 시간 동안 실온에서 알을 품다 | |
| 12 ML | 0.2 M 트라이의 pH를 8.5 |
| 1 시간에 50 ° C의 수조에서 부화 - O / N, 가끔 저어 | |
| -20 ° C에서 5,000 XG, 나누어지는 및 매장에서 원심 분리기 15 분 | |
표 5. MOWIOL 솔루션입니다.
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Discussion
juxtasomal 방법은 행동 조건에서 하나의 단위에서 생체 활동 전위 급상승에 기록 할 수 있습니다 (마취 깨어 머리를 고정하거나 자유롭게 이동) biocytin-라벨 사후 세포 유형 분류 및 / 또는 3D 재건 기록 된 신경 세포의 옵션. 가장 큰 장점은 세포 (따라서 비 침습적) 구성의 생리 학적 파라미터를 획득하는 것입니다, 아직 biocytin 16,17,32과 세포 내 신경 세포에 라벨을 할 수있는. 라벨링 biocytin 이외에,이 기술은 DNA, RNA, 단백질, 또는 형광 염료 33,34 뉴런을 주입하는데 사용될 수있다. 이 방법의 가장 명백한 단점은 라벨의 시각적 품질 제어 아마도 부족하고 실험 기간 동안 라벨링 품질 검사의 그러므로 결코이다. 그러나, 기록 조건, 특히 활동 전위 모양 라벨링 절차의 성공 여부를 평가하기 위해 사용될 수있다. 채소에 대한전류 펄스 동안 급상승 주파수가 극적으로 증가 할 때 후부, 밀도 biocytin-DAB 라벨이 신경 세포를 복구의 가능성은 후 과분극 활동 전위 파형과 폭이 넓어 (그림 2 참조)의 실종과 함께, 증가한다. 또한, biocytin-라벨의 품질을 직접 여러 긴 충전 세션 (> 60 초)가 각각의 짧은 충전 세션 (<30 초)에 비해 더 나은 조직 학적 품질이 저하 될 것 같은보기, 별도의 라벨 세션의 합계 길이에 상관 관계 . 마지막으로, 추적 확산을위한 생존 시간은 매우 원심 구획의 라벨 강도를 결정합니다. 일반적으로, 높은 품질의 전기 충격 후 1 시간의 생존 기간은 장거리 intracortical 축삭 돌기의 충분한 라벨을 보장합니다. 이러한 장기 전망의 한 예는 차 체성 감각 피질 또는 dysgranular에 돌출 차 체성 감각 피질에서 신경 세포이다영역은 따라서 수 밀리미터 떨어져 라벨 사이트 4,20 출신 지역에 투사. 더 큰 차원의 축삭 돌기 (예 : 시상 피질 돌기 등)을 조사 할 때, 생존 시간은 15 증가한다. 실현하기 위해 중요한 신경 세포의 전기 충격으로 인해 전극 액 과도한 나트륨의 유입에 신경 세포의 생리적 상태에 지대한 영향을 미칠 것입니다. 따라서, 그것은 매우 활동 전위 스파이크의 전체 복구를 할 수 있도록 대기 에피소드와 에피소드를 채우고 biocytin이 돌기 및 축삭 arborizations 12,31 따라 확산을 허용 할 때 세션을 작성 후 촬영 조건을 모니터링 뒤섞하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
authros는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 PROFS에게 감사의 말씀을 전합니다. 광범위한 지원을위한 Huibert Mansvelder 버트 Sakmann, 유익한 토론 및 기술 지원에 대한 연결을 추적하고, 브렌든 Lodder을 제공하는 박사 마르셀 Oberlaender. 데이터는 관대 R. 브루노 (컬럼비아 대학., NY, USA)에서 제공하는 LabVIEW 용 ntrode VI를 사용하여 획득 하였다. 이 연구는 막스 플랑크 사회와 전산 신경 과학, 튀빙겐에 대한 번스타인 센터에 의해 지원되었다 (독일 연방 교육 연구부 (BMBF 재정 지원, FKZ : 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics 및인지 연구 센터 (CNCR) , 신경 과학 캠퍼스 암스테르담 (NCA), CPJdK (NWO - ALW 번호 822.02.013와 ENC-네트워크 # 1 P3-C3)와 VU 대학 암스테르담에 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
