Abstract
فتحت الاستخدام الواسع النطاق للجيل القادم تسلسل آفاقا جديدة لأبحاث السرطان والتشخيص. سوف NGS جلب كميات هائلة من بيانات جديدة عن السرطان، وخاصة سرطان علم الوراثة. والمعرفة الحالية والاكتشافات المستقبلية تجعل من الضروري لدراسة عدد كبير من الجينات التي يمكن أن تشارك في الاستعداد الوراثي للسرطان. في هذا الصدد، قمنا بتطوير تصميم Nextera لدراسة الجينات كاملة 11 المشاركة في إصلاح الحمض النووي الضرر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة الجينات بأمان 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAD80، وTP53) من المروج ل3'-UTR في 24 مريضا في وقت واحد. هذا البروتوكول، على أساس تكنولوجيا transposase وإثراء gDNA، ويعطي ميزة كبيرة من حيث الوقت لتشخيص بفضل الجيني لعينة المتنوعة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها بأمان مع gDNA الدم.
Introduction
في عام 2010، ما يقرب من 1.5 مليون شخص (النساء أساسا) تطوير سرطان الثدي في جميع أنحاء العالم. وتشير التقديرات إلى أن 5 إلى 10٪ من هذه الحالات كانت وراثية. قبل 20 عاما تقريبا، تم تحديد BRCA1 و BRCA2 كما تشارك في الثدي وراثي وسرطان المبيض 1. منذ حوالي 15 عاما، تم التسلسل المناطق الترميز BRCA1 و BRCA2 لتحديد استعداد وراثي لسرطان الثدي والمبيض. تم الكشف عن تغييرات في BRCA1 و BRCA2 في 10 إلى 20٪ من الأسر المختارة 2 يشير إلى أن تحليل هذه المناطق ليست كافية لفحص فعالية. مؤخرا، أبرزت تحليل تسلسل غير الترميز (المروج، الإنترونات، 3'UTR) من BRCA1 و BRCA2 أن الطفرات الجديدة / الاختلافات يمكن ربط لخطر الاصابة بسرطان الثدي 3-6.
وتشارك BRCA1 و BRCA2 البروتينات في إصلاح إعادة التركيب مثلي (HHR)، التي أنجزت من قبل العديد من الشركاء 7. في حين التعديلات BRCA1 أو BRCA2 في تحفز عيوب في إصلاح الحمض النووي، والشركاء الآخرين قد يؤثر أيضا من خطر الإصابة بسرطان الثدي. ويبدو أن هذه الفرضية قد تم التحقق من صحة منذ BRIP1 8 و 9 PALB2 يكون لها تأثير مؤكد على سرطان عنق الرحم والثدي، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، الأخريين "مخاطر معتدلة" سرطان الثدي جينات القابلية، أجهزة الصراف الآلي وCHEK2، يمكن أيضا أن تدرس بشكل روتيني 10.
وانطلاقا من هذه الدراسات، قررنا وضع بروتوكول لتحليل جينات 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAP80، وTP53) في وقت واحد باستخدام 24 مريضا من السهل جدا ونسبيا بروتوكول سريع على أساس تكنولوجيا transposase، مع تخصيب وتسلسل على جهاز الإنتاجية المتوسط. شكرلهذه التقنية، فإننا تسلسل الجينات كاملة من بداية المروج إلى نهاية 3'-UTR، باستثناء RAP80، والتي لم تغطى منطقة intronic من 2،500 سنة مضت (Chr5: 176،381،588-176،390،180). هذا يمثل ما مجموعه حوالي 1000300 BP درس مع 2،734 التحقيقات. عادة، يتم تحليل BRCA1 و BRCA2 تسلسل exonic بواسطة سانجر التسلسل الذي يحتاج 1.5 أشهر لأقل من 20 مريضا. مع هذا البروتوكول (الشكل 1)، في الوقت نفسه، يمكن تحليل الجينات 11 كاملة لأكثر من 75 مريضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تقييم gDNA (DNA الجينومي) العائد
- تحديد المستخرجة حديثا gDNA قبل إعداد المكتبة. استخدام أسلوب تقييم العائد فلوروميتريك لتحديد gDNA سليمة (تجنب استخدام معمل لgDNA تقييم العائد). قياس (260/280 نانومتر) نسبة وضمان أن تكون بين 1.8 و 2. ملاحظة: 50 نانوغرام من gDNA هناك حاجة للتجربة.
2. gDNA التخصيب: 1 يوم، صباح
- قبل البدء
- من عدة تخصيب الحمض النووي (انظر جدول المواد / المعدات)، ذوبان الجليد عازلة الحمض النووي (TD) وانزيم DNA (TDE1) حلول على الجليد. على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام، وجلب تنقية حبات مغناطيسية ووقف الهدف (ST) العازلة إلى درجة حرارة الغرفة (RT). إضافة 20 ميكرولتر من العينة gDNA في 2-2.5 نانوغرام / ميكرولتر مباشرة في لوحة 96 جيدا، 1 جيدا لكل عينة. هام: استخدام تحكم إيجابية للتحقق من صحة البروتوكول (عينة مع اختلاف تسلسل معروف).
- Tagmentation
- Mتاسعا جميع الكواشف بشكل دقيق من قبل قلب 5X، وتدور باستمرار لفترة وجيزة. في RT، إضافة 25 ميكرولتر من العازلة TD إلى جانب كل منها يحتوي على 50 نانوغرام (20 ميكرولتر) من gDNA، ثم 5 ميكرولتر من العازلة TDE1. تعيين ماصة ل50 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X.
- تغطية لوحة مع فيلم لاصقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية. ثم، وضع لوحة في thermocycler (غطاء تسخينه عند 100 ° C) وتشغيل البرنامج التالي: 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 10 درجة مئوية لمدة غير محددة.
- خلال هذه الحضانة، وإعداد ورقة عينة مع برنامج إدارة تجربة لتحديد المؤشرات التي سيتم استخدامها.
- Tagmentation تنقية
ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة. نكون حذرين للغاية.- تحقق من عدم وجود راسب في تنقية حبات مغناطيسية وعازلة ST. إذا الرواسب موجودة، الاحماء الحلول في اليدين. العازلة إعادة تعليق ذوبان الجليد (RSB) على الجليد.
- في RT، دوامة ST الحل وإضافة15 ميكرولتر من كل عينة تحتوي أيضا. تعيين ماصة ل65 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. احتضان لمدة 5 دقائق على RT. تغطية لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- إضافة 52 ميكرولتر من تنقية حبات مغناطيسية مختلطة سابقا في كل بئر. تعيين ماصة ل117 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. تغطية لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- إزالة الفيلم لاصقة. وضع لوحة 96 جيدا على حامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في RT. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما.
- يعد حل الطازجة الإيثانول 80٪ (لمدة 24 عينات، إضافة 2 مل من الماء المقطر إلى 8 مل إيثانول). إزالة وتجاهل طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو الخرز.
- مع الحفاظ على لوحة على الوقوف المغناطيسي، وإضافة 200 ميكرولتر من الطازجة 80٪ من الإيثانول إلى كل بئر من دون إزعاج الخرز واحتضان لوحة لمدة 30 ثانية على الأقلفي درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف وتكرار هذا يغسل مرة ثانية. ضمان الإيثانول قد أزيلت. اسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة أو حتى التبخر الكامل للإيثانول.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي وإضافة 22.5 ميكرولتر من RSB العازلة. تعيين ماصة ل22.5 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. وضع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي واحتضان لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. نقل بلطف 20 ميكرولتر من طاف في لوحة 96 بئر جديدة.
ملاحظة: اختياريا، تحديد حجم العينات tagmented باستخدام محلل شظية. بدلا من الخطوات المذكورة أعلاه، استخدام عالية الدقة هلام الأكريلاميد الكهربائي. يجب أن تكون شظايا بين 150 و 1،000 بي بي BP.
- 1 شارع PCR التضخيم
- ذوبان الجليد PCR مزيج الرئيسي يحتوي البلمرة (LP-PMM)، رقم 1 التمهيدي، ومؤشر 2 الحلول التمهيدي على الجليد. تتناسب مع مجموعة سالفهارس جمعة مع ورقة عينة مدير التجربة. لمضاعفة، وإعداد I7 مختلفة من المؤشر 1 (I7، N7xx) لكل عينة.
- في كل بئر، إضافة 20 ميكرولتر من LP-PMM، 5 ميكرولتر من مؤشر 1، و 5 ميكرولتر من مؤشر 2. تعيين ماصة 50 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. تغطية لوحة مع فيلم microseal اللصق. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- وضع لوحة في thermocycler (غطاء تسخينه عند 100 ° C) وتشغيل البرنامج 1 (الجدول 1).
ملاحظة: قد يتم إيقاف الإجراء في هذه المرحلة وردود الفعل تخزينها بين عشية وضحاها في thermocycler أو لمدة 2 أيام بين 2 و 8 درجات مئوية.
3. gDNA التخصيب: 1 يوم، بعد الظهر
- قبل البدء
- oligos ذوبان الجليد (منظمات المجتمع المدني)، والتقاط الهدف عازلة 1 (NCT1)، وRSB الحلول على الجليد. على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام، وجلب تنقية حبات مغناطيسية لRT.
- PCR تنقية
- أجهزة الطرد المركزي لوحة من الخطوة 2.4، لمدة 1 دقيقة في 280 XG في 20 درجة مئوية.
- في RT، إضافة 45 ميكرولتر من تنقية مختلطة حبات مغناطيسية في كل بئر. تعيين ماصة ل95 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. وضع لوحة 96 جيدا على حامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في RT.
- تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. يعد حل الطازجة الإيثانول 80٪ (لمدة 24 عينات، إضافة 2 مل من الماء المقطر إلى 8 مل إيثانول). تجاهل طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
- مع الحفاظ على لوحة على الوقوف المغناطيسي، وإضافة 200 ميكرولتر من الطازجة 80٪ من الإيثانول إلى كل بئر من دون إزعاج الخرز واحتضان لوحة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف وتكرار هذا يغسل مرة ثانية. ضمان الإيثانول قد أزيلت. اسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي وإضافة 40 ميكرولتر من RSB العازلة. تعيين الأنابيبTTE إلى 40 ميكرولتر، ماصة بلطف صعودا وهبوطا كامل حجم 10X.
- وضع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي واحتضان لمدة 2 دقيقة. يجب أن تظهر طاف واضحة تماما. نقل بلطف 38 ميكرولتر من طاف في 96 لوحة جيدا الجديدة.
- تحديد العائد من كل عينة بطريقة fluorimetric. هذا الجزء الأول من البروتوكول سيتم التحقق إذا كانت العوائد المقررة ما بين 30 و 50 نانوغرام / ميكرولتر.
- 1 شارع التهجين
- تجميع ما يصل إلى 12 عينة في تجمع في هذه المرحلة عن طريق خلط 500 نانوغرام من كل عينة في 96 لوحة جيدا الجديدة. تأكد من أن الحجم النهائي من كل تجمع لا يتجاوز 40 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، خفض مستوى الصوت حمامات باستخدام جهاز فراغ المكثف في RT (تنبيه: تركيز الحمض النووي لا يمكن تعديلها عن طريق التسخين، حتى عند 30 درجة مئوية وتسبب التدفئة تدهور DNA). ضبط الحجم النهائي إلى 40 ميكرولتر بإضافة حل RSB. - تماما مزجNCT1 الحل. لكل جانب تحتوي على 40 ميكرولتر من عينات الحمض النووي المجمعة، إضافة 50 ميكرولتر من NCT1، و 10 ميكرولتر من منظمات المجتمع المدني. تعيين ماصة ل100 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- وضع لوحة في thermocycler (غطاء تسخينه عند 100 ° C) وبرنامج تشغيل 2 (الجدول 1).
- تجميع ما يصل إلى 12 عينة في تجمع في هذه المرحلة عن طريق خلط 500 نانوغرام من كل عينة في 96 لوحة جيدا الجديدة. تأكد من أن الحجم النهائي من كل تجمع لا يتجاوز 40 ميكرولتر.
4. gDNA التخصيب: 2 يوم، صباح
- قبل البدء
- من عدة تخصيب الحمض النووي (انظر جدول المواد / المعدات) ذوبان الجليد 2 N هيدروكسيد الصوديوم (HP3)، الهدف شطف عازلة 1 (ET1)، الهدف شطف العازلة 1 ET2، حبات مغناطيسية streptavidin (SMB)، وغسل الحل 1 (WS1)، وغسل الحل 2 (WS2)، محلول الغسيل 3 (WS3)، حلول منظمات المجتمع المدني، وNCT1 في RT.
- 1 شارع التهجين غسل
- إزالة 96 لوحة جيدا من thermocycler والطرد المركزي 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية. إزالة الغطاء لاصقة يتنبه جداLLY.
- نقل مزيج التفاعل 100 ميكرولتر من لوحة إلى لوحة MIDI 96 بئر جديدة وإضافة 250 ميكرولتر من الحل SMB vortexed جيدا. تعيين ماصة ل350 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. ختم لوحة واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية، وإزالة الختم لاصق ووضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. تجاهل طاف وإزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 200 ميكرولتر من الحل WS1 تمتزج جيدا في حبات تحتوي أيضا. تعيين ماصة ل200 ميكرولتر ماصة وبلطف صعودا وهبوطا كامل حجم 15X تجنب تشكيل فقاعات / رغوة.
- وضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. تجاهل طاف وإزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 200 ميكرولتر من الحل WS2 تمتزج جيدا في آبار حساب المشتركحبات ining. تعيين ماصة ل200 ميكرولتر وبلطف ماصة وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 15X تجنب تشكيل فقاعات / رغوة.
- وضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. تجاهل طاف وإزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 200 ميكرولتر من الحل WS2 تمتزج جيدا في الآبار التي تحتوي على الخرز. تعيين ماصة ل200 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 15X.
- نقل وحدة التخزين بالكامل في لوحة 96 جديدة جيدا. ختم لوحة ووضع لوحة في thermocycler (غطاء ساخنة في 100 درجة مئوية). إطلاق thermocycler في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- Imediately وضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. إزالة الختم وتجاهل فورا جميع طاف. ثم، إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 200 ميكرولتر من WS2 في الآبار التي تحتوي على الخرز. تعيين ماصة ل200ميكرولتر وبلطف ماصة وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 15X تجنب تشكيل فقاعات / رغوة. ختم لوحة ووضع لوحة في thermocycler (غطاء ساخنة في 100 درجة مئوية). إطلاق thermocycler في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وضع لوحة على الفور الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. إزالة الختم وتجاهل فورا جميع طاف. ثم، إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 200 ميكرولتر من الحل WS3 تمتزج جيدا في الآبار التي تحتوي على الخرز. تعيين ماصة ل200 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 15X.
- وضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. تجاهل كل من طاف وإزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- تكرار WS3 يغسل مرة ثانية.
- بعد إزالة طاف، وختم لوحة أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لهدم طاف المتبقية. وضع لوحة علىالوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف المتبقية.
- في أنبوب 0.2 مل، مزيج 28.5 ميكرولتر من ET1 و 1.5 ميكرولتر من الحلول HP3. هذا المزيج هو ل1 بركة، إذا تم إعداد المزيد من برك، وتتضاعف هذه الكميات من قبل عدد من أحواض أعدت.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. إضافة 23 ميكرولتر من المزيج المذكور أعد. تعيين ماصة ل23 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 15X. ختم لوحة ويترك لمدة 5 دقائق على RT. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- وضع لوحة على الوقوف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما. إزالة الفيلم لاصقة ونقل 21 ميكرولتر من طاف لوحة 96 بئر جديدة.
- إضافة 4 ميكرولتر من الحل ET2 إلى كل بئر. تعيين ماصة ل25 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X وختم اللوحة.
ملاحظة: قد يتم إيقاف الإجراء في هذه المرحلة وردود الفعل تخزينها لمدة تصل إلى 7 أيام في -15 ° C. إذا تم تجميدها لوحة، وذوبان الجليد تماما قبل بدء التهجين 2 الثانية.
- 2 الثانية التهجين
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية. إزالة الفيلم لاصقة وإضافة 50 ميكرولتر من NCT1، 10 ميكرولتر من منظمات المجتمع المدني، و 15 ميكرولتر من PCR المياه الصف إلى 25 ميكرولتر من المكتبة. تعيين ماصة ل100 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X.
- ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- وضع لوحة في thermocycler (غطاء تسخينه عند 100 ° C) وبرنامج تشغيل 2 (الجدول 1).
5. gDNA التخصيب: يوم 2 بعد الظهر
- قبل البدء
- ذوبان الجليد ET1، ET2، SMB، WS1، WS2، WS3 والحلول HP3 في RT لغسل التهجين. من عدة تخصيب الحمض النووي، وذوبان الجليد PCR مزيج الرئيسي يحتوي البلمرة (TC-PMM)، PCR التمهيدي كوكتيل (PPC)، وحلول RSB على الجليد لPCR التضخيم.
- 2 الثانية التهجين غسل
- اتبع بالضبط نفس البروتوكول بالنسبة لل4،2-1 الحادي غسل التهجين.
- PCR التضخيم
- في لوحة 96 بئر جديد، مزيج 20 ميكرولتر من شطف من الخطوة 5.2، 25 ميكرولتر من TC-PMM، و 5 ميكرولتر من PPC. تعيين ماصة 50 ميكرولتر وماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية.
- وضع لوحة في thermocycler (غطاء تسخينه عند 100 ° C) وبرنامج تشغيل 3 (الجدول 1).
6. gDNA التخصيب: 3 يوم
- قبل البدء
- ذوبان الجليد RSB الحل على الجليد. على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام، وجلب تنقية حبات مغناطيسية لRT.
- PCR تنقية
- أجهزة الطرد المركزي لوحة من الخطوة 5.3 لمدة 1 دقيقة في 280 XG في 20 ° C، وإزالة الغطاء لاصقة.
- في RT، إضافة 90 ميكرولتر من صمختلطة reviously تنقية حبات مغناطيسية في كل بئر. تعيين ماصة ل140 ميكرولتر، ماصة بلطف وحدة التخزين بالكامل صعودا وهبوطا 10X. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT. وضع لوحة 96 جيدا على حامل المغناطيسي لمدة 5 دقائق على RT. تأكد من أن طاف يبدو واضحا تماما.
- يعد حل الطازجة الإيثانول 80٪ (لمدة 2 العينات، إضافة 200 ميكرولتر من الماء المقطر إلى 800 الايثانول ميكرولتر). تجاهل طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
- مع الحفاظ على لوحة على الوقوف المغناطيسي، وإضافة 200 ميكرولتر من الطازجة 80٪ من الإيثانول إلى كل بئر من دون إزعاج الخرز واحتضان لوحة لمدة 30 ثانية في RT. تجاهل طاف وتكرار هذا يغسل مرة أخرى. ضمان الإيثانول قد أزيلت. اسمحوا الجافة في RT لمدة 15 دقيقة أو حتى التبخر الكامل للإيثانول في حين أن لوحة هي على الوقوف المغناطيسي.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي وإضافة 30 ميكرولتر من RSB العازلة. تعيين ماصة ل30 ميكرولتر، وبلطف ماصة رانه يصل حجم كامل ونزولا 10X. احتضان لوحة لمدة 2 دقيقة في RT.
- وضع لوحة 96 جيدا على الوقوف المغناطيسي واحتضان لمدة 5 دقائق أو حتى يظهر طاف واضحة تماما. نقل بلطف 28 ميكرولتر من طاف في الجديد 96 لوحة جيدا (نوع لوحة: TCY).
ملاحظة: قد يتم إيقاف الإجراء في هذه المرحلة وردود الفعل تخزينها في -15 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
- مكتبة التحقق من صحة والكمي
- تحديد نوعية المكتبة باستخدام محلل شظية. عالية الدقة الكهربائي للهلام الأكريلاميد يمكن أن تستخدم لتحل محل الخطوات المذكورة أعلاه ولكن لا ينصح. يجب أن تكون شظايا بين 150 و 1،000 بي بي BP.
ملاحظة: الموصى به: قياس من قبل مكتبة QPCR للحصول على أفضل عدد من مجموعات خلال التسلسل. - كمرجع، استخدم مكتبة التحقق من صحة (2 نانومتر). إذا كان يتم إعداد المكتبة الأولى، استخدم فج PhiX DNA (10 نانومتر) المنصوص عليها معايرة sequencجهاز جي.
- إعداد التخفيفات المسلسل من مراقبة إيجابية للحصول على 7 نقاط في 20، 16، 8، 6، 4، 2، و 1 مساء في إبت (EB شطف عازلة + 0.1٪ توين 20). تمييع مكتبة الفائدة عند 1/1000 و 1/2000. يجب تحليل كل نقطة في ثلاث نسخ.
- إعداد مزيج التالية (مجلدات ضرب من قبل عدد من الآبار المستخدمة): ل1 جيدا، وإضافة 10 ميكرولتر من SYBR الأخضر QPCR تحتوي على مزيج الرئيسي (2X)، 0.2 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر، AATGATACGGCGACCACCGAGAT)، 0.2 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر، CAAGCAGAAGACGGCATACGA)، و 7.6 ميكرولتر PCR المياه الصف.
- بعد الاختلاط، وخلع في 96 لوحة جيدا، 18 ميكرولتر من المزيج في كل ميكرولتر جيدا و 2 من السيطرة ومكتبة التخفيفات إيجابية. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 280 XG عند 20 درجة مئوية. ثم، وضع لوحة في thermocycler PCR الكمي وتشغيل البرنامج 4 (الجدول 1).
- تحليل النتائج على النحو الكمي المطلق التقليدية للحصول على العائد من كل لترibrary. ميزة QPCR هو أنه الكمي الحمض النووي التي من شأنها أن تتفاعل مع الخلية التدفق فقط.
ملاحظة: لا تستخدم الكمي fluorimetric من الحمض النووي بسبب وجود جزيئات DNA المحاكاة في واحدة من الكواشف. فإن هذا الأسلوب الكمي المبالغة في تقدير العائد المكتبة وبالتالي نقلل من نقاط التجميع.
- تحديد نوعية المكتبة باستخدام محلل شظية. عالية الدقة الكهربائي للهلام الأكريلاميد يمكن أن تستخدم لتحل محل الخطوات المذكورة أعلاه ولكن لا ينصح. يجب أن تكون شظايا بين 150 و 1،000 بي بي BP.
- تسلسل إطلاق
- تمييع كل مكتبة في 4 نانومتر في الحجم النهائي من 30 ميكرولتر من شطف العازلة (EB)، وتجميع جميع المكتبات وتخلط جيدا.
- إعداد الطازجة 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم الحل في EB العازلة وخلط 10 ميكرولتر من هذا الحل هيدروكسيد الصوديوم مع 10 ميكرولتر من المكتبات المجمعة. تخلط جيدا واحتضان بالضبط 5 دقائق على RT.
- بعد 5 دقائق، إضافة على الفور 980 ميكرولتر من التهجين عازلة (من خرطوشة التسلسل) وتخلط جيدا. ثم، مزيج 400 ميكرولتر من هذا الخليط مع 600 ميكرولتر من العازلة التهجين. تخلط جيدا ونقل 600 ميكرولتر إلى 300 خرطوشة دورة (2 × 150) لحقنة من 8مساء. إطلاق التسلسل.
تحليل البيانات 7.
- بمجرد معالجة الجهاز البيانات، ونقل الملفات و.bam .vcf إلى كمبيوتر جديد.
ملاحظة: يتضمن تجزئة Transposase آثار أقدام. وبالتالي، فإن البرنامج تلقائيا الديكورات هذه البيانات. - جمع الاختلافات الجينية التي تم الحصول عليها مع تحليل الجهاز.
- تحليل ملفات المصدرة (.bam، .vcf) مع برامج أخرى (ألموت) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ثم، مقارنة الاختلافات الجينية التي تم الحصول عليها مع كل من التحليلات. فقط اكتشفت الاختلافات مرتين تعتبر الحاضر.
الجدول 1. الظروف PCR
| برنامج | درجات الحرارة | الوقت | الأسطوانات. يكرر | |||
| 1 | 72 ° C | 3 دقيقة | 1 | 98 ° C | 30 ثانية | 1 |
| 98 ° C | 10 ثانية | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 ثانية | |||||
| 72 ° C | 30 ثانية | |||||
| 72 ° C | 5 دقائق | 1 | ||||
| 10 ° C | غير محدود | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 دقيقة | 1 | |||
| 93 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 81 ° C 1 دقيقة | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 دقيقة | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 دقيقة | 16-18 ساعة | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 ثانية | 1 | |||
| 98 ° C | 10 ثانية | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 ثانية | |||||
| 72 ° C | 30 ثانية | |||||
| 72 ° C | 5 دقائق | 1 | ||||
| 10 ° C | غير محدود | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 دقيقة | 1 | |||
| 95 ° C | 15 ثانية | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 دقيقة | |||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج عينة QC
ويستند قدرة هذا الأسلوب لتحديد تسلسل الجينات المستهدفة على نوعية gDNA (الشكل 2A) ونوعية الخطوة tagmentation. إذا كان tagmentation ليست كافية (الشكل 2B، اللوحة العليا)، فإن التسلسل لا يكون مرضيا. كما ذكر أعلاه، بعد تنقية tagmentation، وgDNA يجب tagmented إلى أجزاء من 150 إلى 1،000 بي بي BP مع غالبية شظايا حوالي 300 سنة مضت (الشكل 2B، اللوحة السفلى).
في نهاية إعداد المكتبة، يتم فحص جودة المكتبات باستخدام Bioanalyser. البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها يجب أن تكون تقريبا نفس بعد tagmentation لكن مع أرقام أعلى من شظايا (الشكل 2C). إذا كانت جودة المكتبة ليست متطابقة إلى الشكل 1C، لا ينبغي أن يؤديها التسلسل.
مرة واحدة يتم تشغيل التسلسل علىالجهاز التسلسل، والنتيجة هي تجميع المتاحة بعد 9 دورات وينبغي أن تكون بين 800،000 و 1،100،000 مجموعات / مم ² (الشكل 3A). إذا كان هذا الرقم هو أقل من ذلك، فإن التسلسل لا يكون مرضيا، وخاصة في عمق القراءة. إذا كان أعلى، سيتم طمست الصور (الشكل 3B)، وسيتم إجراء أي تحليل بسبب استحالة التفريق مجموعات.
في نهاية المدى، فمن المهم للتحقق من نقاط الجودة. باتباع بروتوكول المفصلة أعلاه، والنتيجة نوعية على المدى تتوافق مع الشكل 4 وتمثل نوعية التسلسل التي كتبها a-النتيجة Q (Q-30). للتحقق من صحة التجربة، على الأقل حوالي 75٪ من متواليات (مجموعات) ينبغي أن يكون لها درجة-Q تفوق أو تساوي 30.
التسلسل نتائج
وقد صممت هذه التجربة لدراسة التشوهات الجينية الدستورية. في هذه الحالة، الشذوذ الجيني هو العلاقات العامةESENT بنسبة 50٪ في الجينوم. بسبب هذا، وعمق التسلسل ليس مهما جدا. هنا، نحن على استعداد والتسلسل في وقت واحد 2 مكتبات من 12 مريضا لمدة 11 جينات كاملة. للحصول على عمق التسلسل عالية، وعدد من المرضى المضاعفة لابد انخفضت. كما يستند تخصيب gDNA على أسر تحقيقات، إثراء ليست متجانسة (الشكل 5). مع بروتوكول لدينا، ولدت حوالي 6 جيجابايت من يقرأ، الأمر الذي أدى إلى تغطية متوسط 150 يقرأ لكل قاعدة، مع حد أدنى من 20 وبحد أقصى يقرأ 330. هذه الأعماق قراءة تتفق مع استخدام NGS في الممارسة السريرية 11. على الرغم من عدم التجانس من أعماق قراءة، ربما يرجع إلى تخصيب gDNA بالصيد، وليس إعادة ترتيب كبير من الجينات، فمن المهم أن نلاحظ أن النتيجة كانت دائما متفوقة س إلى 30 (الشكل 5)، وبالتالي التحقق من صحة التسلسل.
ومع ذلك، فمن المهم للتحقق من صحة التكنولوجيا بمقارنة نتيجةق الحصول عليها مع تلك التي حصلت مع سانجر التسلسل. في 17 مريضا التسلسل كل من التسلسل سانجر (الترميز متواليات من BRCA1 و BRCA2) والقائمة على التكنولوجيا transposase، اكتشفنا نفس الاختلافات الجينية 330 (SNP والطفرات). كمثال على ذلك، تم الكشف عن طفرة نقطة في جين BRCA1 (الشكل 6 يسار) وحذف 4 قواعد في الجين BRCA2 (الشكل 6 اليمين) من قبل كل من سانجر والأساليب القائمة على transposase. كما BRCA1 هو على عكس حبلا من كروموسوم 13، من المهم أن نلاحظ أنه من الضروري لتكملة (ولكن ليس عكس) تسلسل الحصول عليها، في حين لBRCA2 (على حبلا إلى الأمام)، لا يحتاج تسلسل الحصول عليها أن تكمل . كما هو مبين في الشكل (5)، والتكنولوجيا NGS يعطي تردد المقدرة للتنوع الجيني، في حين لا طريقة سانجر لا. وعلاوة على ذلك، خاصة بالنسبة للاختلافات indel، تفسير أسهل مع NG S التكنولوجيا. كما هو مبين في الشكل (6) الحق، ويبدو أن تسلسل الاختلاف indel باعتباره رحلاني سارعت الذي يحتاج إلى الأمام وعكس التسلسل فك تسلسل إدراجها أو حذفها. مع تحليل NGS، يتم تحديد تسلسل إدراجها أو حذفها مباشرة، وبالتالي تقليل مخاطر سوء التفسير. أخيرا، القائمة على التكنولوجيا transposase سمح لنا بتحليل عدد أكبر من الجينات المستهدفة، ووجدنا العديد من متواليات جديدة الاختلاف الجيني التي لم تشملها سانجر التسلسل. وسيتم نشر هذه النتائج في مكان آخر.
الرقم 1. سير العمل التخطيطي الإجراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ether.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 2. ضوابط الجودة قبل وبعد إعداد مكتبة. الملف الشخصي A. طيفية من gDNA التي يمكن استخدامها بأمان لtagmentation. يجب أن يكون العائد DNA أعلى من 5 نانوغرام / ميكرولتر، يجب أن يكون 260/230 260/280 ونسب متفوقة على 1.8 و 2 على التوالي. B. جزء من ملامح محلل tagmented gDNA. اللوحة العليا يمثل tagmented كاف gDNA. وتظهر اللوحة السفلى عينة tagmented تماما. C. جزء من الشخصية محلل مستعدة مكتبة فقط قبل إطلاق التسلسل. حجم جزء هو نفس tagmented gDNA (B، اللوحة السفلى) ولكن مع كمية تضخيمها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
> 
الرقم 3. التحقق الجيل العنقودية. A. قطة للجهاز التسلسل أثناء التشغيل. يجب أن تكون كثافة الكتلة ما بين 800 و 1،000 K / مم ². B. صور مختلفة تتوافق مع منخفضة الكثافة (اللوحة العليا)، عالي الكثافة (اللوحة السفلى) وكثافة مثالية (لوحة المتوسطة). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
الرقم 4. التحقق من Q-درجة. في نهاية المدى، ينبغي أن يكون التحقق من صحة التسلسل 75٪ على الأقل من مجموعات ولدت مع Q-درجة متفوقة على 30.JPG "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تمثيل البيانات التغطية ويناظرها Q-النتيجة. عمق قراءة غير متجانسة على طول الجين تغطيتها. ومع ذلك، فإن Q-النتيجة من المناطق المشمولة متفوقة دائما إلى Q-30. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. ممثل النتائج التي تم الحصول عليها مع سانجر تسلسل ومع التكنولوجيا القائمة على transposase. ود جميع الاختلافات الوراثية لوحظ مع التسلسل سانجرetected مع التكنولوجيا القائمة على transposase. في حين أن الطفرات نقطة من السهل تفسيرها، indel التعديلات في بعض الأحيان صعبة جدا لدراسة مع أسلوب سانجر. مع التكنولوجيا القائمة على transposase المرتبطة مع جهاز الإنتاجية المتوسط، indel تغييرات بسيطة لاكتشاف. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن من الضروري أن تكمل (ولكن ليس عكس) تسلسل الحصول عليها عندما يقع هذا الجين الهدف على حبلا ناقص (هنا الجين BRCA1). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وفرت انتشار استخدام الأجهزة والتقنيات NGS فرص جديدة في دراسة السرطان والاضطرابات الوراثية. بالإضافة إلى تسلسل الجينوم كله أو RNA تسلسل وتحليل كمية كبيرة من متواليات gDNA مختارة في العديد من المرضى في وقت واحد يوفر فرص كبيرة في التشخيص. هنا، قمنا بتطوير تصميم معين (حسب الطلب) باستخدام تكنولوجيا Nextera لدراسة الجينات كاملة في 11 24 مريضا في وقت واحد مع جهاز التسلسل الإنتاجية المتوسطة (جدول المواد / المعدات). هذا البروتوكول يسمح جيل سريع للبيانات التي تمكن استجابة سريعة للمخاوف المرضى مع مخاطر منخفضة من الخطأ. كما هو موضح في الشكل (6)، تم الكشف عن التغيرات الجينية مع الكشف عن التسلسل سانجر أيضا باستخدام إعداد عدة القائم على transposase. هذا الأسلوب هو موثوقة وسهلة لتفسير، وخاصة لإجراء تعديلات indel المعقدة التي يتم تحليلها مباشرة. ومع ذلك، من المهمأن نلاحظ أن للجينات الموجودة في حبلا ناقص، فمن الضروري أن تكمل (دون عكس) النيوكليوتيدات. تم تنفيذ هذا العمل خارجا مع تصميم لتحليل الجينات 11 كاملة، ولكن البروتوكول هو نفسه مهما كان التصميم الذي تم اختياره. ويمكن أيضا أن تستخدم التكنولوجيا القائمة على Transposase لإعداد مكتبة من مسافة طويلة المنتجات PCR 12. في الواقع، الخوارزمية (وضعت من قبل الشركة المصنعة) تستخدم لتصميم (الصانع أداة على شبكة الإنترنت، انظر الجدول المواد / المعدات) مكرس خصيصا لهذا البروتوكول. بالإضافة إلى التكنولوجيا transposase القائم، وهما آليات أخرى للتجزئة الحمض النووي قبل إعداد المكتبة وتتوفر أيضا: التشرذم والتفتت الميكانيكي الأنزيمية. تجزئة الحمض النووي الميكانيكية هو استنساخه ولكن يحتاج ultrasonicator، وإعداد مكتبة هي أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا أكثر. تجزئة الأنزيمية DNA غالبا ما يدفع المشاكل لالتقاط DNA بسبب فروع انزيم التقييد، مما أدىفي غياب التغطية تسلسل الهدف. ومع ذلك، فإن كل استراتيجية لتفتيت الحمض النووي لها مزايا وعيوب ولكن يبدو أن تعطي نتائج مماثلة تماما، على الأقل في المدى الطويل تجزئة المنتجات PCR 13. بدا استخدام انزيم كوكتيل جديد لتوفير نفس النتائج مع تلك التي حصلنا عليها تجزئة الحمض النووي الميكانيكية 14. التكنولوجيا القائمة على Transposase تحتاج DNA عالية الجودة (لا ينطبق على الحمض النووي المستخرج من الأنسجة FFPE). وعلاوة على ذلك، فإن نشاط transposase يحتاج شظايا من أكثر من 300 نقطة أساس، مما يوحي بأن شظايا من الفائدة يجب أن تكون أطول من هذا الطول. يفسر هذا التحديد الحاجة إلى ذات جودة عالية، DNA الأمم المتحدة مجزأة.
حتى الآن، وقد تم دراسة الاختلافات الجينية BRCA1 و BRCA2 من في الثدي العائلي وسرطان المبيض. ومع ذلك، فإن تورط جينات BRCA، وخصوصا BRCA2، ويشتبه الآن في أنواع أخرى من السرطان، وخاصة في البنكرياس 15، البروستاتا16، وسرطانات الخصية 17. يرتبط التغيير الجيني للPALB2، وهو شريك للجينات BRCA، وأيضا مع سرطان البنكرياس 18. وعلاوة على ذلك، يبدو مؤخرا أن المرضى إيواء الطفرات BRCA، وإلى حد أقل الطفرات PALB2 أظهر استجابة أفضل من السرطان البنكرياس لمثبطات PARP 19. كما ترتبط BRCA1، BRCA2، وPALB2 مع خطر عائلي من السرطان، وربما يرتبط مع التعرض لعلاجات محددة، يبدو مهما لاستكشاف BRCA1 و BRCA2 شركاء في الكشف عن مخاطر الإصابة بالسرطان العائلي والفحص للاستجابة لعلاج السرطان.
من هذه المعطيات، يبدو أن تحليل الجينات ذات الصلة إصلاح كسر DNA إلى أن تكون مهمة ليس فقط لفحص قابلية ولكن أيضا لمؤشر المفترضة من الاستجابة للعلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن للتحليل الجيني الكامل المقترحة مع هذا البروتوكول COVإيه كل التعديلات التي يمكن أن تكون موجودة منذ الولادة (وموجودة في الخلايا السرطانية)، مثل الطفرات في المروج، ومواقع الربط أو مواقع الربط التنظيمية تقع في الإنترونات. حتى الآن، لم تدرس تغييرات في تسلسل الجينات غير الترميز في العمق، ولكن تطوير الدراسات رابطة الجينوم على نطاق يمكن أن تسلط الضوء ظائف مهمة من هذه المتتاليات.
في الختام، تصميم القائم على transposase المتقدمة في هذه الورقة هو وسيلة مثيرة للاهتمام لاستكشاف تشوهات وراثية في الجينات الوقاية من الاصابة بالسرطان المشاركة في إصلاح الحمض النووي من التلف. إمكانية تسلسل 11 جينات كاملة ل24 مريضا في وقت واحد هو ميزة هامة مقارنة مع أسلوب التسلسل سانجر، وهي تقنية صعبة جدا لفرزها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W.
