Abstract
L'utilisation généralisée de séquençage de nouvelle génération a ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer et le diagnostic. NGS apportera d'énormes quantités de données sur le cancer, et en particulier la génétique du cancer. Les connaissances actuelles et des découvertes futures, il sera nécessaire d'étudier un grand nombre de gènes qui pourraient être impliqués dans une prédisposition génétique au cancer. À cet égard, nous avons développé une conception Nextera d'étudier 11 gènes complets impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN. Ce protocole a été développé pour étudier en toute sécurité 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, et TP53) de promoteur de 3'-UTR chez 24 patients simultanément. Ce protocole, basé sur la technologie de transposase et enrichissement ADNg, donne un grand avantage en termes de temps pour le diagnostic génétique grâce à multiplexage déguster. Ce protocole peut être utilisé en toute sécurité avec ADNg de sang.
Introduction
En 2010, près de 1,5 millions de personnes (essentiellement des femmes) ont développé un cancer du sein dans le monde entier. On estime que 5 à 10% de ces cas étaient héréditaires. Il ya près de 20 ans, BRCA1 et BRCA2 ont été identifiées comme impliquées dans héréditaire du sein et des ovaires 1. Depuis environ 15 ans, les régions codantes des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été séquencés afin de déterminer la prédisposition génétique au cancer du sein et le cancer de l'ovaire. Des altérations dans les gènes BRCA1 et BRCA2 sont détectés chez 10 à 20% de deux familles sélectionnées suggérant que l'analyse de ces régions ne sont pas suffisantes pour le criblage efficace. Récemment, l'analyse des séquences non codantes (promoteurs, introns, 3-'UTR) de BRCA1 et BRCA2 mis en évidence que de nouvelles mutations / variations pourraient être liés à un risque accru de cancer du sein 6.3.
protéines BRCA1 et BRCA2 sont impliqués dans la recombinaison homologue réparation (RHS), qui est complété par de nombreux partenaires 7. Bien que des altérations de BRCA1 ou BRCA2 induisent des défauts de réparation de l'ADN, les autres partenaires peuvent également influer sur le risque de cancer du sein. Cette hypothèse semble avoir été validé depuis BRIP1 8 et 9 PALB2 avoir un impact avéré sur le cancer du col utérin et du sein, respectivement. En outre, deux autres gènes de prédisposition au cancer du sein "à risque modéré», ATM et CHEK2, peuvent également être étudiées systématiquement 10.
Suite à ces études, nous avons décidé de développer un protocole pour analyser 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, et TP53) chez 24 patients en utilisant un très facile et relativement simultanément protocole rapide basé sur la technologie de la transposase, l'enrichissement et le séquençage sur un dispositif de débit moyen. Mercicette technique, nous avons séquence des gènes complets à partir du début du promoteur à l'extrémité 3'-UTR de, à l'exception de RAP80, pour lequel une région intronique de 2500 pb n'est pas couverte (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Cela représente un total d'environ 1.000.300 pb étudié avec 2734 sondes. Habituellement, BRCA1 et BRCA2 séquences exoniques sont analysés par séquençage de Sanger, qui a besoin de 1,5 mois de moins de 20 patients. Avec le présent protocole (figure 1), dans le même temps, les 11 gènes complets pour plus de 75 patients ont pu être analysés.
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Protocol
1 Évaluation des ADNg (ADN génomique) Rendement
- Quantifier fraîchement extrait ADNg avant la préparation de la bibliothèque. Utilisez la méthode d'évaluation du rendement fluorimétrique de quantifier ADNg intact (éviter d'utiliser un spectrophotomètre pour ADNg évaluation de rendement). Mesurer la (260/280 nm) rapport et s'assurer qu'il est compris entre 1,8 et 2 NOTE: 50 ng de ADNg sont nécessaires pour l'expérience.
2. ADNg Enrichissement: Jour 1, Matin
- Avant de partir
- De la trousse d'enrichissement de l'ADN (voir le tableau des Matériaux / Équipement), dégel tampon d'ADN (TD) et les solutions d'ADN enzyme (TDE1) sur la glace. Au moins 30 minutes avant utilisation, amener des billes magnétiques d'épuration et d'arrêt cible (ST) en mémoire tampon à la température ambiante (RT). Ajouter 20 ul d'échantillon d'ADNg à 2-2,5 ng / ul directement dans une plaque de 96 puits, 1 puits par échantillon. IMPORTANT: utiliser un témoin positif pour valider le protocole (échantillon avec une variation de séquence connue).
- Tagmentation
- Mix tous les réactifs en renversant 5x, et centrifuger brièvement. À température ambiante, ajouter 25 ul de tampon TD pour chaque puits contenant 50 ng (20 pi) de ADNg, puis 5 ul de tampon TDE1. Réglez pipette à 50 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
- Couvrir la plaque avec une feuille adhésive et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Ensuite, placez la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et exécutez le programme suivant: 55 ° C pendant 5 min et 10 ° C pour une durée illimitée.
- Pendant cette incubation, préparer la feuille d'échantillon avec logiciel de gestion de l'expérience pour définir les indices qui seront utilisés.
- Tagmentation Purification
REMARQUE: Cette étape est essentielle. Soyez très prudent.- Vérifier l'absence de précipité dans des billes magnétiques de purification et tampon ST. Si précipités sont présents, réchauffer des solutions dans les mains. Tampon de remise en suspension Thaw (RSB) sur la glace.
- À température ambiante, vortex solution ST et ajouter15 pi de chaque échantillon contenant. Réglez pipette à 65 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Couvrir la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Ajouter 52 ul de billes magnétiques de purification préalablement mélangés dans chaque puits. Réglez pipette à 117 pi, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Couvrir la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Retirez le film adhésif. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 2 minutes à température ambiante. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair.
- Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour 24 échantillons, ajouter 2 ml d'eau distillée et 8 ml d'éthanol). Retirer et jeter le surnageant en prenant soin de ne pas déranger les perles.
- Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant au moins 30 secà la température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une deuxième fois. Assurer la éthanol a été supprimé. Laisser sécher à température ambiante pendant 10 minutes ou jusqu'à évaporation complète de l'éthanol.
- Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 22,5 ul de tampon de RSB. Régler la pipette à 22,5 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Transférer doucement 20 pi du surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
NOTE: En option, déterminer la taille des échantillons tagmented en utilisant un analyseur de fragment. Au lieu des étapes mentionnées ci-dessus, en utilisant une électrophorèse sur gel d'acrylamide de haute résolution. Fragments doit être comprise entre 150 pb et 1000 pb.
- 1 Amplification PCR er
- Thaw PCR mélange maître à la polymérase (LP-PMM), l'indice 1 amorce, et l'indice 2 solutions d'amorces sur la glace. Correspondre à la combinaison oindices f avec la feuille d'échantillon de Experiment Manager. Par multiplexage, préparer i7 indice différent de 1 (i7, N7xx) pour chaque échantillon.
- Dans chaque puits, ajouter 20 pi de LP-PMM, 5 pi de l'indice 1, et 5 pi d'indice 2 Régler la pipette de 50 pi, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Couvrir la plaque avec un film adhésif microseal. Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 1 (tableau 1).
REMARQUE: la procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions pour la nuit dans le thermocycleur ou pour 2 jours entre 2 et 8 ° C.
3. ADNg Enrichissement: Jour 1, après-midi
- Avant de partir
- Oligos dégel (OSC), capture cible tampon 1 (NCT1), et des solutions RSB sur la glace. Au moins 30 minutes avant l'utilisation, la purification amener des billes magnétiques à la température ambiante.
- La purification PCR
- Centrifuger la plaque de l'étape 2.4, pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- À température ambiante, ajouter 45 ul de billes magnétiques de purification mixte dans chaque puits. Régler la pipette à 95 ul, délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 2 minutes à température ambiante.
- Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour 24 échantillons, ajouter 2 ml d'eau distillée et 8 ml d'éthanol). Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.
- Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une deuxième fois. Assurer la éthanol a été supprimé. Laissez sécher à température ambiante pendant 15 min.
- Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 40 ul de tampon de RSB. Réglez le tuyautte à 40 pi, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
- Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 2 min. Le surnageant doit apparaître tout à fait clair. Transférer doucement 38 pi du surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
- Déterminer le rendement de chaque échantillon par une méthode fluorimétrique. Cette première partie du protocole sera validé si les rendements sont évalués entre 30 et 50 ng / ul.
- 1 er hybridation
- En commun jusqu'à 12 échantillons par pool à ce stade en mélangeant 500 ng de chaque échantillon dans une nouvelle plaque de 96 puits. Assurez-vous que le volume final de chaque groupe ne dépasse pas 40 pi.
REMARQUE: Si nécessaire, réduire le volume de piscines en utilisant un dispositif de concentrateur sous vide à température ambiante (Attention: la concentration de l'ADN ne peut être modifiée par chauffage, même à 30 ° C le chauffage provoque une dégradation de l'ADN). Ajuster le volume final à 40 pi par addition de solution RSB. - Bien mélanger leSolution NCT1. Pour chaque puits contenant 40 ul d'échantillons d'ADN communs, ajouter 50 pi de NCT1, et 10 pi de CSO. Régler la pipette 100 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 2 (tableau 1).
- En commun jusqu'à 12 échantillons par pool à ce stade en mélangeant 500 ng de chaque échantillon dans une nouvelle plaque de 96 puits. Assurez-vous que le volume final de chaque groupe ne dépasse pas 40 pi.
4. ADNg Enrichissement: Jour 2, Matin
- Avant de partir
- De la trousse d'enrichissement de l'ADN (voir le tableau des Matériaux / Équipement) dégel NaOH 2 N (HP3), cible tampon d'élution 1 (ET1), cible tampon d'élution 1 ET2, des billes magnétiques de streptavidine (SMB), solution de lavage 1 (WS1), lavage solution 2 (WS2), solution de lavage 3 (Volet 3), solutions OSC, et NCT1 à la température ambiante.
- 1 er hybridation Wash
- Retirer la plaque de 96 puits du thermocycleur et centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C. Retirez le couvercle adhésif très savoully.
- Transférer le mélange réactionnel de 100 pi de la plaque à une nouvelle MIDI plaque de 96 puits et ajouter 250 microlitres de solution de SMB bien vortex. Régler la pipette 350 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C, retirer le joint de colle et placez la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
- Ajouter 200 ul de solution de WS1 bien mélangé dans les puits contenant des perles. Régler la pipette 200 ul de la pipette et doucement l'ensemble du volume de haut en bas 15x évitant la formation de bulles / mousse.
- Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
- Ajouter 200 ul de solution de WS2 bien mélangé dans des puits contaperles de INING. Régler la pipette 200 ul et délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 15x en évitant la formation de bulles / mousse.
- Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
- Ajouter 200 ul de solution de WS2 bien mélangé dans des puits contenant des billes. Régler la pipette 200 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x.
- Transférer tout le volume dans une nouvelle plaque à 96 puits. Sceller la plaque et placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C). Lancez le thermocycleur à 42 ° C pendant 30 min.
- Imediately placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirer le joint et le jeter immédiatement tout le surnageant. Ensuite, retirez la plaque du support magnétique.
- Ajouter 200 ul de WS2 dans des puits contenant des billes. Régler la pipette à 200ul et doucement pipeter la totalité du volume de haut en bas 15x en évitant la formation de bulles / mousse. Sceller la plaque et placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C). Lancez le thermocycleur à 42 ° C pendant 30 min.
- Immédiatement placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirer le joint et le jeter immédiatement tout le surnageant. Ensuite, retirez la plaque du support magnétique.
- Ajouter 200 ul de solution de WS3 bien mélangé dans des puits contenant des billes. Régler la pipette 200 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x.
- Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Jeter tout le surnageant et retirer la plaque du support magnétique.
- Répéter le WS3 laver une seconde fois.
- Après avoir enlevé le surnageant, sceller la plaque et centrifuger à tirer vers le bas le surnageant résiduel. Placer la plaque surle support magnétique pendant 2 minutes. Jeter le surnageant résiduel.
- Dans un tube de 0,2 ml, mélanger 28,5 pi de ET1 et 1,5 pl de solutions de HP3. Ce mélange est pour une piscine, si plusieurs pools sont préparés, multiplier ces volumes par le nombre de piscines préparés.
- Retirer la plaque du support magnétique. Ajouter 23 ul du mélange préparé ci-dessus. Régler la pipette de 23 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 15x. Sceller la plaque et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante. Centrifuger 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 minutes. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair. Retirez le film adhésif et transférer 21 pi de surnageant dans un nouveau plaque de 96 puits.
- Ajouter 4 ul de la solution dans chaque puits ET2. Régler la pipette de 25 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x et sceller la plaque.
REMARQUE: la procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions stocké pendant jusqu'à 7 jours à -15 ° C. Si la plaque est gelé, dégeler complètement avant de commencer la 2 e hybridation.
- 2 e hybridation
- Centrifuger la plaque pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Retirez le film adhésif et ajouter 50 ul de NCT1, 10 pi de CSO, et 15 pi de l'eau de qualité PCR à 25 pi de bibliothèque. Régler la pipette 100 ul et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
- Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 2 (tableau 1).
5. ADNg Enrichissement: Jour 2, après-midi
- Avant de partir
- Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 et solutions HP3 à la température ambiante pour lavage d'hybridation. De la trousse d'enrichissement de l'ADN, décongeler PCR Master Mix contenant polymérase (TC-PMM), amorce de PCR cocktail (PPC), et des solutions RSB sur la glace pour l'amplification PCR.
- 2 e hybridation Wash
- Suivez exactement le même protocole que pour 4,2 - 1 er hybridation lavage.
- Amplification par PCR
- Dans une nouvelle plaque de 96 puits, mélanger 20 pi de l'élution de l'étape 5.2, 25 pi de TC-PMM, et 5 pi de PPC. Régler la pipette de 50 pi et une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C.
- Placer la plaque dans un thermocycleur (couvercle chauffé à 100 ° C) et un programme d'essai 3 (tableau 1).
6. ADNg Enrichissement: Jour 3
- Avant de partir
- Thaw RSB solution sur de la glace. Au moins 30 minutes avant l'utilisation, la purification amener des billes magnétiques à la température ambiante.
- La purification PCR
- Centrifuger la plaque de l'étape 5.3 pour 1 min à 280 g à 20 ° C, et retirez le couvercle adhésif.
- A température ambiante, ajouter 90 ul de précédemment mélangé billes magnétiques de purification dans chaque puits. Régler la pipette 140 ul, une pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Mettre la plaque à 96 puits sur un support magnétique pendant 5 min à température ambiante. Assurez-vous que le surnageant apparaît tout à fait clair.
- Préparer une solution fraîche de l'éthanol à 80% (pour les deux échantillons, ajouter 200 ul d'eau distillée et 800 ul d'éthanol). Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.
- Tout en maintenant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol dans chaque puits sans perturber les perles et incuber la plaque pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnageant et répéter ce lavage une fois de plus. Assurer la éthanol a été supprimé. Laissez sécher à température ambiante pendant 15 min ou jusqu'à évaporation complète de l'éthanol tandis que la plaque se trouve sur le support magnétique.
- Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 30 ul de tampon de RSB. Régler la pipette de 30 pi, et doucement la pipette til totalité du volume de haut en bas 10x. Incuber la plaque pendant 2 minutes à température ambiante.
- Placer la plaque de 96 puits sur le support magnétique et incuber pendant 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant apparaît tout à fait clair. Transférer doucement 28 pi du surnageant dans une nouvelle plaque de 96 puits (type de plaque: CTE).
REMARQUE: La procédure peut être arrêtée à ce stade et les réactions stocké à -15 ° C pendant jusqu'à 7 jours.
- Bibliothèque de validation et quantification
- Déterminer la qualité de la bibliothèque en utilisant un analyseur de fragment. Une électrophorèse sur gel d'acrylamide de haute résolution peut être utilisé pour remplacer les étapes mentionnées ci-dessus mais n'est pas recommandée. Fragments doit être comprise entre 150 pb et 1000 pb.
REMARQUE: Recommandé: Quantifier la bibliothèque par qPCR pour obtenir le meilleur nombre de clusters au cours du séquençage. - À titre de référence, utiliser une bibliothèque validé (2 nM). Si la première bibliothèque est en cours de préparation, utilisez le phage PhiX ADN (10 nM) prévue pour l'étalonnage de la sequencdispositif ing.
- Préparer des dilutions en série du contrôle positif à obtenir 7 points à 20, 16, 8, 6, 4, 2, et 13 heures dans EBT (EB élution tampon + 0,1% de Tween 20). Diluer la bibliothèque d'intérêt à 1/1000 et 1/2000. Chaque point doit être analysé en triple exemplaire.
- Préparer le mélange suivant (volumes multipliez par le nombre de puits utilisé): 1 bien, ajouter 10 ul de SYBR Green contenant qPCR Master Mix (2x), 0,2 pi de l'amorce sens (10 uM, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 pi de amorce inverse (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), et 7,6 pi d'eau PCR grade.
- Après le mélange, déposer dans une plaque de 96 puits, 18 ul de mélange dans chaque puits et 2 pi de dilutions de contrôle et de bibliothèque positifs. Sceller la plaque et centrifuger pendant 1 min à 280 g à 20 ° C. Ensuite, placez la plaque dans une PCR quantitative programme du thermocycleur et l'essai 4 (Tableau 1).
- Analyser les résultats de la quantification absolue classique pour obtenir le rendement de chaque library. L'avantage de qPCR est qu'il ne permet de quantifier l'ADN qui va interagir avec la cellule d'écoulement.
NOTE: Ne pas utiliser la quantification fluorimétrique de l'ADN en raison de la présence de molécules mimétiques ADN dans l'un des réactifs. Cette méthode de quantification pour effet de surestimer le rendement bibliothèque et par conséquent sous-estimer le score de clustering.
- Déterminer la qualité de la bibliothèque en utilisant un analyseur de fragment. Une électrophorèse sur gel d'acrylamide de haute résolution peut être utilisé pour remplacer les étapes mentionnées ci-dessus mais n'est pas recommandée. Fragments doit être comprise entre 150 pb et 1000 pb.
- Séquençage Lancement
- Diluer chaque bibliothèque à 4 nM dans un volume final de 30 pi de tampon d'élution (EB), et mettre en commun toutes les bibliothèques et bien mélanger.
- Préparer une solution fraîche de 0,2 N NaOH dans du tampon EB et mélanger 10 ul de cette solution de NaOH à 10 ul de bibliothèques regroupées. Bien mélanger et incuber exactement 5 min à température ambiante.
- Après 5 min, ajouter immédiatement 980 pi de tampon d'hybridation (de la cartouche de séquençage) et bien mélanger. Ensuite, mélanger 400 pi de ce mélange avec 600 pi de tampon d'hybridation. Bien mélanger et transférer 600 pl dans une cartouche de 300 cycles (2 x 150) pour une injection de 8pM. séquençage de lancement.
Analyse 7. données
- Une fois que l'appareil a traité les données, transférer le .bam et fichiers vcf vers un nouvel ordinateur.
REMARQUE: la fragmentation de Transposase intègre empreintes. Par conséquent, le logiciel de versions automatiquement ces données. - Recueillir des variations génétiques obtenues avec l'analyse de l'appareil.
- Analyser les fichiers exportés (.bam, vcf) avec un autre logiciel (Alamut) en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, comparez les variations génétiques obtenues avec les deux analyses. Seulement variations détectées deux fois sont présents.
Tableau 1: conditions de PCR
| Programme | Température | Temps | Num. des répétitions | |||
| 1 | 72 ° C | 3 min | 1 | 98 ° C | 30 sec | 1 |
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | illimité | |||||
| 2 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 93 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 91 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 89 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 87 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 85 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 83 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 81 ° C 1 min | 1 | |||||
| 79 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 77 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 75 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 71 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 69 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 67 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 65 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 63 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 61 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 59 ° C | 1 min | 1 | ||||
| 58 ° C | 1 min | 16-18 h | ||||
| 3 | 98 ° C | 30 sec | 1 | |||
| 98 ° C | 10 sec | 10 | ||||
| 60 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 30 sec | |||||
| 72 ° C | 5 min | 1 | ||||
| 10 ° C | illimité | |||||
| 4 | 95 ° C | 10 min | 1 | |||
| 95 ° C | 15 sec | 40 | ||||
| 60 ° C | 1 min | |||||
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Representative Results
Exemple QC Résultats
La capacité de cette méthode pour déterminer des séquences de gènes cibles est basée sur la qualité de l'ADNg (figure 2A) et la qualité de l'étape de tagmentation. Si le tagmentation n'est pas suffisante (Figure 2B, panneau supérieur), le séquençage ne sera pas satisfaisante. Comme mentionné ci-dessus, après la purification de tagmentation, l'ADNg doit être tagmented en fragments de 150 pb à 1000 pb avec la majorité des fragments d'environ 300 pb (figure 2B, panneau inférieur).
A la fin de la préparation de bibliothèque, bibliothèque qualité est vérifiée à l'aide d'un Bioanalyser. Le profil obtenu doit être approximativement la même que celle après tagmentation mais avec un plus haut nombre de fragments (figure 2C). Si la qualité de la bibliothèque ne sont pas identiques à la figure 1C, le séquençage ne doit pas être effectuée.
Une fois la séquence est lancée surle dispositif de séquençage, le score de clustering est disponible après 9 cycles et devrait se situer entre 800 000 et 1,1 millions grappes / mm ² (figure 3A). Si ce nombre est inférieur, le séquençage ne sera pas satisfaisante, en particulier dans la profondeur de lecture. Si elle est supérieure, les images seront floues (figure 3B), et aucune analyse seront effectuées en raison de l'impossibilité de différencier les clusters.
A la fin de la course, il est important de vérifier le niveau de qualité. En suivant le protocole détaillé ci-dessus, le niveau de qualité de la course correspond à la figure 4. La qualité de séquençage est représenté par un Q-score (Q-30). Pour valider l'expérience, au moins environ 75% de séquences (clusters) devrait avoir un Q-score supérieur ou égal à 30.
Les résultats de séquençage
Cette expérience a été conçue pour étudier les anomalies génétiques constitutionnelles. Dans ce cas, l'anomalie génétique est prESENT à 50% dans le génome. De ce fait, la profondeur de séquencement n'est pas très important. Ici, nous avons préparé et séquencé simultanément deux bibliothèques de 12 patients pour 11 gènes complets. Pour obtenir la profondeur de séquençage à haut, le nombre de patients multiplexés doit être diminué. Comme enrichissement ADNg est basé sur la capture par les sondes, l'enrichissement n'est pas homogène (figure 5). Avec notre protocole, nous avons généré environ 6 Go de lit, induisant une couverture moyenne de 150 lit pour chaque base, avec un minimum de 20 et un maximum de 330 lectures. Ces profondeurs sont lues en fonction de l'utilisation de l'END dans la pratique clinique 11. Malgré l'hétérogénéité des profondeurs de lecture, probablement en raison de l'enrichissement de l'ADNg de capture, et pas la majeure de réarrangement de gènes, il est important de noter que le Q-score était toujours supérieur à 30 (figure 5), validant ainsi le séquençage.
Néanmoins, il est important de valider la technologie en comparant le résultats obtenues avec celles obtenues avec le séquençage de Sanger. Dans les 17 patients séquences à la fois par séquençage de Sanger (séquences codantes de gènes BRCA1 et BRCA2) et de la technologie à base de transposase, nous avons détecté les mêmes 330 variations génétiques (SNP et mutations). A titre d'exemple, une mutation ponctuelle dans le gène BRCA1 (figure 6 à gauche) et une délétion de quatre bases dans le gène BRCA2 (Figure 6) ont été détectés droit à la fois par Sanger et des méthodes basées sur la transposase. Comme BRCA1 est sur le brin inverse du chromosome 13, il est important de noter qu'il est nécessaire de compléter (mais pas inverser) la séquence obtenue, alors que pour BRCA2 (sur le brin direct), la séquence obtenue n'a pas besoin d'être complétée . Comme indiqué sur la figure 5, la technologie NGS donne une fréquence estimée de la variation génétique, tandis que la méthode de Sanger ne fonctionne pas. En outre, en particulier pour les variations indels, l'interprétation est plus facile avec NGtechnologie de S. Comme le montre la figure 6 droite, les séquences de variation de indel apparaissent comme un électrophérogramme brouillé qui a besoin d'un séquençage direct et inverse pour décrypter la séquence insérée ou supprimée. Avec l'analyse de NGS, la séquence insérée ou supprimée est directement déterminée, réduisant ainsi le risque d'erreur d'interprétation. Enfin, la technologie à base de transposase nous a permis d'analyser un plus grand nombre de gènes cibles, et nous avons trouvé beaucoup de nouvelles séquences de variation génétique qui n'étaient pas couverts par séquençage Sanger. Ces résultats seront publiés ailleurs.
Figure 1: Schéma de flux de travail de la procédure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les contrôles de qualité avant et après la préparation bibliothèque. A. profil photométrique du ADNg qui peut être utilisé en toute sécurité pour tagmentation. Le rendement de l'ADN doit être supérieure à 5 ng / pl, 260/280 et 260/230 ratios doit être supérieur à 1,8 et 2, respectivement. Profils d'analyseur B. Fragment de tagmented ADNg. Panneau supérieur représente insuffisamment tagmented ADNg. Le panneau inférieur montre un échantillon parfaitement tagmented. C. Fragment profil de l'analyseur de bibliothèque prête juste avant le séquençage lancement. taille de fragment est le même que ADNg tagmented (B, panneau inférieur), mais avec une quantité amplifié. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3 Vérification génération de cluster. A. Capture d'écran de l'appareil de séquençage pendant la course. densité de cluster doit être comprise entre 800 et 1 000 K / mm ². B. Différentes images correspondent à faible densité (en haut), haute densité (panneau inférieur) et la densité parfaite (panneau du milieu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 4 Vérification de la Q-score. A la fin de la course, le séquençage validé doit avoir au moins 75% des groupes générés avec un Q-score supérieur à 30.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 données de couverture Représenter et leur Q-score correspondant. La profondeur de lecture est hétérogène tout au long de la génétique couvert. Néanmoins, le Q-score des régions concernées est toujours supérieure à Q-30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Les résultats représentatifs obtenus par séquençage de Sanger et de la technologie à base de transposase. Tous les variations génétiques observées avec le séquençage Sanger ont été; detected avec la technologie à base de transposase. Considérant que les mutations ponctuelles sont faciles à interpréter, des altérations de indels sont parfois très difficiles à étudier avec la méthode de Sanger. Grâce à la technologie à base de transposase associé à un dispositif de débit moyen, indels modifications sont simples à découvrir. Néanmoins, il est important de noter qu'il est nécessaire de compléter (mais pas inverser) séquences obtenus lorsque le gène cible est situé sur le brin moins (ici le gène BRCA1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'utilisation généralisée de dispositifs et de technologies de l'END a offert de nouvelles possibilités dans l'étude du cancer et des maladies génétiques. En plus de séquençage du génome entier ou le séquençage de l'ARN, l'analyse d'une grande quantité de certaines séquences d'ADNg de nombreux patients en même temps offre de grandes perspectives dans le diagnostic. Ici, nous avons développé une conception spécifique (disponible sur demande) en utilisant la technologie Nextera d'étudier 11 gènes complets chez 24 patients simultanément avec un dispositif de séquençage moyen débit (Table des Matières / Équipement). Ce protocole permet la génération rapide de données qui permet une réponse rapide aux préoccupations des patients avec un faible risque d'erreur. Comme illustré sur la figure 6, toutes les variantes génétiques détectées avec un séquençage Sanger ont également été détectées en utilisant le kit de préparation à base de transposase. Cette méthode est fiable et facile à interpréter, surtout pour les modifications de indels complexes qui sont analysés directement. Néanmoins, il est importantà noter que pour les gènes situés dans le brin moins, il est nécessaire de compléter (sans inversion) nucléotides. Le présent travail a été réalisé avec une conception de l'analyse de 11 gènes complets, mais le protocole est le même quel que soit le dispositif choisi. Technologie transposase peut également être utilisé pour la préparation bibliothèque de produits de PCR à long terme 12. En effet, l'algorithme (développé par le fabricant) utilisée pour la conception (outil de site Web du fabricant, voir le tableau des Matériaux / Équipement) est spécifiquement dédié à ce protocole. En plus de transposase basée sur la technologie, deux autres mécanismes de fragmentation de l'ADN avant la préparation bibliothèque sont également disponibles: la fragmentation mécanique et la fragmentation enzymatique. Fragmentation de l'ADN mécanique est reproductible mais a besoin d'un appareil à ultrasons, et la préparation de la bibliothèque est plus cher et plus de temps. Fragmentation enzymatique de l'ADN induit souvent des problèmes pour la capture de l'ADN dues à emplacements des sites d'enzymes de restriction, ce qui entraîneen l'absence de couverture de la séquence cible. Néanmoins, chaque stratégie de fragmentation de l'ADN a ses avantages et inconvénients, mais semble donner des résultats tout à fait similaires, au moins pour une longue gamme de produits PCR fragmentation 13. L'utilisation d'un nouveau cocktail enzymatique semble fournir les mêmes résultats que ceux obtenus avec la fragmentation de l'ADN mécanique 14. Technologie transposase doit ADN de haute qualité (pas applicable pour l'ADN extrait à partir de tissus FFPE). En outre, l'activité de la transposase doit fragments de plus de 300 pb, ce qui suggère que les fragments d'intérêt doivent être plus longue que cette longueur. Cette spécificité explique la nécessité d'une haute qualité, de l'ADN non fragmenté.
Jusqu'à présent, les variations génétiques des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été étudiés dans le sein familial et des ovaires. Cependant, l'implication des gènes BRCA, et en particulier BRCA2, est maintenant soupçonné dans d'autres cancers, en particulier dans le pancréas 15, de la prostate16, et des testicules cancers 17. La modification génétique des PALB2, un partenaire de gènes BRCA, est également associée à un cancer du pancréas 18. En outre, il est apparu récemment que les patients présentant des mutations du gène BRCA, et dans une moindre mesure des mutations PALB2, a montré une meilleure réponse de leur cancer du pancréas aux inhibiteurs de PARP 19. BRCA1, BRCA2, et PALB2 sont associés à un risque familial de cancer, et peut-être associés à la sensibilité à des traitements spécifiques, il apparaît important d'explorer les gènes BRCA1 et BRCA2 partenaires dans le dépistage du risque de cancer familial et dans le dépistage de la réponse au traitement du cancer.
A partir de ces données, l'analyse des gènes liés à la réparation de rupture d'ADN semble être importante non seulement pour le dépistage de la sensibilité mais aussi pour un indicateur putatif de la réponse au traitement. En outre, l'analyse complète du gène proposé avec ce protocole pourrait CoVer toutes les modifications qui pourraient être présents congénitalement (et présent dans les cellules cancéreuses), tels que des mutations dans le promoteur, des sites d'épissage ou de sites d'épissage des introns situés dans la réglementation. À ce jour, des modifications dans les séquences de gènes non codant n'ont pas été étudiées en profondeur, mais le développement des études d'association pangénomiques pourraient mettre en lumière d'importantes fonctions de ces séquences.
En conclusion, la conception basée transposase développé dans cet article est un moyen intéressant d'explorer des anomalies génétiques dans les gènes de susceptibilité au cancer impliqués dans réparation de l'ADN. La possibilité de séquencer les gènes complets pour 11 patients 24 est à la fois un avantage important par rapport à la méthode de séquençage de Sanger, qui est une technique très difficile pour le criblage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well Plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Manufacturer website tool |
References
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