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Biology

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de Published: October 6, 2014 doi: 10.3791/51902
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

Abstract

O uso generalizado de Next Generation Sequencing abriu novos caminhos para a pesquisa do câncer e diagnóstico. NGS trará enormes quantidades de novos dados sobre o câncer e, especialmente, genética do câncer. O conhecimento atual e futuras descobertas tornará necessário estudar um grande número de genes que poderiam estar envolvidos em uma predisposição genética para o câncer. Neste sentido, foi desenvolvido um projeto para estudar Nextera 11 genes completos envolvidos no DNA reparação de danos. Este protocolo foi desenvolvido para estudar com segurança 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 e TP53) do promotor de 3'-UTR em 24 pacientes simultaneamente. Este protocolo, baseado em tecnologia de transposase e gDNA enriquecimento, dá uma grande vantagem em termos de tempo para o diagnóstico graças genética para provar multiplexação. Este protocolo pode ser utilizado com segurança com ADNg sangue.

Introduction

Em 2010, cerca de 1,5 milhões de pessoas (essencialmente mulheres) desenvolveram câncer de mama em todo o mundo. Estima-se que 5 a 10% dos casos eram hereditários. Quase 20 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 foram identificados como envolvidos na mama hereditário e câncer de ovário 1. Desde cerca de 15 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 regiões codificantes foram sequenciados para determinar a predisposição genética para câncer de mama e ovário. Alterações nos genes BRCA1 e BRCA2 são detectados em 10 a 20% das famílias seleccionadas 2 sugerindo que a análise destas regiões não é suficiente para um rastreio eficaz. Recentemente, a análise de seqüências não-codificantes (íntrons, promotores, 3'UTR) de BRCA1 e BRCA2 destacou que novas mutações / variações poderiam estar ligadas a um maior risco de câncer de mama 3-6.

Proteínas BRCA1 e BRCA2 estão envolvidas na reparação de recombinação homóloga (HHR), que é completado por inúmeros parceiros 7. Enquanto as alterações nos genes BRCA1 ou BRCA2 induzir defeitos no reparo do DNA, os outros parceiros também podem afetar o risco de câncer de mama. Esta hipótese parece ter sido validada desde BRIP1 8 e 9 PALB2 têm um impacto comprovado sobre o câncer do colo do útero e de mama, respectivamente. Além disso, dois outros genes "risco moderado" de câncer de mama susceptibilidade, ATM e CHEK2, também podem ser estudados rotineiramente 10.

Na sequência destes estudos, decidimos desenvolver um protocolo para analisar 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, e TP53) em 24 pacientes simultaneamente, utilizando uma forma muito fácil e relativamente protocolo rápido com base na tecnologia de transposase, com o enriquecimento e a sequenciação de um dispositivo de transferência médio. Obrigadoa esta técnica, foi sequenciado a partir de genes completos no início do promotor para a extremidade de 3'-UTR, excepto para RAP80, para a qual não foi coberta uma região intrónica de 2500 pb (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Isso representa um total de cerca de 1.000.300 bp estudou com 2.734 sondas. Normalmente, as sequências de BRCA1 e BRCA2 exônicos são analisados ​​por sequenciação de Sanger, que precisa de 1,5 meses para pacientes com menos de 20. Com o presente protocolo (Figura 1), ao mesmo tempo, 11 genes completos para mais de 75 pacientes poderia ser analisado.

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Protocol

1 Avaliação de gDNA (DNA genômico) Rendimento

  1. Quantificar recém-extraído gDNA antes da preparação da biblioteca. Use o método de avaliação de rendimento fluorométrica quantificar gDNA intacta (evitar o uso de um espectrofotômetro para avaliação de rendimento gDNA). Medir a proporção (260/280 nm) e assegurar que é entre 1,8 e 2 NOTA: 50 ng de gDNA são necessários para o experimento.

2. gDNA Enriquecimento: Dia 1 Manhã

  1. Antes da partida
    1. A partir do kit enriquecimento DNA (ver Tabela de Materiais / Equipamentos), descongele tampão DNA (DT) e da enzima DNA (TDE1) soluções no gelo. Pelo menos 30 min antes do uso, trazer purificação esferas magnéticas e parar alvo (ST) de tampão à temperatura ambiente (RT). Adicionar 20 ul de amostra no ADNg 2-2,5 ng / mL directamente numa placa de 96 poços, 1 poço por amostra. IMPORTANTE: Use um controle positivo para validar o protocolo (amostra com variação de seqüência conhecida).
  2. Tagmentation
    1. Mix todos os reagentes bem, invertendo 5x e mexer um pouco. À TA, adicionar 25 ul de tampão de TD para cada poço contendo 50 ng (20 pi) de gDNA, e, em seguida, 5 ul de tampão TDE1. Definir pipeta 50 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes.
    2. Cobrir a placa com uma película adesiva e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C. Em seguida, colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C) e executar o seguinte programa: 55 ° C durante 5 min e 10 ° C durante tempo ilimitado.
    3. Durante esta incubação, preparar a folha de amostra com o software Experiência Manager para definir os índices que serão utilizados.
  3. Tagmentation Purificação
    NOTA: Esta etapa é fundamental. Tenha muito cuidado.
    1. Verificar a ausência de precipitado em purificação de esferas magnéticas e tampão ST. Se os precipitados estiverem presentes, aquecer-se soluções nas mãos. Tampão de ressuspensão Thaw (RSB) no gelo.
    2. À TA, uma solução de ST vórtice e adicionar15 mL para cada amostra bem contendo. Definir pipeta a 65 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Incubar durante 5 min à TA. Cobrir a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    3. Adicionar 52 uL de pérolas magnéticas de purificação previamente misturados em cada cavidade. Definir pipeta para 117 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Cobrir a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    4. Remover a película adesiva. Colocar a placa de 96 cavidades sobre um suporte magnético durante 2 min à temperatura ambiente. Verifique se o sobrenadante completamente clara.
    5. Prepara-se uma solução fresca de etanol 80% (para 24 amostras, adicionar 2 ml de água destilada e 8 ml de etanol). Remova e descarte o sobrenadante com cuidado para não perturbar as esferas.
    6. Mantendo a placa sobre o suporte magnético, adicionar 200 mL de etanol preparada de fresco de 80% a cada cavidade sem perturbar as esferas e incubar a placa durante, pelo menos, 30 segà temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e repetir esta lavagem uma segunda vez. Assegurar o etanol foi removido. Deixar secar à temperatura ambiente durante 10 min ou até completa evaporação do etanol.
    7. Remova a placa do suporte magnético e adicionar 22,5 mL de tampão RSB. Defina a pipeta para 22,5 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Colocar a placa de 96 poços sobre o suporte magnético e incubar durante 2 minutos. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Suavemente transferir 20 ul do sobrenadante de uma nova placa de 96 poços.
      NOTA: Se necessário, determinar o tamanho das amostras tagmented usando um analisador de fragmento. Em vez de as etapas mencionadas acima, usar electroforese em gel de acrilamida de alta resolução. Fragmentos deve ser entre 150 pb e 1000 pb.
  4. 1 ª PCR Amplification
    1. Master mix Thaw PCR contendo polimerase (LP-PMM), Índice de um primer, e Índice de 2 soluções de primers no gelo. Combinar a combinação oíndices F com a folha de amostra Experiment Manager. Para multiplexação, preparar i7 diferente do índice 1 (i7, N7xx) para cada amostra.
    2. Em cada poço, adicione 20 mL de LP-PMM, 5 l de índice 1 e 5 mL de índice 2 Defina a pipeta de 50 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Cobrir a placa com uma película adesiva Microseal. Centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C) e um programa de execução (Tabela 1).
      NOTA: o procedimento pode ser interrompido nesse ponto e as reações armazenados durante a noite no termociclador ou por 2 dias entre 2 e 8 ° C.

3. gDNA Enriquecimento: Dia 1, Tarde

  1. Antes da partida
    1. Oligos Thaw (CSO), buffer de destino de captura 1 (NCT1) e RSB soluções no gelo. Pelo menos 30 min antes do uso, trazer purificação esferas magnéticas a RT.
  2. PCR Purification
    1. Centrifugar a placa a partir do passo 2.4, de 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    2. À TA, adicionar 45 ul de mistura de purificação de esferas magnéticas em cada poço. Defina a pipeta de 95 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Colocar a placa de 96 cavidades sobre um suporte magnético durante 2 minutos à TA.
    3. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Prepara-se uma solução fresca de etanol 80% (para 24 amostras, adicionar 2 ml de água destilada e 8 ml de etanol). Descartar o sobrenadante com cuidado para não perturbar o sedimento.
    4. Mantendo a placa sobre o suporte magnético, adicionar 200 mL de etanol preparada de fresco de 80% a cada cavidade sem perturbar as esferas e incubar a placa durante 30 segundos à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e repetir esta lavagem uma segunda vez. Assegurar o etanol foi removido. Deixar secar à temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Remova a placa do suporte magnético e adicionar 40 mL de tampão RSB. Defina o tubotte a 40 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes.
    6. Colocar a placa de 96 poços sobre o suporte magnético e incubar durante 2 minutos. O sobrenadante deve aparecer completamente clara. Suavemente transferir 38 ul do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços.
    7. Determinar o rendimento de cada amostra por um método fluorométrico. Esta primeira parte do protocolo irá ser validado se os rendimentos são avaliadas entre 30 e 50 ng / ul.
  3. 1 º Hibridização
    1. Reunir-se a 12 amostras por piscina nesta fase por mistura de 500 ng de cada amostra em uma nova placa de 96 poços. Certifique-se de que o volume final de cada conjunto não exceda 40 ul.
      NOTA: Se necessário, diminuir o volume de piscinas, utilizando um dispositivo de concentrador de vácuo à temperatura ambiente (Cuidado: a concentração de ADN não pode ser modificada por meio de aquecimento, mesmo a 30 ° C, tal como o aquecimento provoca a degradação de DNA). Ajustar o volume final para 40 mL por adição de solução RSB.
    2. Misture bem oSolução NCT1. Para cada poço, contendo 40 ul de amostras de DNA reunidas, adicionar 50 ul de NCT1, e 10 ul de OSC. Defina a pipeta de 100 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Selar a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C) e um programa de execução 2 (Tabela 1).

4. gDNA Enriquecimento: Dia 2 Manhã

  1. Antes da partida
    1. A partir do kit enriquecimento DNA (ver Tabela de Materiais / Equipamentos) degelo NaOH 2 N (HP3), tampão de eluição alvo 1 (ET1), alvo de tampão de eluição 1 ET2, esferas magnéticas estreptavidina (SMB), solução de lavagem 1 (WS1), lavagem solução de 2 (WS2), solução de lavagem de 3 (WS3), soluções OSC, e NCT1 à TA.
  2. 1 º Hibridização Wash
    1. Remover a placa de 96 poços do termociclador e centrifugar 1 min a 280 xg a 20 ° C. Remover a tampa adesiva muito carefully.
    2. Transferir a mistura de reacção de 100 ul a partir da placa para uma nova MIDI placa de 96 poços e adicionar 250 ul de solução bem agitada em turbilhão SMB. Defina a pipeta de 350 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Selar a placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C, remover o selo adesivo e colocar a placa de suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Descartar o sobrenadante e retire a placa do suporte magnético.
    4. Adicionar 200 ul de solução WS1 bem misturado para os grânulos que contenham bem. Definir a pipeta de 200 uL e suavemente pipetar o volume total para cima e para baixo 15x evitando a formação de bolhas / espuma.
    5. Colocar a placa de suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Descartar o sobrenadante e retire a placa do suporte magnético.
    6. Adicionar 200 ul de solução WS2 bem misturados em poços Contacontas ining. Defina a pipeta de 200 mL e gentilmente pipeta todo o volume para cima e para baixo 15x evitando a formação de bolhas / espuma.
    7. Colocar a placa de suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Descartar o sobrenadante e retire a placa do suporte magnético.
    8. Adicionar 200 ul de solução WS2 bem misturados em poços contendo esferas. Defina a pipeta de 200 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 15x.
    9. Transferir todo o volume de uma nova placa de 96 poços. Selar a placa e colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C). Inicie o termociclador a 42 ° C durante 30 min.
    10. Imediately colocar a placa no suporte magnético por 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Retire o selo e descartar imediatamente todo o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético.
    11. Adicionar 200 ul de WS2 em poços contendo esferas. Defina a pipeta para 200ul e suavemente pipetar o volume total para cima e para baixo 15x evitando a formação de bolhas / espuma. Selar a placa e colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C). Inicie o termociclador a 42 ° C durante 30 min.
    12. Colocar imediatamente a placa do suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Retire o selo e descartar imediatamente todo o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético.
    13. Adicionar 200 ul de solução WS3 bem misturados em poços contendo esferas. Defina a pipeta de 200 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 15x.
    14. Colocar a placa de suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Descarte todo o sobrenadante e retire a placa do suporte magnético.
    15. Repetir a lavagem WS3 uma segunda vez.
    16. Depois de remover o sobrenadante, selar a placa e centrifugar brevemente para puxar para baixo sobrenadante residual. Colocar a placa deo suporte magnético durante 2 min. Descartar o sobrenadante residual.
    17. Em um tubo de 0,2 mL, misturar 28,5 ul de ET1 e 1,5 ul de soluções HP3. Essa mistura é para 1 piscina, se mais piscinas estão preparados, multiplicar esses volumes pelo número de pools preparados.
    18. Remova a placa do suporte magnético. Adicionar 23 ul da mistura preparada anteriormente. Defina a pipeta de 23 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 15x. Selar a placa e deixar durante 5 min à TA. Centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    19. Colocar a placa de suporte magnético durante 2 min. Verifique se o sobrenadante completamente clara. Remover a película adesiva e transferir 21 ul de sobrenadante para uma nova placa de 96 poços.
    20. Adicionar 4 ml de solução para cada poço ET2. Defina a pipeta de 25 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes e selar a placa.
      NOTA: o procedimento pode ser interrompido nesse ponto e as reações armazenado por até 7 dias à temperatura de -15 ° C. Se a placa está congelado, descongelar completamente antes de iniciar a hibridização 2 nd.
  3. 2 ª Hibridização
    1. Centrifuga-se a placa durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C. Retire a película adesiva e adicionar 50 mL de NCT1, 10 ml de CSO, e 15 mL de água PCR grau aos 25 l de biblioteca. Defina a pipeta de 100 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes.
    2. Selar a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C) e um programa de execução 2 (Tabela 1).

5. gDNA Enriquecimento: Dia 2, Tarde

  1. Antes da partida
    1. Thaw ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 e soluções HP3 no RT para lavagem de hibridização. A partir do kit de enriquecimento de ADN, descongelar PCR master mix contendo polimerase (TC-PMM), PCR cocktail iniciador (PPC), e RSB soluções em gelo durante a amplificação por PCR.
  2. 2 ª Hibridização Wash
    1. Siga exatamente o mesmo protocolo que 4,2 - 1 º lavagem de hibridização.
  3. Amplificação por PCR
    1. Numa nova placa de 96 poços, misturam 20 jil de eluição do passo 5.2, 25 ul de TC-PMM, e 5 ul de PPC. Defina a pipeta de 50 mL e pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Selar a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C.
    2. Colocar a placa num termociclador (tampa aquecida a 100 ° C) e um programa de execução 3 (Tabela 1).

6. gDNA Enriquecimento: Dia 3

  1. Antes da partida
    1. Solução Thaw RSB no gelo. Pelo menos 30 min antes do uso, trazer purificação esferas magnéticas a RT.
  2. PCR Purification
    1. Centrifugar a placa a partir do passo de 5,3 por 1 min a 280 xg a 20 ° C, e retirar a cobertura adesiva.
    2. À TA, adicionar 90 ul de previously misturado purificação esferas magnéticas em cada poço. Defina a pipeta de 140 mL, pipeta suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Colocar a placa de 96 cavidades sobre um suporte magnético durante 5 min à TA. Verifique se o sobrenadante completamente clara.
    3. Prepara-se uma solução de etanol a 80% fresco (para duas amostras, adicionar 200 mL de água destilada a 800 ul de etanol). Descartar o sobrenadante com cuidado para não perturbar o sedimento.
    4. Mantendo a placa sobre o suporte magnético, adicionar 200 mL de etanol preparada de fresco de 80% a cada cavidade sem perturbar as esferas e incubar a placa durante 30 segundos à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e repetir esta lavagem mais uma vez. Assegurar o etanol foi removido. Deixar secar à temperatura ambiente durante 15 min ou até completa evaporação do etanol, enquanto a placa está no suporte magnético.
    5. Remova a placa do suporte magnético e adicionar 30 mL de tampão RSB. Defina a pipeta de 30 mL, e gentilmente pipeta ttodo ele de volume para cima e para baixo 10 vezes. Incubar a placa durante 2 min à temperatura ambiente.
    6. Colocar a placa de 96 poços sobre o suporte magnético e incubar durante 5 min ou até que o sobrenadante completamente clara. Suavemente transferir 28 ul do sobrenadante para uma nova placa de 96 cavidades (tipo placa: TCY).
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido nesta fase e as reacções armazenadas a -15 ° C durante um máximo de 7 dias.
  3. Biblioteca de validação e quantificação
    1. Determinar a qualidade da biblioteca, utilizando um analisador de fragmento. Electroforese em gel de acrilamida de alta resolução pode ser usado para substituir os passos mencionados acima, mas não é recomendado. Fragmentos deve ser entre 150 pb e 1000 pb.
      NOTA: Recomendado: Quantificar a biblioteca por qPCR para obter o melhor número de clusters durante o seqüenciamento.
    2. Como referência, usar uma biblioteca validado (2 nM). Se a primeira biblioteca está a ser preparado, usar o fago Phix ADN (10 nM) fornecida para a calibração da sequencing dispositivo.
    3. Preparar diluições em série do controlo positivo para obter 7 pontos, a 20, 16, 8, 6, 4, 2, e 1:00 em EBT (tampão de eluição EB + 0,1% de Tween 20). Diluir a biblioteca de juros de 1/1000 e 1/2000. Cada ponto deve ser analisada em triplicado.
    4. Prepare o seguinte mix (volumes multiplique pelo número de poços utilizados): por um bem, adicione 10 ml de SYBR Green contendo mistura principal qPCR (2x), 0,2 l de cartilha para a frente (10 m, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 mL de primer reverso (10 uM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), e 7,6 mL de água de grau de PCR.
    5. Depois de se misturar, em depor uma placa de 96 poços, 18 mL de mistura em cada poço e 2 ul de diluições da biblioteca de controlo e positivos. Selar a placa e centrifugar durante 1 minuto a 280 xg a 20 ° C. Em seguida, coloque a placa em um termociclador de PCR quantitativo e execução do programa 4 (Tabela 1).
    6. Analisar os resultados como a quantificação absoluta convencional para se obter o rendimento de cada library. A vantagem de qPCR é que ela só quantifica ADN que podem interagir com a célula de fluxo.
      NOTA: Não utilizar quantificação fluorimétrica de ADN devido à presença de moléculas miméticas de ADN de um dos reagentes. Este método de quantificação seria superestimar o rendimento biblioteca e, conseqüentemente, subestime o escore de aglomeração.
  4. Sequenciamento Lançamento
    1. Dilui-se cada biblioteca a 4 nM em um volume final de 30 ul de tampão de eluição (EB), e reunir todas as bibliotecas e misturar bem.
    2. Prepara-se uma nova solução de NaOH 0,2 N em tampão BE e misturar 10 ul desta solução com 10 ml de NaOH de bibliotecas reunidas. Misturar bem e incubar exactamente 5 min à TA.
    3. Após a 5 min, adicionar imediatamente 980 uL de tampão de hibridação (cartucho de sequenciação) e misturar bem. Em seguida, misturar 400 ul desta mistura com 600 ul de tampão de hibridação. Misturar bem e transferir 600 ul em um cartucho de 300 ciclo (2 x 150) para a injecção de 8AM. Lançamento seqüenciamento.

Análise de Dados 7.

  1. Uma vez que o dispositivo tenha processado os dados, transferir o .bam e arquivos .vcf para um novo computador.
    NOTA: fragmentação transposase incorpora pegadas. Por conseguinte, o software corta automaticamente esses dados.
  2. Colete variações genéticas obtidas com a análise do dispositivo.
  3. Analisar arquivos exportados (.bam, .vcf) com outro software (Alamut), seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, comparar as variações genéticas obtidas com ambas as análises. Apenas as variações detectadas duas vezes são considerados presentes.

As condições de PCR Tabela 1.

Programa Temperatura Tempo Num. de repetições
1 72 ° C 3 min 1 98 ° C 30 seg 1
98 ° C 10 seg 10
60 ° C 30 seg
72 ° C 30 seg
72 ° C 5 min 1
10 ° C ilimitada
2 95 ° C 10 min 1
93 ° C 1 min 1
91 ° C 1 min 1
89 ° C 1 min 1
87 ° C 1 min 1
85 ° C 1 min 1
83 ° C 1 min 1
81 ° C 1 min 1
79 ° C 1 min 1
77 ° C 1 min 1
75 ° C 1 min 1
71 ° C 1 min 1
69 ° C 1 min 1
67 ° C 1 min 1
65 ° C 1 min 1
63 ° C 1 min 1
61 ° C 1 min 1
59 ° C 1 min 1
58 ° C 1 min 16-18 hr
3 98 ° C 30 seg 1
98 ° C 10 seg 10
60 ° C 30 seg
72 ° C 30 seg
72 ° C 5 min 1
10 ° C ilimitada
4 95 ° C 10 min 1
95 ° C 15 seg 40
60 ° C 1 min

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Representative Results

Os resultados das amostras de CQ

A capacidade do presente método para determinar sequências de genes alvo se baseia na qualidade do ADNg (Figura 2A) e a qualidade do passo tagmentation. Se o tagmentation não é suficiente (Figura 2B, painel superior), a sequenciação não será satisfatória. Como mencionado acima, após a purificação tagmentation, o ADNg deve ser tagmented em fragmentos de 150 pb e 1000 pb, com a maioria dos fragmentos de cerca de 300 pb (Figura 2B, painel inferior).

No final da preparação da biblioteca, a qualidade da biblioteca é verificada usando um Bioanalyzer. O perfil obtido deve ser aproximadamente a mesma que depois tagmentation mas com um maior número de fragmentos (Figura 2C). Se a qualidade da biblioteca não é idêntica à Figura 1C, o seqüenciamento não deve ser realizada.

Uma vez que a seqüência é iniciada emo dispositivo de seqüenciamento, o escore de aglomeração está disponível após 9 ciclos e deverá estar entre 800 mil e 1,1 milhão agrupamentos / mm ² (Figura 3A). Se este número é mais baixo, a sequência não será satisfatória, especialmente em profundidade de leitura. Se for maior, as imagens serão borrados (Figura 3B), e nenhuma análise será feita em função da impossibilidade de diferenciar clusters.

No final da corrida, é importante verificar o índice de qualidade. Seguindo o protocolo descrito acima, a pontuação da qualidade de execução corresponderá à Figura 4. A qualidade de sequenciação está representada por uma pontuação de Q-(Q-30). Para validar a experiência, pelo menos, cerca de 75% das seqüências (clusters) deve ter um Q-score igual ou superior a 30.

Os resultados de sequenciamento

Este experimento foi projetado para estudar anormalidades genéticas constitucionais. Neste caso, a anomalia genética é present a 50% do genoma. Devido a isso, a profundidade de sequenciação não é muito importante. Aqui, nós preparamos e seqüenciados simultaneamente duas bibliotecas de 12 pacientes por 11 genes completos. Para obter alta profundidade sequenciação, o número de pacientes com multiplexagem tem que ser diminuída. Como ADNg enriquecimento é baseado na captura de sondas, o enriquecimento não é homogéneo (Figura 5). Com o nosso protocolo, geramos cerca de 6 Gb de leituras, induzindo uma cobertura média de 150 leituras para cada base, com um mínimo de 20 e um máximo de 330 leituras. Estas profundidades de leitura estão em conformidade com a utilização de NGS na prática clínica 11. Apesar da heterogeneidade de profundidades de leitura, provavelmente devido ao enriquecimento de ADNg de captura, e não o principal rearranjo de genes, é importante notar que o Q-pontuação foi sempre superior a 30 (Figura 5), validando assim a sequenciação.

No entanto, é importante para validar a tecnologia comparando o resultados obtidos com aqueles obtidos com o seqüenciamento Sanger. Nos 17 pacientes seqüenciados por sequenciação Sanger (codificação de seqüências de BRCA1 e BRCA2) e tecnologia baseada transposase, detectamos os mesmos 330 variações genéticas (mutações) e SNP. Como um exemplo, um ponto de mutação no gene BRCA1 (Figura 6 esquerda) e uma deleção de 4 bases no gene BRCA2 (Figura 6 direita) foram detectados por ambas Sanger e métodos baseados transposase. Como BRCA1 é na cadeia inversa do Cromossoma 13, é importante notar que é necessário para complementar (mas não inverter) a sequência obtida, enquanto que para BRCA2 (na cadeia para a frente), a sequência obtida não necessita de ser complementada . Tal como indicado na Figura 5, a tecnologia NGS dá uma frequência estimada da variação genética, enquanto que o método de Sanger não. Além disso, especialmente para as variações InDel, a interpretação é mais fácil com GNTecnologia S. Como mostrado na Figura 6, à direita, as sequências de variação indel aparecer como um electroferograma codificado que necessita para a frente e de sequenciação reversa para decifrar a sequência inseridos ou eliminados. Com a análise de NGS, a sequência inserida ou excluída é determinado diretamente, reduzindo assim o risco de má interpretação. Finalmente, a tecnologia baseada transposase nos permitiu analisar um maior número de genes-alvo, e encontramos muitas novas seqüências de variação genética que não foram cobertos pelo seqüenciamento Sanger. Estes resultados serão publicados em outros lugares.

Figura 1
Figura 1 Esquema de fluxo de trabalho do processo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 2. controles de qualidade antes e após o preparo biblioteca. A. Perfil do espectrofotométrica do ADNg que pode ser usado com segurança para tagmentation. O rendimento de DNA deve ser superior a 5 ng / mL, 260/280 e 260/230 relações deve ser superior a 1,8 e 2, respectivamente. Perfis analisador B. Fragmento de tagmented gDNA. Painel superior representa insuficientemente tagmented gDNA. Painel inferior mostra uma amostra perfeitamente tagmented. C. Fragmento perfil analisador de biblioteca preparada pouco antes de seqüenciamento de lançamento. O tamanho dos fragmentos é o mesmo que gDNA tagmented (B, painel inferior), mas com uma quantidade amplificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

> Figura 3
Figura geração de cluster 3 Verificação. A. tela do dispositivo sequenciamento durante a corrida. Densidade Cluster deve estar entre 800 e 1.000 K / mm ². B. Imagens diferentes correspondem a baixa densidade (painel superior), alta densidade (painel inferior) e densidade perfeita (painel do meio). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Figura 4
Figura 4 Verificação da Q-pontuação. No final da corrida, a sequenciação validado deve ter, pelo menos, 75% de agrupamentos gerados com um Q-pontuação superior a 30.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 Representação de dados de cobertura e sua correspondente Q-score. A profundidade de leitura é heterogênea ao longo do gene coberto. No entanto, o Q-score das regiões abrangidas é sempre superior à Q-30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. resultados representativos obtidos com sequenciamento Sanger e com tecnologia baseada em transposase. Todas as variações genéticas observadas com seqüenciamento Sanger foram detected com a tecnologia à base de transposase. Considerando mutações pontuais são fáceis de interpretar, alterações InDel às vezes são muito difíceis de estudar com o método de Sanger. Com a tecnologia à base de transposase associado com um dispositivo de processamento médio, alterações InDel são simples de descobrir. No entanto, é importante notar que é necessário complementar (mas não inverter) seqüências obtidas quando o gene alvo situa-se na vertente menos (aqui o gene BRCA1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O amplo uso de dispositivos e tecnologias NGS tem proporcionado novas oportunidades no estudo de câncer e doenças genéticas. Além de seqüenciamento do genoma inteiro ou RNA sequenciamento, a análise de uma grande quantidade de seqüências gDNA selecionados em vários pacientes ao mesmo tempo oferece grandes perspectivas no diagnóstico. Aqui, desenvolvemos um projeto específico (disponível on demand) usando a tecnologia para estudar Nextera 11 genes completos em 24 pacientes, simultaneamente, com um dispositivo de transferência de sequenciamento médio (Tabela de Materiais / Equipamentos). Este protocolo permite a geração rápida de dados que permite uma resposta rápida às preocupações dos pacientes com baixo risco de erro. Tal como ilustrado na Figura 6, todas as variações genéticas encontradas com Sanger também foram detectadas usando o kit de preparação à base de transposase. Este método é confiável e fácil de interpretar, especialmente para alterações InDel complexos que são analisados ​​diretamente. No entanto, é importantede notar que, para genes localizados na cadeia menos, que é necessário para complementar (sem rotação) nucleótidos. O presente trabalho foi realizado com um projeto para a análise de 11 genes completos, mas o protocolo é o mesmo seja qual for o projeto escolhido. A tecnologia baseada em transposase pode também ser utilizado para a preparação da biblioteca de longo alcance, os produtos de PCR de 12. De fato, o algoritmo (desenvolvido pelo fabricante) usado para o projeto (ferramenta site do fabricante, consulte a Tabela de Materiais / Equipamentos) é dedicado especificamente para esse protocolo. Além disso a tecnologia à base de transposase, dois outros mecanismos de fragmentação do ADN, antes da preparação da biblioteca também estão disponíveis: fragmentação mecânica e de fragmentação enzimática. Fragmentação de ADN mecânica é reprodutível mas necessita de uma ultrasonicator, e preparação da biblioteca é mais caro e mais demorado. Fragmentação do DNA enzimática muitas vezes induz problemas para captura de DNA, devido à localização dos sítios de enzimas de restrição, resultandoem uma falta de cobertura da sequência alvo. No entanto, cada uma das estratégias para a fragmentação de ADN tem vantagens e desvantagens, mas parece dar resultados bastante semelhantes, pelo menos, por um longo intervalo de fragmentação do produto de PCR 13. O uso de uma nova mistura de enzimas parece fornecer os mesmos resultados que os obtidos com a fragmentação do ADN mecânico 14. Tecnologia baseada em transposase precisa de DNA de alta qualidade (não aplicável para o DNA extraído de tecidos FFPE). Além disso, a actividade da transposase deve fragmentos de mais do que 300 pb, o que sugere que os fragmentos de interesse deve ser mais longo do que este comprimento. Esta especificidade explica a necessidade de alta qualidade, o DNA não-fragmentada.

Até agora, as variações genéticas de BRCA1 e BRCA2 foram estudados em mama familiar e cancros do ovário. No entanto, o envolvimento dos genes BRCA e, especialmente, BRCA2, é agora suspeito de outros tipos de câncer, particularmente no pâncreas 15, da próstata16, e testículo cânceres 17. A alteração genética de PALB2, um parceiro de genes BRCA, também está associada com o câncer de pâncreas 18. Além disso, apareceu recentemente que os pacientes com mutações de BRCA, e, em menor grau mutações PALB2, mostrou uma melhor resposta de seu câncer de pâncreas de inibidores de PARP 19. Como BRCA1, BRCA2, e PALB2 estão associados a um risco familiar de câncer, e possivelmente associados à susceptibilidade a tratamentos específicos, parece importante explorar os parceiros BRCA1 e BRCA2 em triagem para risco de câncer familial e na triagem de resposta ao tratamento do câncer.

A partir destes dados, a análise de genes relacionados com a reparação da ruptura de DNA parece ser importante não apenas para a pesquisa de susceptibilidade, mas também para um indicador putativo da resposta ao tratamento. Além disso, a análise do gene completo proposto com este protocolo poderá cover todas as alterações que poderiam ser congenitamente presente (e presente em células de cancro), tais como mutações no promotor, sítios de união ou de locais de splicing reguladoras localizadas em intrões. Até o momento, alterações nas sequências de genes não-codificante não foram estudadas em profundidade, mas o desenvolvimento de estudos de associação do genoma poderia destacar funções importantes dessas seqüências.

Em conclusão, o projeto baseado em transposase desenvolvido neste trabalho é uma forma interessante de explorar anormalidades genéticas em genes de susceptibilidade ao câncer envolvidas no reparo de danos ao DNA. A possibilidade de sequenciar os genes completos 11 para 24 pacientes ao mesmo tempo é uma vantagem importante quando comparado com o método de sequenciação de Sanger, que é uma técnica bastante difícil para o rastreio.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MiSeq Illumina SY-410-1001 Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kit Illumina FC-123-1208 Transposase based technology
300 cycle cartridge Illumina 15033624
AMPure beads Beckman Coulter A63881 Magnetic purification beads
Magnetic stand Alpaqua A32782
96-well Plates Life Technologies 4306737
MIDI 96-well plates Biorad AB0859
Microseal A Biorad MSA-5001 This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeq Illumina Provided with the sequencing device
Experiment Manager software
Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Manufacturer website tool

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References

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Genetics Edição 92 gDNA de enriquecimento Nextera NGS danos ao DNA BRCA1 BRCA2
gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA
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Chevrier, S., Boidot, R. gDNA… More

Chevrier, S., Boidot, R. gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair. J. Vis. Exp. (92), e51902, doi:10.3791/51902 (2014).

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