Introduction
الدراسات الجينية على الكائنات الحية كثيرا ما تستخدم الجنين الدجاج كنموذج لأنه في Electroporation للالبيضة يمثل وسيلة سريعة وغير مكلفة لبالنقل جزئيا الهياكل الجنينية في الجسم الحي مع الحمض النووي يبني 1-5. ناقلات التعبير Bicistronic التي تكود نسخة واحدة تحتوي مراسل فلوري مع الجينات في المصالح، مثل pCIG 6 أو 7 pMES، يسمح بالتحقق السريع للجودة ترنسفكأيشن في المنطقة المطلوب بموجب stereomicroscope قبل معالجة الأجنة لتحليل المصب.
مع التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي، أصبح من الممكن الآن الحصول رقمية كاملة لمحات Transcriptome على التعبير من عينات الحمض النووي الريبي RNA باستخدام تسلسل 8،9. لذا، بدلا من الأساليب تستغرق وقتا طويلا التي تمكن من تحليل سوى عدد قليل من المنتجات الجينات في موازاة ذلك، مثل الموقع التهجين، المناعية وQPCR، وإعداد مكتبات [كدنا في ليمكن عالية الإنتاجية تسلسل تقديم المعلومات من Transcriptome على كله. يمكن ملاحظة آثار التجريبية على مستويات التعبير الجيني من كل واحد بدوره تقدم رؤى قوية على مسارات غيرت من التركيبة المستخدمة. هذا أمر سهل لا سيما إذا كان التجمع الجيني للكائن المستخدم هو متاح، وبالتالي فإن الجنين الفرخ هو نموذج مناسب مرة أخرى.
إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى مركز موثوق تسلسل الجينوم، القضية الرئيسية هي الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية. يوضح هذا العمل وسيلة للحصول على عينات من الحمض النووي الريبي من الأنابيب العصبية transfected مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي، وكذلك الخطوات اللاحقة للسيليكون في تحليل مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك. بعد Electroporation للفي HH12-13 تليها 48 ساعة الحضانة، تم تشريح الجذع transfected نصفين الحبل الشوكي في ظروف خالية من ريبونوكلياز، هي lysed على الفور وزيادة حمايتها من التدهور قبل منخفضة للغاية حتى تجميد تنقية RNA ومكتبة preparatأيون.
خادم العام غالاكسي 10 يوفر وصولا إلى تحرير الموارد لتحليل البيانات التسلسل الإنتاجية العالية. مقدار المساحة المعروضة للمستخدمين المسجلين يكفي للتجارب صغيرة، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى البنية التحتية الحاسوبية المحلية. ويشمل تحليل البيانات RNA يليها الترشيح، والمحاذاة والكميات / المقارنة بين التعبير الجيني. على الرغم من أن هناك مبادئ توجيهية عامة لتحليل البيانات RNA يليها، ومعايير الترشيح سيعتمد إلى حد كبير على نوعية التسلسل وينبغي أن تحدد بعد تحليل ومراقبة الجودة للبيانات الخام.
يصف هذا البروتوكول الخطوات للحصول على ومقارنة ملامح-RNA يليها من الدجاج الجنينية النخاع الشوكي transfected في الجسم الحي. نتيجة التمثيلية، وأظهرت المقارنة بين مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من عينتين مراقبة مستقلة transfected مع ناقلات الفارغة أن الأسلوب هو استنساخه وينبغي أن يسمح بتحديد اكسبريس تفاضليالنصوص سد في العينات التجريبية. وبالتالي، تطبيق هذه الطريقة لها القدرة على زيادة كبيرة في عدد من الاكتشافات بعد تجربة واحدة واحدة، وبالتالي توفير مجموعة كبيرة من البيانات للتحقيق لاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electroporate التركيبة الاهتمام في الأنابيب العصبية للأجنة الدجاج HH12-13 في البيضة
استخدام مراسل الفلورسنت، ويفضل في نسخة bicistronic أو تنصهر للبروتين في المصالح مع الإقحام الفيروسي 2A الببتيد 11، لتمكين سرعة تحديد الأفراد ذوي مستويات مرضية من ترنسفكأيشن. ملاحظة: فترة حضانة نموذجية لهذه المرحلة حوالي 48 ساعة في 37.8 درجة مئوية.
- فتح نافذة صغيرة في البيض بعد إزالة 3 مل من الألبومين مع حقنة إلى جانب 18 G × 1 1/2 إبرة. لتعزيز الجنين التصور، حقن كمية صغيرة من الحبر الهندي المخفف 01:50 في محلول معقم رينغر تحت الجنين 1-4.
- بعد تغطية الجنين بمحلول معقم رينغر، وضخ 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2 و 0.1٪ الغذاء صبغ (F، D & C) محلول يحتوي على 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض النووي حتى نهاية الخلفي من الأنبوب العصبي حتى يملأيصل إلى المنطقة الدماغ المؤخر. لelectroporate، أقطاب البلاتين موقف (0.5 ملم في القطر) مفصولة 4 مم 1 على طول منطقة الجناح وتقديم 5 نبضات من 50 ميللي ثانية و 20 V مع فاصل من 100 ميللي ثانية بينهما 4.
- بعد Electroporation لل، واحتضان الأجنة التلاعب بها لمدة 48 ساعة وأكثر حتى تصل إلى مرحلة HH23 وتحديد الأفراد تقديم مستوى عال من ترنسفكأيشن في المنطقة الاجنحة تحت stereomicroscope الفلورسنت.
ملاحظة: مدة حضانة المرض بعد Electroporation لليعتمد على الهدف من التجربة. يمكن البلازميدات electroporated تولد مستويات التعبير كبيرة بعد 2 ساعة 2. وبالتالي، إذا كانت المصلحة تكمن في الجينات ظهور أوائل فترة الحضانة ما بعد Electroporation للويمكن تخفيضها.
2. الحصاد Transfected بنجاح الأجنة وتشريح الأنصاف الحبل الشوكي Electroporated
ملاحظة: يستمر هذا الإجراء 2-3 ساعة لكل 10 أجنة والعوائد 1-2 الحمض النووي الريبي مجموع ميكروغرام لكل الجنين. تشريح الأنابيب العصبية يتطلب حركات غرامة وربما تكون بعض جلسات التدريب الضروري قبل تطبيقه على عينات تجريبية.
- تطهير أدوات تشريح المعدنية مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو عن طريق الخبز على 150 درجة مئوية لمدة 4 ساعات 12 وإعداد برنامج تلفزيوني المعالجة DEPC. استخدام الوحيد الجديد مصدق خالية من ريبونوكلياز بلستيكور.
ملاحظة: بعد الحصاد، فمن المهم اتباع الرعاية القياسية لمنع التلوث ريبونوكلياز خلال تشريح. - حصاد الأجنة باستخدام زوج من مقص تشريح غرامة وملعقة جمع منخول. الحفاظ على الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة المعالجة DEPC في 100 مم طبق بيتري.
- مع زوج من ملاقط دقيقة، قطع منطقة الجناح كلها (بين الحد الخلفي لبرعم الطرف الأمامي والحد الأمامي لبرعم الطرف الخلفي) ونقل هذا القسم إلى طبق جديد يحتوي البارد PBS المعالجة DEPC.
- استخدام اثنين من الإبر الزجاج غرامة لخرم في ثلاثة مختلفةيشير على كل جانب ظهراني الجنين بين الأنبوب العصبي والأديم المتوسط المجاور للمحور.
- إدخال الإبر الزجاج اثنين من ثقب في وسط والتحرك ببطء واحد منهم بعيدا على طول أنبوب المحور الأمامي الخلفي العصبي. كرر هذا للثقوب التي لا تصلها حركات الأولى. إزالة الأديم المتوسط المجاور للمحور منفصلة مع زوج من ملاقط غرامة.
- تحويل الجنين جانبية، إدراج نصائح من ملاقط بين الأنبوب العصبي والحبل الظهري وشريحة منهم في اتجاهين متعاكسين على طول المحور الأمامي الخلفي للفصل بين الهيكلين.
ملاحظة: هذا أيضا يجب إزالة أكثر من الأديم المتوسط لا تزال تعلق على الأنبوب العصبي. - إذا لزم الأمر، قم بإزالة أي أكبر قطعة من نسيج الأديم المتوسط التي لا تزال تعلق عن طريق سحب مع زوج من ملاقط حين الضغط بخفة الأنبوب العصبي مع زوج آخر من الملقط. عند الانتهاء، ونقل بلطف الأنبوب العصبي إلى طبق آخر يحتوي على البارد المعالجة DEPC PBS باستخدامريبونوكلياز خالية من الزجاج ماصة باستير مقترنة لمضخة ماصة اليدوية والحفاظ على الجليد حتى يتم تشريح جميع الأنابيب.
- تقسيم الأنابيب العصبية إلى نصفين. لهذا، أدخل طرف حاد من زوج من ملاقط مغلقة في التجويف وفتح لوحة السقف عن طريق تحريك ملاقط من خلال ذلك. بعد ذلك، فصل نصفين عن طريق خفض لوحة الأرض مع النصائح ملاقط.
- نوع electroporated من نصفين غير electroporated تحت نطاق الفلورسنت تشريح ونقل إلى أنبوب 1.5 مل مليئة المعالجة DEPC PBS الجليد الباردة. إذا لزم الأمر، ونفض الغبار microtubes بلطف للافراج عن أي نوع من الأنسجة التي تعلق على الجدران البلاستيكية وتشجيع الترسيب من الأنابيب.
- تدور في 100 x ج لمدة 3 ثوان، وإزالة ببطء شديد كما PBS قدر ممكن مع 1 مل ممص مكروى. تفعل هذا في حين تبحث في مصدر الضوء الذي يضيء من خلال microtube لمراقبة إذا تم امتصاص أي مادة الجنينية لطرف ماصة. إذا حدث هذا، الوفاء ببطء وتكرار centrifugaنشوئها.
- إضافة 70 ميكرولتر من محلول تحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي في الأنبوب العصبي نصف ونفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ودوامة بقوة. تكرار حضانة 5 دقائق وvortexing لمرتين أخريين. تخزين في -80 درجة مئوية.
- جمع ما لا يقل عن ثمانية نصفين الأنبوب العصبي لكل عينة لضمان العائد المناسب لاتخاذ الخطوة التالية. تجميع عينات أصغر إذا مطلوبة عدة جلسات Electroporation لل/ تشريح لجمع عدد كاف من الأنابيب العصبية. تخزين عينات كافية للمكررة أو يثلث لكل حالة.
3. تنقية RNA وإعداد مكتبات التسلسل البورشيد
- إزالة عينات من -80 ° C تخزين ووضع على الجليد لمدة 15-30 دقيقة. استئناف ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل.
- دوامة جيدا ويترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الدوامة مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان.
- نقل طاف لأنبوب جديدوالشروع في استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لمجموع العزلة RNA دليل طقم التعليمات. أزل في الحد الأدنى للحجم الموصى بها لزيادة التركيز.
ملاحظة: العلاج الدناز بعد تنظيف يوصى من أجل تجنب التلوث المحتمل لتسلسل الحمض النووي الجيني في قواعد البيانات-RNA يليها. - نفض الغبار الأنبوب لخلط محتويات وإزالة 5 ميكرولتر لتحليل ومراقبة الجودة. تخزين العينة المتبقية في -80 درجة مئوية حتى إعداد مكتبة. يجب إذابة هذه العينات مرة واحدة فقط لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
- تشغيل RNA المنقى في صك Bioanalyzer باستخدام نانو عدة RNA 6000. يجب أن تكون قيمة رين على الأقل فوق 7 والمضي قدما.
- إنشاء مكتبات باستخدام-RNA يليها متوافقة إعداد مكتبة والبورشيد ومتعدد يصل إلى 4 مكتبات في ممر واحد صك HiSeq المتوقع أن تولد 100 BP يقرأ احد. إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل جميع العينات في نفس المدى للحد من التحف الفنية المحتملة.
ملاحظة: يجب أن تسفر عن ما يصل الى 50 مليون صEADS في العينة، التي هي أكثر من كافية للحصول على تغطية لمعظم الجينات 13.
4. قارن بين مجموعات البيانات-RNA يليها في خادم غالاكسي العامة 10.
ملاحظة: مساحة التخزين خادم محدودة وتجارب مقارنة عينات كثيرة قد تتطلب حذف الملفات وسيطة ولدت في الخطوات الترشيح.
- إنشاء حساب مستخدم في وحدة خدمة الجمهور غالاكسي ( https://usegalaxy.org ) وبروتوكول نقل الملفات تحميل قواعد البيانات البورشيد في شكل fastq.
- إعداد الملفات التي يتم تحميلها مع أداة FastqGroomer 14 تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. إذا تم ترميز نقاط جودة بالفعل في PHRED + 33 (سانجر)، تخطي هذه الخطوة ببساطة عن طريق تغيير نوع الملف إلى fastqsanger تحت سمات لكل مجموعة البيانات.
- تحليل نوعية العامة لكل مجموعة البيانات باستخدام أداة FastQC تحت NGS: مراقبة الجودة والتلاعب لينو.
ملاحظة: ينبغي إيلاء اهتمام خاص لرسومات الناتجة عن محتوى تسلسل في تسلسل جودة قاعدة ولكل قاعدة، كما ستوفر هذه التقديرات للمعلمات المستخدمة لتقليم نهايات يقرأ. - تقليم يقرأ لتجاهل 3 "ينتهي مع البيانات منخفضة الجودة باستخدام أداة FASTQ الجودة المتقلب 14 تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لمعالجة 3 فقط 'ينتهي لدرجة جودة أقل من 20.
- إزالة متواليات محول من يقرأ باستخدام أداة كليب ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لتجاهل يقرأ مع أقل من 45 BP اليسار، إدخال سلسلة من محول المستخدمة واختيار الانتاج لتشمل كلا متواليات قص وغير قص. بالإضافة إلى ذلك، تختار عدم تجاهل تسلسل مع قواعد معروفة لأن معظم القواعد جودة منخفضة أزيلت بالفعل في الخطوة الأخيرة. باستخدام أداة تسلسل تريم ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) تحت NGS: مراقبة الجودة والقائمة التلاعب، وتقليم الأسس الأولى ليقرأ لإزالة 5 "التحيز تسلسل الكشف عنها بواسطة FastQC (عادة 10).
ملاحظة: عند هذه النقطة، انها فكرة جيدة لتشغيل FastQC مرة أخرى ومقارنتها مع التحليل السابق لتحديد ما إذا تم تحسين نوعية البيانات. - تحميل وتفريغ أحدث التجمع جينوم الدجاج للمتصفح الجينوم UCSC من البورشيد iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) وتحميل كامل الجينوم FASTA شكل ملف وملف تنسيق GTF الجينات الشرح لتاريخ المجرة باستخدام ملف تحميل أداة ضمن القائمة إحضار بيانات.
- خريطة يقرأ لكل عينة لجينوم الدجاج باستخدام اليجنر TopHat2 تحت 15وNGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الجينوم من التاريخ (حدد الملف FASTA تحميلها في الخطوة 4.7).
- بناء Transcriptome على توقع لكل عينة باستخدام أزرار أكمام تحت 16 خ ع: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح الإشارة كدليل (حدد الملف GTF التي تم تحميلها في الخطوة 4.7) وتشغيل خيارات تنفيذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة.
- دمج transcriptomes توقع لجميع العينات باستخدام Cuffmerge 16 تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح المرجعية (ملف GTF من الخطوة 4.7) وبيانات تسلسل (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7).
- مقارنة ملفات BAM الناتجة عن TopHat2 لكل عينة باستخدام Cuffdiff 16 تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. في النصوص الحقل حدد ليTranscriptome على rged ولدت قبل Cuffmerge وتشغيل الخيارات نفذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة.
- نوع التعبير التفاضلي اختبار الجداول تصاعدي عدديا في العمود 13 (قيمة ف) باستخدام أداة ترتيب ظل تصفية وفرز القائمة.
ملاحظة: الجينات / النصوص التي تبين التعبير فارق كبير بين ظروف تجريبية سيقدم أدنى قيم س. - للتحقق النتائج بصريا مع تغطية الرسوم البيانية، أولا تحويل الملفات إلى تنسيق BAM bedGraph باستخدام أداة إنشاء BedGraph تغطية الجينوم 17 ضمن القائمة BEDTools. تعطيل الإبلاغ عن المناطق بدون تغطية، واختيار لعلاج إدخالات كما تقسم فترات متميزة وتوسيع نطاق التغطية من قبل أحد العوامل التي تطبع عمق التسلسل لجميع مجموعات البيانات التي تقارن.
- تحويل الملف إلى تنسيق bedGraph الناتجة العظيم الشأن باستخدامأداة الباروكة / BedGraph-إلى-العظيم الشأن ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) ضمن القائمة تنسيقات تحويل. تحميل الملفات العظيم الشأن من المسارات المخصصة في متصفح الجينوم UCSC ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) لتجميع galGal4 والبحث في الجينات التي تهم تصور التغطية في قواعد البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقق من صحة الطريقة الموصوفة، وقد تم توليد عينات سيطرة اثنين من الأجنة electroporated مع pMES ناقلات الفارغة 7 وعينة واحدة من أجنة transfected مع نفس ناقلات تحتوي على إدراج بناء SCRT2-ZNF، الذي يشفر المجالات الزنك وأصابع الدجاج SCRT2 18. وقد تم الحصول على عينات العائد 11-22 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع كل من برك من 8 إلى 12 الأجنة. جميع العينات الثلاثة سجلت قيمة رين المثلى من 10 في التحقق من جودة أداء مع الصك Bioanalyzer (الشكل 1)، مما يدل على أن RNA جودة عالية ويمكن الحصول على هذا البروتوكول.
بعد التسلسل، زادت عملية تصفية وصف معدل التوافق 83-91٪ من يقرأ (لا تظهر البيانات). كما هو متوقع، أظهرت مقارنة بين transcriptomes من عينات السيطرة اثنين لا فرق واضح عند مقارنة عالميا في مؤامرة مبعثر (الشكل 2) وكان معامل ارتباط بيرسون 0.99. بالإضافة إلى ذلك، أظهر العرض التغطية لجميع مجموعات البيانات الثلاث على طول موضع الذي يحتوي على جزء من تسلسل SCRT2 زيادة واضحة في عدد من يقرأ تعيينها إلى هذه المنطقة في العينة التجريبية (الشكل 3)، مشيرا إلى أن overexpression كان ناجحة وأن الاختلافات بين السيطرة والعينات التجريبية يجب أن يكون كشفها مع الطريقة الموصوفة هنا.
الرقم 1: مراقبة الجودة RNA electropherograms Bioanalyzer يظهر مستوى عال من النزاهة لهما السيطرة الكاملة عينات الحمض النووي الريبي التي أشار إليها 18S 28S وقمم RNA الريباسي. إدراجات تمثل جل الظاهري للتشغيل.
فيقوإعادة 2: استنساخ النتائج الكميات-RNA يليها مؤامرة مبعثر تبين أن RPKM لمعظم الجينات هي نفسها في كل عينات السيطرة. تقريبا جميع الجينات التي لا تتبع هذا النمط لديهم قيم RPKM منخفضة جدا، وبالتالي عادة ما يتم تجاهلها من Transcriptome على المقارنات.
الرقم 3: تصور الاختلافات في العينة التجريبية UCSC متصفح الجينوم عرض من موضع SCRT2 في جينوم الدجاج (galGal4) تظهر زيادة ملحوظة في التغطية في المنطقة التي رموز للمجال البروتين (SCRT2-ZnF) أعرب ectopically في. العينة التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا توفير مبادئ توجيهية لتحليل الآثار بعد Electroporation للمن الحبل الشوكي الدجاج. على الرغم من Electroporation للناقلات الحمض النووي هو أكثر كثيرا ما تستخدم لبإفراط عن الجين من الفائدة، ويمكن للمرء أيضا استخدام التركيبات ترميز السلبيات المهيمنة، والبروتينات quimeric أو السلائف لالرناوات siRNAs لتوليد الظروف وظيفة الجين تدق إلى أسفل 19-21. في الواقع، مقارنة Transcriptome على التشكيلات الناتجة من كلا gain- والخسارة من وظيفة التحليل قد يشيرون إلى الجينات وأعرب تفاضلي في الطرق المعاكسة في كل حالة، وبالتالي لديها القدرة على كشف آثار أكثر تحديدا.
كما تطبق أي طريقة المصب لاستخراج الحمض النووي الريبي، والتوليف المكتبات-RNA يليها يتطلب كمية الحد الأدنى الأولي من بدء المادية. مع هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون 8 أجنة كافية لانتاج حوالي 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. يبدأ بعدد أقل من الأفراد دون المساس تركيز العمل المناسب هو على الارجحممكن مع استخدام أنظمة استخراج الحمض النووي الريبي التي تسمح التخفيف النهائي في أحجام أصغر.
يجب أن تمارس الفصل السليم من الأنبوب العصبي من جميع الأديم المتوسط عدة مرات قبل تطبيق لعينات مهمة، وهذا هو خطوة حساسة تتطلب بعض الألفة. لتجنب تدهور RNA المفرط أثناء تشريح خطوة، من المهم أيضا لإكمال الإجراء بأكمله لجميع الأنابيب العصبية في حوالي 1-2 ساعة. مرة أخرى، سوف يكون من المهم ممارسة لتحسين وقت تشريح. واحد ملاحظة هامة هي أن العلاقة بين أنسجة الأديم المتوسط أقوى من العلاقة بين الأديم المتوسط والأنبوب العصبي، وبالتالي سحب الهياكل أرومية متوسطة، وخاصة الحبل الظهري، هو أكثر فعالية من محاولة لقطع الأنسجة غير المرغوب فيها. أيضا، يجب أن يشعر الباحثون الحرة لتطوير تقنية خاصة بهم الأمثل لظروف تشريح الخاصة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر لمقارنة العينات في التجربة ذاتها إلى أن تشريح بالمثل بحيث LEVEلتر من التلوث مع الأنسجة أرومية متوسطة غير متجانسة بقدر الإمكان بين العينات.
يوضح بروتوكول لدينا مقارنة Transcriptome على ملامح من مرحلة HH23 الدجاج النخاع الشوكي الجنينية transfected في مرحلة HH12-13. ومع ذلك، ينبغي إجراء تعديلات صغيرة تسمح تطبيقه على الأجنة حصادها في مراحل سابقة. من ناحية أخرى، إذا رغبت مراحل لاحقة لتحليل النتيجة النهائية، وناقلات bicistronic المذكورة قد لا تكون مناسبة نظرا إلى انخفاض مستمر في عدد الجزيئات في الخلايا مع تقدم التنمية. وبالتالي، لا سيما إذا حقق نقطة نهاية المقصود بعد أكثر من 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، قد يكون من الضروري استخدام ناقلات ترميز ينقول بوساطة التكامل الجيني للبناء تستخدم 22.
مسألة أخرى للنظر هو عدم تجانس كفاءة Electroporation لل. ويتراوح عدد خلايا غير transfected من عدد قليل إلى عمو كبيرالاتحاد الوطني للعمال، وخاصة تلك الموجودة في الأنبوب العصبي البطني. منذ بعد تشريح تخضع جميع الخلايا لتحليل المصب، فإن كفاءة منخفضة Electroporation للتقليل حساسية الفحص و. هذا النهج لإثراء عينة مع خلايا electroporated هو استخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) للحد من عدد السكان من خلايا غير transfected من العينة النهائية 23. إذا تم استخدام هذا النهج، ومع ذلك، هناك عدد أكبر من الأجنة سوف تكون ضرورية لتحقيق عائدات كافية لإعداد مكتبة RNA يليها.
يوصى البورشيد التسلسل لأن هذا وتقدم أكثر على نطاق واسع من قبل مراكز والتسلسل في سيليكون وتحليل البيانات RNA بعدها تم تبسيط بالمقارنة مع غيرها من المنابر المتاحة 24. ومع ذلك، الخيارات الأخرى ما زالت كافية مع تعديلات في تصفية البيانات خطوات أكثر مناسبة لمنصة المختار. ما زالت لم تضع تماما المبادئ التوجيهية تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي والمقارنة بين مخرجات الابأوم مختلف الأدوات المتاحة، والبعض منها مدرجة بالفعل في وحدة خدمة الجمهور غالاكسي، ينصح بشدة. ومع ذلك، ينبغي للتحليل في سيليكون وصفها هنا تكون مناسبة للحصول على نتائج المقارنة جيدة من مجموعات البيانات عالية الجودة. كما هو الحال في جميع المجالات الأخرى في علم الأحياء، الإنتاجية العالية زيادات التسلسل بشكل كبير من كمية المعلومات التي يمكن الحصول عليها من تجربة واحدة، والطريقة الموصوفة هنا هي طريقة واحدة لتطبيقه على دراسة تطور الحبل الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
