Summary
Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.
Abstract
Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.
Introduction
Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten, da für die Messung von jeder Ebene der Probe nur diese Ebene dem Licht ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mikroskopietechniken, wobei zur Detektion der jeweiligen Brennebene die gesamte Probe beleuchtet wird, so daß bei der Aufzeichnung einer Vielzahl von Ebenen, die die Lichtdosis summiert und kann die Probe 12 zu beschädigen. Lichtschnittmikroskopie oder SPIM auf Beleuchtung der Probe in Richtung senkrecht zur Beobachtungspfad entweder durch die Verwendung einer Zylinderlinse oder durch Abtasten des anregenden Laserstrahls (für eine Übersicht siehe Ref. 8) basiert. Dies erfordert oft spezielle Probenkammern 13,14 oder Matrizen, zB Agarose 7,15, in speziellen High-Cost-Mikroskopen implementiert. Als Alternative zu diesen Systemen eine vergleichsweise einfache Beleuchtungseinrichtung für SPIM wurde entwickelt und mit einem herkömmlichen inversen Mikroskop 16 (siehe Figur 1) angepaßt ist. Es besteht aus einem Laserstrahl auf einen Durchmesser von 8 mm durch eine Zylinderlinse (Fokuslänge: 50 mm, numerische Apertur: 0,08) erweitert und fokussiert, um einen Lichtschnitt von 6-10 um Dicke über eine Schärfentiefe von etwa 100 um . Proben werden in einer rechteckigen Kapillare mit 600-900 um Innendurchmesser vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet len befindets für die Fluoreszenzdetektion. Diese Hauptmerkmale werden gegenwärtig abgeschlossen und durch die Verwendung von fortschrittlichen Mikrokapillare Ansätze zum Halten und zum Drehen der Proben, die synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtblatt (in axialer Richtung) und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion (identischen optischen Pfad eingesetzt optimiert Längen Verschiebung erfordern eine Korrektur der mechanischen Vorschub) und die Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln, damit die erforderliche Menge und Kosten zu minimieren.
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Protocol
1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation
- Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert
- Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten).
- Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit.
- Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschlossen und abgedeckt im Kühlschrank bei 5 ° C bis zur Verwendung.
- Samen etwa 150 MCF-7-Brustkrebszellen in jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 96 Vertiefungen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit Ham F-12-Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin / Streptomycin .
- Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 3776, c.
- Die Zell Sphäroide mit der Anthracyclin-Antibiotikum Doxorubicin-Hydrochlorid für 6 Stunden Inkubation bei einer Konzentration im Bereich zwischen 2 um und 8 um (in Kulturmedium) in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt.
- Die Zell Sphäroiden mit Kulturmedium oder Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) vor der Mikroskopie zu waschen.
- Versuch 2: Oxidationsprozess in Sphäroiden eine Redox-Sensor zum Ausdruck
- Samen etwa 400 U251-MG-L106 Glioblastomzellen permanent mit der Glutathion-empfindliche grün fluoreszierenden Redoxsensor Grx1-roGFP2 in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) transfiziert einer 96-Well-Platte in DMEM Kulturmedium mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 ug / ml) ergänzt.
- Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt.
- Fügen Sie 10 & #181; l Wasserstoffperoxid-Lösung (purum pa, ≥ 30%) auf 990 ul bi-destilliertem Wasser zu einer 100 mM Stammlösung zu schaffen, um innerhalb von 12 Stunden verwendet werden.
- Von der Stammlösung aus Schritt 1.2.3 bis 50 um in EBSS direkt vor dem Experiment.
- Während der Messung mit Wasserstoffperoxid 50 um EBSS zur Oxidation des Redox-Sensor die Zellkügelchen über das mikrofluidische System zu inkubieren.
- Versuch 3: Initiation und Kennzeichnung von zellulären Nekrose innerhalb Sphäroiden
- Samen etwa 400 Zellen (zB U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzellen) in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) einer Platte mit 96 Vertiefungen in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 mg / ml).
- Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt.
- Inkubieren Sie die ZelleSphäroide mit der mitochondrialen Elektronentransportinhibitor Rotenon für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 uM in einem Kulturmedium, um zelluläre Nekrose induzieren. Die gleichzeitige Inkubation mit einem grünen Farbstoff Zytotoxizität für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 ul in 1 ml Kulturmedium zu nekrotischen Zellen zu markieren.
- Mit Kulturmedium oder EBSS vor Mikroskopie Waschen Sie die Zell Sphäroiden.
2. Lichtblatt Anpassung
Hinweis: Zur Erzielung bester Ergebnisse ist darauf zu achten, dass die Strahltaille des Lichtblattes ist in der Fokusebene der Objektivlinse ist. Die Position der Strahltaille kann nur durch Beobachten der Lichtblatt in vertikaler Position in bezug auf die Kapillare ausgerichtet werden (siehe Schritte 2,5-2,8).
- Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und montieren Sie die SPIM Anregung Modul, wie in Lit. beschrieben. 16 an der Grundplatte des Positionierungstisches (siehe Abbildung 1a).
- Rüsten Sie das Mikroskop mit einer 10X / 0,3 oder 20x / 0,5 Mikroskopobjektivlinse und ein geeignetes Tiefpassfilter (beispielsweise λ ≥ 515 nm) in dem Detektionspfad des Mikroskops.
- Halterung eine integrierende Kamera auf den Detektionsanschluss des Mikroskops.
- Eine parallele kollimierten Strahl eines Lasers oder einer Laserdiode mit einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 470 nm und es auf dem SPIM Modul.
- Drehen die Zylinderlinse von 90 Grad, die das Licht Blatt in einer vertikalen Position für eine axiale Einstellung der Strahltaille des Lichtbogenüber.
- Platzieren einer Kapillare eine Flüssigkeit mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der in den Probenhalter enthält.
- Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Kapillare, so dass er zentriert ist und die Strahltaille des Lichtblattes im Fokus ist.
- Einstellen der Strahltaille durch Veränderung der axialen Position der Zylinderlinse sich. Drehen Sie die Linse nach Anzeigenstellung.
3. Zell Sphäroid Anwendung und Mikroskop-Feed Synchronisation
- Küvette Sphäroide einzeln oder in Gruppen in dem rechteckigen Borosilikatglas Kapillaren 16 mit einem Innenquerschnitt von 600 um x 600 um und einer Wanddicke von 120 um. Zwei Verfahren für die Anwendung eines Zell-Sphäroiden haben sich als erfolgreich erwiesen.
- Nehmen Sie die leeren Kapillare senkrecht mit Daumen und Mittelfinger und dichten die obere Öffnung mit dem Zeigefinger. Bringen Sie die untere Öffnung in der Nähe der Zell-Sphäroiden in seiner Umgebung Flüssigkeit (EBSS oder Kulturmedium). Lassen Sie den Zeigefinger von der oberen Öffnung. Flüssigkeit mit der Zell-Sphäroiden in sie sofort durch Kapillarkräfte eingeweicht werden. Einstellen der Position des Sphäroids innerhalb der gefüllten Kapillare durch Schwerkraft in den jeweiligen aufrechten Position der Kapillare.
- Alternativ gelten die Zelle Sphäroid auf die Kapillare über Pipettieren. Achten Sie darauf, that die Öffnung der Pipettenspitze ist, die einerseits groß genug für das Sphäroid Größe und andererseits kleiner oder gleich groß wie der Innendurchmesser der Kapillare.
- Platzieren der Kapillare mit dem Sphäroid in ihm in einem speziellen Probenhalter für die Mikroskopie.
- Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Zell-Sphäroiden, daß sie zentriert und ausgerichtet.
- Stellen Sie die Anpassung zwischen dem Lichtbogen und der Brennebene des Mikroskopobjektivlinse in dem Detektionspfad durch Einstellen der Position des Reflexionsspiegels und der zylindrischen Linse (siehe Einstellschraube in 1B).
- Einstellen der Mikrometerschraube (siehe Figur 1B) entsprechend den Brechungsindices und der numerischen Apertur der Objektivlinse, um das Aquarium Effekt zu kompensieren.
Anmerkung: verschiedene Brechungsindizes der Probe, und die sie umgebenden Medien ter die Objektivlinse zu einer Differenz zwischen der Verschiebung der Objektivlinse und der Verschiebung der Brennebene. Da der Lichtbogen wird durch die Objektivrevolver bewegt wird, wird die Fehlanpassung zwischen der Verschiebung des Lichtbogen (entsprechend der Verschiebung der Objektivlinse) und die Verschiebung der Fokusebene durch einen Hebelarm kompensiert (siehe Abbildung 1b). Die Mikrometerschraube wird verwendet, um den Abstand zwischen den oberen und den unteren Stift anzupassen, um die Verschiebung des Lichtbogens gemäß der numerischen Apertur der Objektivlinse und der Brechungsindizes ändern.
Abbildung 1. (A) Bild von der an der Grundplatte des Stelltisch von einem inversen Mikroskop montiert einzigen Ebene Beleuchtungsmodul, (B) Aufbau der einzelnen Ebene BeleuchtungModul und das Mikroskop Feed Synchronisation auf die Hebe-Mismatch (Aquarium-Effekt) zwischen Brennebene und Beleuchtungsebene auszugleichen. Az o zeigt die Verschiebung der Objektivlinse und Az f die Verschiebung der Brennebene und der Lichtbogen. Die Einlage zeigt Querschnitte von Sphäroiden enthält Kapillaren. Links: rechteckige Kapillare mit Innendurchmesser von 600 um (Wand 120 um). Rechts: Setup für die Rotation eingesetzt. Einen inneren runden Kapillare (Innendurchmesser 400 um, Außendurchmesser 550 um) in dem äußeren rechteckigen Kapillare gedreht. Der Raum zwischen den beiden Kapillaren mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist.
4. Messung in dynamischen flüssigen Umgebung
HINWEIS: Die bisherige Protokoll wird für die statische Inkubation vor einer Messung, bei der die Zelle Sphäroid zuvor in der Kapillare durch einfache Gravitation inkubiert und dann an Ort und Stelle gehalten wurde verwendet. Es besteht keine Notwendigkeit für eine weitere Befestigungsauf. Für Messungen in strömenden Medien, in denen eine dynamische Inkubation und daher ist eine dynamische Umgebung wünschenswert Aufnahmekinetik messen, kann diese Unterprotokoll auszuführen. Schritte 4,5-4,9 sind entscheidend, um Luftblasen Erreichen der Probe zu vermeiden.
- Füllen der Kapillare mit FCS für 30 min später zelluläre Adhäsion einer Zelle Sphäroid mit dem inneren Glasoberfläche zu unterstützen.
- Lassen die restlichen FCS Beschichtung im abgereicherten Kapillare austrocknen mindestens 12 Stunden.
- Einführung der Zell-Sphäroiden in die FCS beschichtet Kapillare, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
- Verlassen die Kapillare im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 2-4 h auf zelluläre Adhäsion des Sphäroids verursachen.
- Den Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems (siehe Abbildung 2). Verwenden eine peristaltische Pumpe, um die Zuströmung des Schlauchs zu füllen (Innendurchmesser: 0,89 mm) mit Kulturmedium, das den Fluoreszenzfarbstoff, Arzneimittel oder Mittel.
- Connect der Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems zu einer Blasenfalle (siehe Abbildung 2).
- Erste Klemme der Kapillare blasenfrei an den Zulauf Rohr und klemmen dann die andere Seite der Kapillare an der Ablaufschlauch.
- Abstimmung der Temperatur der Flüssigkeit von dem Wasserbad zu dem gewünschten Wert (zB 37 ° C).
- Einstellen der Schlauchpumpe auf die gewünschte Pumpengeschwindigkeit (zB Flußrate: 9 ml / min, Pumpengeschwindigkeit in der Kapillare: 25 mm / min).
- Sammeln Sie die gepumpte Flüssigkeit entweder in einem Empfänger (Open-Loop-Setup), führen Sie es zurück zu seiner Quelle (Closed-Loop-Setup) oder führen Sie es direkt in den Schlauch der Schlauchpumpe (tight Closed-Loop-Setup).
Abbildung 2. Mikrofluidik-Setup (Open-Loop-und Closed-Loop fest); Inlay: Beleuchtung eines spheroid innerhalb einer Mikro-Kapillare mittels Lichtbogen auf der Basis der Fluoreszenzmikroskopie zu einem inversen Mikroskop gekoppelt.
5. Datenerfassung und Auswertung
- Eingestellt, die Laserleistung und die Integrationszeit für die Bildaufnahme.
- Achten Sie darauf, dass die in Schritt 5.1 festgelegten Parameter nicht Licht Dosiswerte etwa 50-100 J / cm 2 für native Zellen oder 10-20 J / cm 2 für Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert oder mit einem fluoreszierenden Protein kodierenden Plasmid transfiziert nicht überschreiten Phototoxizität zu vermeiden (Details siehe Ref. 12).
- Stellen Sie die Schrittweite für die Z-Stapel, um Az = 5-10 um was bevorzugt für 3-dimensionale Datenanalyse ist als das Licht Blechdicke etwa 10 um.
- Führen Messungen von Einzelbildern oder Z-Stapel durch Variation der Brennebene innerhalb des Zell-Sphäroiden.
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Representative Results
Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert
Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, während in den Innenbereichen Sphäroid grüne Fluoreszenz von einem Abbauprodukt emittiert wird dominant in der zellulären Membran 19.
Abbildung 3. Fluoreszenzbilder aus verschiedenen Schichten (Az = 10 um) eines MCF-7 Mammakarzinomzell spheroid mit Doxorubicin (8 um, 6 Stunden) von einzelnen Ebene Illumination Microscopy aufgezeichnet inkubiert; 3-dimensionale Rekonstruktion mit z-Projektion (Anregung: λ = 470 nm; Fluoreszenz-Detektion: λ ≥ 515 nm Mikroskop-Objektiv: 10x / 0,30-Plan Neofluar).
Die Aufnahme des Chemotherapeutikum Doxorubicin im nativen menschlichen MCF-7-Brustkrebszellkügelchen wird in Abbildung 4 für eine Einzelzellschicht von SPIM ausgewählt dargestellt. Bei Anwendung von 2 um im Kulturmedium im Strömungssystem roten und grünen Fluoreszenz von Doxorubicin und sein Abbauprodukt Anstieg kontinuierlich (Bild und Spektrum dargestellt).
Abbildung 4. Zeitlicher Verlauf der zellulären Aufnahme von 2 um Doxorubicinim Kulturmedium über das Mikrofluidsystem. Fluoreszenzbilder aus einer einzelnen Schicht eines MCF-7-Brustkarzinom-Zell-Sphäroiden von einzelnen Ebene Beleuchtungs Mikroskopie in einem Abstand von 80 um von ihrem Rand mit zusätzlicher Fluoreszenzemissionsspektrum (Anregung aufgezeichnet: λ = 470 nm, Fluoreszenznachweis: λ ≥ 515 nm ; Mikroskop-Objektiv: 10x / 0,3-Plan Neofluar).
Versuch 2: Oxidationsprozess in Sphäroiden eine Redox-Sensor zum Ausdruck
SPIM Messungen der intrazellulären Redox-Staaten können Informationen über reaktive Sauerstoffspezies, zB in Tumoren zu geben. Dazu wird ein Sphäroid von U251MG-L106 Glioblastomzellen ständig mit der Glutathion empfindlich grün fluoreszierenden Redox-Sensor Grx1-roGFP2 verwendet wurde, transfiziert. Oxidation von Glutathion wurde durch Exposition gegenüber 50 uM Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) in Salz solut induzierten Ion (EBSS) über das Mikrofluidsystem und überwiegend trat in den äußeren Zellschichten des Sphäroids.
Wie zuvor berichtet, 20 der Aufnahme von H 2 O 2 zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität bei 470 nm angeregt wird, entsprechend der reduzierten Form des Redox-Sensor. Zu Beginn der Inkubation H 2 O 2 wirkt stark die äußeren Zellschichten (Dicke: 50 um) des Sphäroids und dann dringt tiefer in die Innenfläche (Durchmesser: 150 um) des Sphäroids mit zunehmender Inkubationszeit, was zu einer langsameren Abbau der Fluoreszenzintensität. Der zeitliche Verlauf dieser Abnahme ist in Figur 5 dargestellt ist, was die Möglichkeit der schnellen Wirkstoffanwendung kombiniert mit schnellen Nachweis des SPIM System 20.
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Figur 5: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenzabnahme bei 50 uM H 2 O 2 Inkubation einer U251MG-L106 Glioblastoma Zell-Sphäroiden permanent mit der Glutathion-empfindliche grün fluoreszierenden Redoxsensor Grx1-roGFP2 transfiziert. Die intrazellulären Redoxzustand Kinetik für die Außenschichten und der Innenfläche eines Zell-Sphäroiden durch Durchschnittsintensitätswerte der Fluoreszenzbilder von einzelnen Ebene Beleuchtungsmikroskopie (einzelne Schicht der Zell-Sphäroiden unter Strömungs) aufgezeichnet wurden.
Versuch 3: Initiation und Kennzeichnung von zellulären Nekrose innerhalb Sphäroiden
Zelluläre Nekrose initiieren eine U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzell Sphäroid wurde mit 1 uM Rotenon für 3 Stunden inkubiert. Die neurotoxische Mittel Rotenon ist ein Inhibitor der mitochondrialen Elektronentransportkette und führt zu einem Verlust der Integrität der Zellmembran. Um Visuasieren der nekrotische Wirkung, das Sphäroid wurde co-inkubiert mit dem grün fluoreszierenden Zytotoxizität Markierungsfarbstoff (1 ul in 1 ml Kulturmedium, 3 h), die in den beschädigten Zelle eindringt und bindet an die DNA in den Zellkern (siehe 6A, C). Als Referenz wird ein Hellfeldbeleuchtung Bild des gesamten Sphäroid in 6B gezeigt.
Abbildung 6 (A) Fluoreszenzbilder aus verschiedenen Schichten (Az = 5 um) ein U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzell Sphäroid co-inkubiert mit Rotenon (1 uM, 3 h) und grüne Farbstoff Zytotoxizität (1 ul in 1 ml Kulturmedium, 3 h), die durch einzelne Ebene Illumination Microscopy (Maßstab 100 um), (B) hell fi aufgezeichneteld Ausleuchtung des gesamten Sphäroid, und (C) rekonstruiert 3-dimensionalen Fluoreszenzbild (Anregung: λ = 470 nm; Fluoreszenz-Detektion: λ ≥ 515 nm Mikroskop-Objektiv: 20x / 0,5-Plan Neofluar).
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Discussion
Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette.
Hauptvorteile dieser SPIM Modul im Vergleich zu bestehenden Systemen (zB diejenigen, die in Lit. angegeben. 7, 8, 9, 14, 15) sind, dass es leicht zu jeder invertierten Weitfeldmikroskop angepasst werden, und die Proben befindet kleine Messkammern (Mikro-Kapillaren), die nur kleine Mengen benötigen of Fluoreszenz-Farbstoffe, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel, um verschiedene Arten von Experimenten verwendet werden, wodurch die Kosten, beispielsweise für pharmazeutische Tests zu minimieren. Dies gilt auch, wenn ein Mikrofluid-System, wie es in dieser Handschrift berichtet, verwendet. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass, obwohl für ein Open-Loop-Setup niedrigen Durchflussraten sind für die kosteneffiziente Wirkstoff-Screening vorteilhaft, Raten von bis zu 1.440 ml / min (entsprechend Geschwindigkeiten bis zu 4.000 mm / min) zeigte unter möglich sein die vorliegenden Versuchsbedingungen ohne Ablösung der Sphäroiden aus der Kapillare. Für eine enge Closed-Loop-Setup eine Mindestgesamtflüssigkeitsvolumen von 200-300 ul erforderlich ist, unabhängig von der Pumpe Geschwindigkeit.
Jede Lichtquelle, die zu einem beugungsbegrenzten Fleck, beispielsweise einem Laser oder einer Laserdiode, ausgerichtet werden können, können für die Beleuchtung verwendet werden. Anwendung von verschiedenen Lichtquellen erfordert jedoch chromatische Korrektur entweder durch zusätzliche TELESbewältigen Systeme vor einzelnen Lichtquellen 20 oder durch die Gestaltung eines achromatischen Beleuchtungssystem angeordnet ist. Ein weiteres Problem ergibt sich aus ausgesprochen Vorwärtsstreuung, die inhomogen über die Probe sein können, wodurch Artefakte wie Streifen oder Schatten. Variation der Beleuchtungswinkel einer Taumelmodus 21 oder spezifische Softwarealgorithmen 22, jedoch können diese Artefakte zu reduzieren.
Die vorliegende Beleuchtungssystem besteht aus einem telezentrischen Strahlen Expansion und Fokussierung durch eine Zylinderlinse von 50 mm Brennweite und einer numerischen Apertur A N = 0,08. Nach der Formel d = λ / A N für Fraunhofer-Beugung ergibt sich eine Dicke von etwa 6 um die Lichtwand (abhängig von der Anregungswellenlänge λ), die in etwa der Dicke der Zellenschicht und scheint ideal zur Beobachtung der einzelnen Schichten. Wenn eine höhere axiale Auflösung is gewünscht, kann die numerische Apertur durch Insertion eines zusätzlichen Mikroskopobjektivlinse mit mäßiger oder hoher numerischer Apertur in das Beleuchtungsstrahls mit der Lichtblatt in seine Öffnungsebene fokussiert erhöht werden. Dies führt zu einem anderen Lichtwand in der Ebene der Probe, die jedoch um 90 ° gedreht wird (eine Drehung der Zylinderlinse 90 ° kann diese Drehung zu kompensieren). Da Fernmikroskopobjektive haben numerischen Aperturen von bis zu etwa 0,60, kann die Dicke des Lichtblattes bis 1 um oder sogar weniger reduziert werden, wodurch die Annäherung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie erhalten axiale Auflösung. Gleichzeitig wird die Schärfentiefe, die proportional zu A n -2 von etwa 100 um bis weniger als 2 um reduziert.
Ein Fokusverschiebungskorrektur wird verwendet, um die so genannte Aquarium Effekt zu kompensieren durch eine Brechungsindex-Fehlanpassung. Die Verschiebung des Mikroskopobjektivs lens entlang der optischen Achse sich von der Fokusverschiebung innerhalb der Probe. Je nach dem Verhältnis der Brechungsindizes zwischen der Luft und dem Medium die Probe die Objekthöhe umgebenden erscheint mit einem Faktor von etwa 1,35 geholt und führt zu einer Fehlanpassung Hebe um den gleichen Faktor zwischen der Brennebene und der Beleuchtungsebene in SPIM zum Aufzeichnen Z -stacks (zum Vergleich siehe Abbildung 1B).
Mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS) eher symmetrische Muster, die aus allen Richtungen beleuchtet werden kann. Jedoch weniger symmetrische Muster oder Kleinorganismen Beleuchtung von verschiedenen Seiten wünschenswert sein. Daher haben wir kürzlich eine Einrichtung 23, wo die Proben in einer Mikrokapillare mit zylindrischer Form befindet (Innendurchmesser 400 um, Außendurchmesser 550 um), die innerhalb des rechteckigen Kapillare gedreht werden kann, entwickelt (Innendurchmesser 600 um, die Wanddicke 120 um), wie in dargestellt thE-Inlay von 1B. Aufgrund nahezu perfekte optische Kopplung der beiden Kapillaren Lichtblattes anhand der Mikroskopie kann mit der Drehung der Probe ohne Einschränkung miteinander kombiniert werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
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