Summary
En modul for enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som lett kan tilpasses til en invertert bredt felt mikroskop og optimalisert for tre-dimensjonale cellekulturer. Prøven blir plassert i en rektangulær kapillar, og via en microfluidic system fluorescerende fargestoffer, kan farmasøytiske midler eller legemidler anvendes i små mengder.
Abstract
En modul for lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som lett kan tilpasses til en invertert bredt felt mikroskop og optimalisert for tre-dimensjonale cellekulturer, f.eks, multi-cellulære tumor sfæroider (MCTS). De SPIM eksitasjon modul former og avbøyer lyset slik at prøven belyses av en lys arket perpendikulært på deteksjon bane av mikroskopet. Systemet er karakterisert ved bruk av en rektangulær kapillar for holding (og i en avansert versjon også av en mikro-kapillær tilnærming for roterende) prøvene, etter synkron innstilling av opplysnings-lyset er arket og objektiv-linsen som brukes for fluorescensdeteksjon samt ved tilpasning av en mikrofluidsystem for anvendelse av fluorescerende fargestoffer, farmasøytiske stoffer eller droger i små mengder. En protokoll for å arbeide med dette systemet er gitt, og noen tekniske detaljer som er rapportert. Representative resultater omfatter (1) måling av den oppta fra et cytostatisk medikament (doksorubicin) og dens delvise omdannelse til et nedbrytningsprodukt, (2) redoks målinger ved bruk av en genetisk kodet glutation sensor ved tilsetning av et oksidasjonsmiddel, og (3) initiering og merking av cellenekrose ved hemming av mitokondrie respiratoriske kjeden. Forskjellene og fordelene ved den foreliggende SPIM modul i sammenligning med eksisterende systemer er diskutert.
Introduction
I tillegg til godt etablerte metoder (confocal eller multi-foton laserskanning mikros 1-4, strukturert belysning mikros 5,6) lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) har vist seg å være en verdifull metode for 3D avbildning 7,8, 9. Av spesiell interesse er sin søknad til tre-dimensjonale cellekulturer, f.eks flercellede svulst sfæroider (MCTS), som brukes i økende grad for drug discovery forskning 10,11. Videre er en foretrukket metode SPIM når selv ved langtidseksponering eller gjentatte målinger med lite lys doser er nødvendig for å opprettholde prøven levedyktighet, siden for måling av hvert plan av prøven bare denne flaten er utsatt for lys. Dette er i motsetning til andre mikroskopiteknikker, hvor for deteksjon av hver fokalplanet hele prøven blir belyst, slik at ved registrering av flere fly lysdosen oppsummerer og kan ødelegge prøven 12. Lett ark mikroskopi eller SPIM er basert på belysning av prøven i perpendikulær retning til observasjons banen enten ved bruk av en sylindrisk linse eller ved å skanne spennende laserstråle (for en gjennomgang se Ref. 8). Dette krever ofte spesielle prøve kamre 13,14 eller matriser, for eksempel, agarose 7,15, implementert i spesielle høykostland mikroskoper. Som et alternativ til disse systemene en forholdsvis enkel belysningsanordning for SPIM har blitt utviklet og tilpasset en konvensjonell invertert mikroskop 16 (se figur 1). Den består av en laserstråle utvidet til en diameter på 8 mm, og fokuseres ved hjelp av en sylindrisk linse (brennvidde 50 mm, numerisk apertur: 0,08) til en lys ark av 6-10 mikrometer tykkelse over en dybdeskarphet på ca 100 um . Prøver ble plassert i en rektangulær kapillar på 600-900 mikrometer indre diameter plassert i front av mikroskopobjektivlinsens for fluorescensdeteksjon. Disse hovedtrekk er for tiden gjennomført og optimalisert ved bruk av avanserte mikrokapillære tilnærminger for holding og for roterende prøvene, synkron innstilling av opplysnings-lyset arket (i aksial retning) og objektivlinse benyttes for fluorescensdeteksjon (identiske optiske bane lengder av fortrengning krever en korreksjon av den mekaniske mate), og tilpasning av en mikrofluidsystem for anvendelse av fluorescerende fargestoffer, farmasøytiske midler eller legemidler, og dermed minimere de nødvendige mengder og utgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Spheroid vokser og Inkubasjon
- Forsøk 1: Celle sfæroider inkuberes med et kjemoterapeutisk stoff
- Forbered 1,5% agarose i dyrkningsmedium ved tilsetning av 0,45 g agarose i 30 ml dyrkningsmedium (tilstrekkelig til 6 plater).
- Varm blandingen fra trinn 1.1.1 til minst 80 ° C under omrøring og det fra tid til annen.
- Fyll 50 pl av den oppvarmede blandingen fra trinn 1.1.2 inn i hver brønn av en 96-brønns plate og la den stivne i løpet av 1-2 timer. Oppbevar platene lukket og dekket i kjøleskap ved 5 ° C før bruk.
- Seed omtrent 150 MCF-7 brystkreft-celler i hver brønn av stilles 96-brønns plate i Dulbeccos Modified Eagle 's Medium (DMEM) med Hams F-12 kulturmedium supplert med 10% kalvefosterserum (FCS) og 1% penicillin / streptomycin .
- Dyrk sfæroider i 5-7 dager opp til en diameter på omkring 200-300 pm i en inkubator med 5% CO2 og 3776, C.
- Inkuber celle sfæroider med antracyklin antibiotika doksorubicin-hydroklorid i 6 timer ved en konsentrasjon på mellom 2 og 8 uM uM (i kulturmedium) i en inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C.
- Vask celle sfæroider med kulturmediet eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS) før mikroskopi.
- Forsøk 2: oksidasjonsprosessen i sfæroider uttrykker en Redox sensor
- Seed om 400 U251-MG-L106 glioblastom celler permanent transfektert med glutation sensitive grønt fluorescerende Redox sensor Grx1-roGFP2 i agarosegel-belagt brønner (prosedyre beskrevet i trinn 1.1.1-1.1.3) av en 96-brønns plate i DMEM kulturmedium supplert med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og hygromycin B (150 ug / ml).
- Dyrk sfæroider i 5-7 dager opp til en diameter på 200-300 um i en inkubator med 5% CO2 og 37 ° C.
- Legg til 10 & #181, l hydrogenperoksyd-løsning (purum pa, ≥ 30%) til 990 ul bi-destillert vann for å lage en 100 mM stamløsning som skal brukes i løpet av 12 timer.
- Fortynn stamløsning fra trinn 1.2.3 til 50 uM i EBSS rett før forsøket.
- Inkuber celle sfæroider via mikrofluidsystem under måling med hydrogenperoksyd 50 uM i EBSS for oksydasjon av redoks-sensor.
- Eksperiment 3: Innvielse og merking av cellulær nekrose innen sfæroider
- Seed omtrent 400 celler (f.eks, U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastom celler) i agarose gel-belagte brønner (fremgangsmåten beskrevet i trinn 1.1.1-1.1.3) i en 96-brønns plate i DMEM kulturmedium supplert med 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin og hygromycin B (150 mg / ml).
- Dyrk sfæroider i 5-7 dager opp til en diameter på 200-300 um i en inkubator med 5% CO2 og 37 ° C.
- Inkuber cellensfæroider med mitokondriell elektrontransport inhibitor rotenon i 3 timer ved en konsentrasjon på 1 mM i kulturmediet for å indusere cellulær nekrose. I tillegg, co-inkuberes med et grønt fargestoff cytotoksisitet i 3 timer ved en konsentrasjon på 1 pl i 1 ml kulturmedium for å merke nekrotiske celler.
- Vask celle sfæroider med kultur medium eller EBSS før mikroskopi.
2. Lett Sheet Justering
MERK: For å oppnå best resultat må det sikres at strålen midje av lyset blad er i fokusplanet av objektiv. Posisjonen av strålen midjen bare kan justeres ved å observere lyset bladet i vertikal stilling i forhold til kapillarrøret (se trinn 2.5 til 2.8).
- Bruk et invertert mikroskop og montere SPIM eksitasjon modul, som beskrevet i Ref. 16, til basisplaten av posisjoneringsbord (se figur 1A).
- Utstyre mikroskopet med en 10X / 0.3 eller 20X / 0.5 mikroskop objektiv og en passende lang-pass filter (f.eks λ ≥ 515 nm) i registrerings banen av mikroskopet.
- Monter en integrerende kameraet til deteksjon port av mikroskopet.
- Bruk en parallell kollimert stråle av en laser eller en laserdiode med en eksitasjonsbølgelengde på 470 nm og fortrinnsvis anvende den til SPIM modulen.
- Roter sylindrisk linse 90 grader, som overfører lyset ark i en vertikal posisjon for en aksial justering av strålen midjen av lyset arket.
- Plasser en kapillar som inneholder en væske med et fluorescent farvestoff i prøveholderen.
- Fest prøveholderen med kapillær til posisjoneringsbordet i mikroskopet og justere posisjonen av kapillarrøret slik at den er sentrert, og strålen midjen av lyset arket er i fokus.
- Juster strålen midje ved å variere den aksielle posisjon av den sylindriske linse i seg selv. Slå tilbake objektivet etter annonsensjalusiens.
3. Cell Spheroid Søknad og mikroskop feed Synkronisering
- Plasser celle sfæroider hver for seg eller i grupper i rektangulær borsilikatglass kapillarer 16 med et indre tverrsnitt på 600 um x 600 um og en veggtykkelse på 120 mikrometer. To teknikker for anvendelse av en celle sfæroide har vist seg å være vellykket.
- Ta den tomme kapillær oppreist med tommelen og langfingeren og forsegle den øvre åpning med pekefingeren. Bring den nedre åpning nær den celle sfæroide i det omkringliggende væske (EBSS eller kulturmedium). Slipp pekefinger fra øvre åpning. Væske med celle sfæroide i den vil bli fuktet i umiddelbart ved kapillærkrefter. Justere posisjonen av den sfæroide innenfor det fylte kapillarrør av gravitasjon i respektive oppreist stilling i kapillarrøret.
- Alternativt gjelder celle spheroid til kapillær via pipettering. Ta vare that åpningen av pipettetuppen er, på den ene side er stor nok for den sfæroide størrelse, og på den annen side mindre enn eller lik i størrelse til den indre diameter av kapillar.
- Plasser kapillær med den sfæroide i det i en spesiell prøveholder for mikroskopi.
- Fest prøveholderen med kapillær til posisjoneringsbordet i mikroskopet og justere posisjonen av cellen sfæroide slik at den er sentrert, og konsentrert.
- Sett tilpasning mellom lys arket og fokalplanet av mikroskopobjektivlinsen i registreringsbanen ved å justere posisjonen til refleksjonsspeil og den sylindriske linse (se justeringsskrue i figur 1B).
- Juster mikrometer skrue (se Figur 1B) i henhold til brytning indekser og numerisk apertur av objektivet for å kompensere den fishtank effekt.
MERK: Ulike brytning indekser av utvalget og media rundt than objektiv føre til en forskjell mellom forskyvning av objektiv og forskyvning av fokusplanet. Siden lyset arket beveges av målet turret, er gapet mellom skift av lyset arket (tilsvarende forskyvning av objektivet) og forskyvning av fokalplanet kompensert av en vektarm (se figur 1B). Den mikrometer skrue brukes til å tilpasse avstanden mellom den øvre og den nedre bolten for å justere forskyvning av lyset arket i henhold til den numeriske apertur for objektivlinsen og brytningsindekser.
Figur 1 (A) Bilde av enkelt plan belysningsmodulen er montert til basisplaten av posisjoneringsbordet i en invertert mikroskop, (b) justering av den enkelt plan belysningmodulen og mikroskop fôr synkronisering å kompensere løfte-mismatch (fishtank effekt) mellom fokusplan og belysning flyet. ÅZ o indikerer forskyvning av objektiv og åZ f forskyvning av fokusplanet og lyset arket. Innlegget viser tverrsnitt av sfæroide inneholder kapillærer. Venstre: rektangulært kapillar med indre diameter på 600 mikrometer (vegg 120 mikrometer). Høyre: Oppsett brukes for rotasjon. En indre runde kapillar (indre diameter 400 mikrometer, ytre diameter 550 pm) blir rotert inne i den ytre rektangulær kapillar. Mellomrommet mellom de to kapillarer er fylt med en nedsenking fluid.
4. Måling i Dynamic Flytende Miljø
NB: Den foregående protokollen blir brukt for statisk inkubasjon før en måling hvor cellen sfæroide har tidligere blitt inkubert og deretter holdes på plass i kapillarrøret ved enkel gravitasjon. Det er ikke behov for ytterligere fixatipå. Imidlertid, for målinger i flytende media, hvor et dynamisk inkubering, og derfor er ønskelig å måle opptak kinetikk et dynamisk miljø, kan man oppnå dette sub-protokollen. Trinn 04.05 til 04.09 er avgjørende for å unngå luftbobler som når prøven.
- Fyll kapillær med FCS i 30 minutter for å støtte senere cellulær adhesjon av en celle sfæroide til den indre glassoverflaten.
- La resten FCS belegget i det utarmede kapillær tørke i minst 12 timer.
- Introduser cellen sfæroide til FCS belagte kapillarrør som beskrevet i trinn 3.2.
- La kapillarrøret i inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C i ytterligere 2-4 timer for å forårsake cellulær adhesjon av den sfæroide.
- Sett opp afflux del av mikrofluidsystem (se figur 2). Bruk en peristaltisk pumpe for å fylle afflux av slangen (indre diameter: 0,89 mm) med kulturmedium inneholdende det fluorescerende fargestoff, medikament eller middel.
- Connect til afflux del av mikrofluidsystem til en boble felle (se figur 2).
- Først klemme kapillær boble-fri til afflux rør og deretter klemme den andre siden av kapillære på avløpsrøret.
- Tune væsketemperaturen på vannbadet til den ønskede verdi (f.eks, 37 ° C).
- Juster den peristaltiske pumpe for å pumpe den ønskede hastighet (f.eks, Strømningshastighet: 9 mL / min; pumpehastighet i kapillær: 25 mm / min).
- Samle pumpet væske enten i en mottaker (open-loop setup), mate den tilbake til kilden (lukket krets oppsett) eller mate den direkte inn i slangen av den peristaltiske pumpen (tett lukket krets oppsett).
Figur 2. microfluidic oppsett (open-loop og tett lukket krets); inlay: Belysning av en spheroid innenfor et mikrokapillært ved hjelp av lys ark basert fluorescensmikroskopi koplet til et invertert mikroskop.
5. Datainnsamling og analyse
- Sett laser makt og integreringstiden for bildeinnlastingen.
- Ta vare på at de parametre som er definert i trinn 5.1 ikke overskrider lette doseverdier omtrent 50-100 J / cm 2 for native celler eller 10-20 J / cm 2 for celler inkubert med et fluorescerende fargestoff eller transfektert med et plasmid som koder fluorescerende protein til unngå fototoksisitet (for mer informasjon se Ref. 12).
- Sett økningen for den z-stabelen for å åZ = 5-10 mikrometer, som er å foretrekke for 3-dimensjonal analyse av data som lyset platetykkelse er omtrent 10 mm.
- Utføre målinger av enkeltbilder eller z-stabler ved variasjon av fokalplanet i cellen sfæroide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forsøk 1: Celle sfæroider inkuberes med et kjemoterapeutisk stoff
En z-stabel skanning av en på forhånd inkubert i MCF-7 celle sfæroide (8 pM doksorubicin, 6 timer) er vist i figur 3.. Det gir detaljert informasjon om cellulært opptak og fordeling av doksorubicin 17 og dets nedbrytningsprodukt 18,19. Innenfor det ytre cellelaget av den sfæroide røde fluorescerende doksorubicin hovedsakelig lokalisert er i kjernen, mens det i de indre områder sfæroide grønn fluorescens som sendes ut fra et spaltningsprodukt blir dominerende i den cellulære membran 19.
Figur 3. fluorescens bilder fra forskjellige lag (åZ = 10 mikrometer) av en MCF-7 brystkreft celle spheroid inkubert med doxorubicin (8 mikrometer, 6 t) registrert av enkelt plan belysning mikroskopi; 3-dimensjonal rekonstruksjon ved hjelp av z-projeksjon (eksitasjon: λ = 470 nm; fluorescensdeteksjon: λ ≥ 515 nm, mikroskop objektiv: 10x / 0,30 Plan Neofluar).
Opptaket av det kjemoterapeutiske legemiddel doksorubicin i native MCF-7 human brystcancercelle sfæroider er vist i figur 4 for en enkelt cellelaget valgt ved SPIM. Ved anvendelse av 2 uM i kulturmedium inne i strømningssystemet rød og grønn fluorescens av doksorubicin og dens nedbrytningsprodukt øker kontinuerlig (bilder og spektrum avbildet).
Figur 4. Tids løpet av cellulært opptak av 2 pM doksorubicini kulturmedium via mikrofluidsystem. Fluorescens bilder av et enkelt lag av en MCF-7 brystkreft celle sfæroide registrert av enkelt plan belysning mikroskopi ved en avstand på 80 mikrometer fra dets kant med ytterligere fluorescens emisjonsspektrum (eksitasjon: λ = 470 nm, fluorescens-deteksjon: 515 nm λ ≥ ; mikroskop objektiv: 10X / 0.3 Plan Neofluar).
Forsøk 2: oksidasjonsprosessen i sfæroider uttrykker en Redox sensor
SPIM målinger av intracellulære redoks stater kan gi litt informasjon om reaktive oksygenforbindelser, for eksempel i svulster. For dette formålet en spheroid av U251MG-L106 glioblastom celler permanent transfektert med glutation sensitive grønt fluorescerende Redox sensor Grx1-roGFP2 ble brukt. Oksydasjon av glutation ble indusert ved eksponering mot 50 mM hydrogenperoksyd (H 2 O 2) i salt solut ion (EBSS) via mikrofluidsystem og overveiende oppsto i de ytre cellelag av den sfæroide.
Som rapportert tidligere 20 opptaket av H 2 O 2 resulterer i en reduksjon av fluorescensintensiteten spent ved 470 nm, som tilsvarer den reduserte form av redoks-sensor. Ved begynnelsen av inkuberingen H 2 O 2 påvirker sterkt de ytre cellelag (tykkelse: 50 um) av den sfæroide, og deretter trenger dypere inn i det indre området (diameter: 150 mm) av den sfæroide med økende inkubasjonstid som resulterer i en langsommere nedbrytning av fluorescensintensitet. Tidsforløpet for denne reduksjonen er avbildet i figur 5, som viser muligheten for rask medikamentapplikasjons kombinert med rask påvisning av SPIM anordningen 20.
993fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. Tid løpet av fluorescens nedgang på 50 mikrometer H 2 O 2 inkubasjon av en U251MG-L106 glioblastoma celle spheroid permanent transfektert med glutation sensitive grønt fluorescerende Redox sensor Grx1-roGFP2. De intracellulære redox state kinetikk for det ytre lag og det indre område i en celle sfæroide ble oppnådd ved middelintensitetsverdier av fluorescens bilder registrert av enkelt plan belysning mikroskopi (enkelt lag av cellen sfæroide henhold flow).
Eksperiment 3: Innvielse og merking av cellulær nekrose innen sfæroider
Å starte mobil nekrose en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoma celle spheroid ble inkubert med 1 mM rotenon i 3 timer. Den nevrotoksiske middel rotenon er en hemmer av det mitokondrielle elektrontransportkjeden og fører til et tap av cellemembranintegritet. Å visuaisere seg nekrotisk effekt, sfæroide ble ko-inkubert med det grønne fluorescerende cytotoksisitet merking fargestoff (1 pl i 1 ml kulturmedium, 3t), som trenger inn i den skadede cellen og binder seg til DNA i cellekjernen (se figur 6A, C). For referanse, er et lyst felt belysningsbilde av hele sfæroide vist i figur 6B.
Figur 6. (A) fluorescens bilder fra forskjellige lag (åZ = 5 mikrometer) av en U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoma celle spheroid co-inkubert med rotenon (1 mikrometer, 3 timer) og grønn cytotoksisitet fargestoff (1 pl i 1 ml kulturmedium, 3 timer) registrert av enkelt plan belysning mikroskopi (skala bar 100 pm), (B) lyse field belysning av hele spheroid, og (C) rekonstruert tre-dimensjonal fluorescens bilde (eksitasjon: λ = 470 nm; fluorescensdeteksjon: λ ≥ 515 nm, mikroskop objektiv: 20X / 0.5 Plan Neofluar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende manuskriptet beskriver en lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) enhet som er optimalisert for 3-dimensjonale cellesystemer, f.eks flercellede tumor sfæroider (MCTS). Tre eksempelvise applikasjoner inkluderer (1) opptak av et cytostatisk medikament og dets delvise omdannelse til et nedbrytningsprodukt (hvis bidrag til kjemoterapeutisk effekt fremdeles gjenstår å bli evaluert), (2) måling av redoks-tilstand ved bruk av en genetisk kodet glutation sensor ved tilsetning av et oksidasjonsmiddel, og (3) initiering og merking av celle-nekrose ved inhibering av den mitokondrielle respiratoriske kjede.
De viktigste fordelene med denne SPIM modul i sammenligning med eksisterende systemer (for eksempel de som er rapportert i refs. 7, 8, 9, 14, 15) er at det lett kan tilpasses til en hvilken som helst inverterte bredt felt mikroskop, og at prøvene er plassert i små måle kamre (mikrokapillærer), som trenger bare små mengder of fluorescerende fargestoffer, farmasøytiske midler eller legemidler som skal brukes for ulike typer eksperimenter, og dermed minimere kostnadene, for eksempel for farmasøytiske tester. Dette gjelder også, hvis en mikro-fluidic system, som rapportert i dette manuskriptet, blir brukt. Imidlertid bør det nevnes, at selv for en åpen-sløyfe oppsett lave strømningshastigheter er fordelaktige for kostnadseffektiv medikamentscreening, hastigheter opp til 1440 mL / min (tilsvarende hastigheter opp til 4,000 mm / min) avdekket for å kunne utføres innenfor de foreliggende forsøksbetingelser uten løsgjøring av sfæroider fra kapillæret. For en stram, lukket sløyfe oppsett et minimum total væskevolum på 200-300 pl er nødvendig, uavhengig av pumpehastigheten.
Enhver lyskilde som kan fokuseres til en flekk diffraksjon begrenset, for eksempel en laser eller laserdiode, kan benyttes til belysning. Anvendelse av forskjellige lyskilder, krever imidlertid kromatisk korreksjon, enten ved ytterligere teleshåndtere systemer plassert foran individuelle lyskilder 20 eller ved å utforme en akromatisk lyssystem. Et ytterligere problem resultater fra uttalt forover spredning, som kan være inhomogen over prøven, og dermed forårsaker gjenstander som striper eller skygger. Variant av belysning vinkel i en wobbling modus 21 eller bestemte programvarealgoritmer 22, kan imidlertid redusere disse gjenstander.
Den foreliggende belysningssystem består av en telesentrisk ekspansjon og fokusere strålen av en sylindrisk linse 50 mm brennvidde, og en numerisk apertur A N = 0,08. I henhold til formelen d = λ / A N for Fraunhofer diffraksjon resulterer dette i en tykkelse på omtrent 6 mikrometer av lyset arket (avhengig eksitasjonsbølgelengde λ), som omtrent svarer til tykkelsen av et cellelaget og synes å være ideell for observasjon av enkelte lag. Hvis en høyere aksial oppløsning is ønsket, kan den numeriske apertur økes ved innsetting av en ekstra mikroskop objektivlinse av moderat eller høy numerisk apertur i belysnings stråle med lys arket blir fokusert inn i sin blenderplan. Dette resulterer i et annet lys ark i planet for prøven, som imidlertid er rotert med 90 ° (en rotasjon av den sylindriske linse 90 ° kan kompensere for denne rotasjon). Siden lang avstand mikroskop linser har numeriske åpninger opp til omtrent 0,60, kan tykkelsen av det lys arket bli redusert til omkring 1 pm eller mindre og således nærmer seg den aksielle oppløsning erholdt i konfokal laser-skanning mikroskopi. Samtidig dybdeskarphet som er proporsjonal med A N -2 er redusert fra omkring 100 pm til mindre enn 2 mikrometer.
Et samlingsskift korreksjon brukes til å kompensere den såkalte Fishtank effekt på grunn av en brytningsindeks mismatch. Skiftet av mikroskopet målet lens langs den optiske aksen er forskjellig fra fokusforskyvning inne i prøven. Avhengig av forholdet mellom brytningsindeksene mellom luft og materiale som omgir prøven objektet høyde vises clinched med en faktor på omtrent 1,35, og fører til en løfte mismatch med samme faktor mellom fokalplanet og belysningsplanet i SPIM for opptak z -stacks (for referanse se Figur 1B).
Multi-celletumor sfæroider (MCTS) er heller symmetrisk prøver, som kan være belyst fra en hvilken som helst retning. Imidlertid, for mindre symmetrisk prøver eller små organismer belysning fra forskjellige sider kan være ønskelig. Derfor har vi nylig utviklet et oppsett 23, hvor prøvene er plassert i en mikro-kapillar av sylindrisk form (indre diameter 400 mikrometer, ytre diameter 550 pm) som kan roteres i den rektangulære kapillar (indre diameter 600 mikrometer, veggtykkelse 120 um), som avbildet i the innlegg av figur 1B. På grunn av nesten perfekt optisk kopling av to blodkar lys ark basert mikroskopi kan kombineres med rotasjon av prøven uten noen begrensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av delstaten Baden-Württemberg, samt av EU, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Forfatterne takker Rainer Wittig (ILM Ulm) for å gi U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellelinje og Claudia Hintze for dyktig teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H.
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K.
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. Lippert, H., Wald, M., Radt, B. , 7,787,179 B2 (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. , EP 13 184 931.7 (2013).
