Introduction
Trasmissione sinaptica è mediata da esocitosi delle vescicole sinaptiche, contenenti neurotrasmettitori, e queste vescicole deve subire riciclaggio endocitica locale all'interno del nervo terminale per mantenere la comunicazione neuronale a lungo termine. Dato il ruolo essenziale della trasmissione sinaptica nel cervello, la comprensione del macchinario molecolare che costituisce il ciclo delle vescicole sinaptiche è un fondamento essenziale verso una migliore comprensione nella comunicazione cellulare nel suo complesso. Tra sistemi modello delle cellule, la cellula cromaffini surrenale ha fornito alcune delle l'intuizione più definitiva nel meccanismo molecolare alla base riciclo delle vescicole sinaptiche. Esocitosi, la fase finale di rilascio di neurotrasmettitore, è stato immensamente studiata ed esaminata attraverso l'uso della cella cromaffini surrenale 1,2. In realtà, la maggior parte dei giocatori molecolari che orchestrano la formazione, il targeting, attracco, e la fusione dei granuli secretori sono stati identificati grazie alla applicazione di divtecniche di Erse nelle cellule cromaffini 1. Inoltre, fornendo l'opportunità di consentire la risoluzione di una singola vescicola dei macchinari proteina coinvolta nella esocitosi, la cella cromaffini rimane un modello potente per affrontare le questioni della fusione delle vescicole 3.
Misure di capacità cellulari iscritti sono stati utilizzati nella risoluzione di singolo-fusione delle vescicole durante esocitosi 3. Esocitosi di vescicole piccole come ~ 60 nm di diametro è stato dimostrato di essere rilevato da membrana cellulare misurazioni ammissione con la tecnica del patch clamp in configurazione cell allegato 4-7. Accettazione è definita come una misura di quanto facilmente un circuito o un dispositivo consentirà una corrente di flusso; è l'inverso di impedenza. Pertanto, le misure di ammissione forniscono una comprensione della capacità di membrana. Questo si ottiene l'incorporazione della membrana vescicolare nella membrana plasmatica; questa incorporazione rivela cambiamenti di superficiezona 8. Ogni vescicola fusione provoca un aumento graduale di capacità di membrana 9,10. Inoltre, questa misura ammettenza fornisce la conduttanza della membrana e la fusione dei pori conduttanza durante un evento esocitotico 3. Poiché questa tecnica ha fornito uno strumento unico di identificare cinetica singoli-vescicole durante esocitosi, il nostro laboratorio ha recentemente applicato questo concetto per rilevare endocitosi di singole vescicole 11,12.
Il nostro interesse specifico è clatrina-mediata endocitosi (CME), che è stato considerato come una componente fondamentale di pulizia in molte cellule 13 e come via principale per endocitosi delle vescicole sinaptiche nei terminali neuronali 14,15. CME è conosciuto per essere biologicamente importante, tuttavia, la sua cinetica non restino ben capito a causa di limitazioni tecniche di monitoraggio degli eventi endocitiche singolari. Date le somiglianze nei meccanismi di esocitosi tra le cellule cromaffini e neuroni 1, è plausible che i meccanismi di fissione nelle cellule cromaffini può probabilmente applicarsi a endocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni. Le misure di capacità di cella-attached sono stati utilizzati per monitorare singoli eventi endocitiche e analizzare la cinetica di fissione, che la maggior parte dei metodi non sono in grado di risolvere. Nelle nostre registrazioni cellulari-attached, un'onda sinusoidale a 20 kHz si trova sopra il potenziale di detenzione, e la corrente di uscita è suddiviso in membrana conduttanza in un canale e capacità di membrana in un altro canale da una a due fasi amplificatore lock-in 16 18. Dai cambiamenti nella conduttanza di membrana e capacità, si può calcolare la cinetica di fissione poro, che probabilmente corrispondente al collo membrana tubolare che collega la vescicola internalizzazione alla membrana plasmatica prima vescicola pinch-off. Collettivamente, questa tecnica ci dà l'opportunità di esaminare i meccanismi regolatori della vescicola fissione durante CME.
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Protocol
NOTA: L'intera procedura è stata condotta in conformità con le linee guida del National Institutes of Health, come approvato dalla cura e uso degli animali Comitato della University of Illinois a Chicago.
1. Soluzioni e Media Cultura Preparati
- Conservare tutte le soluzioni a -20 ° C per un massimo di sei mesi. Tenere il terreno di coltura a 4 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare 100 ml di coltura mescolando 1 ml di soluzione di pen-strep e 1 ml di ITSX (Insulin-transferrina-Selenio-supplementazione) a 100 ml con DMEM.
- Preparare la soluzione enzimatica mescolando 250 ml di DMEM, 2,5 ml di 100 mM CaCl 2, e 2,5 ml di 50 mM EDTA.
- Preparare la soluzione inattivazione mescolando 225 ml di DMEM, 25 ml di FBS, 625 mg di albumina, e 625 mg di inibitore della tripsina.
- Preparare la soluzione di un Locke di 154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5,0 HEPES mM, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM di glucosio. Regolare il pH a 7,3 con NaOH.
- Preparare una soluzione di poli-D-lisina (PDL) di 50 mg / ml. Utilizzare una concentrazione finale di 1 mg / ml a lamelle cappotto.
- Preparare una soluzione extracellulare di 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM HEPES-NaOH, e glucosio 10 mM. Regolare il pH a 7,3 con NaOH con una osmolarità di ~ 310 nmol / kg.
- Preparare una soluzione di pipetta di 50 mM NaCl, TEACL 100 mM, KCl 5 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e HEPES 10 mM. Regolare il pH a 7,3 con NaOH con una osmolarità di ~ 290 nmol / kg.
Isolamento 2. ghiandola surrenale
- Autoclave un paio di grandi e piccole forbici dissezione e due paia di pinze. Indossare i guanti durante l'intero processo e posizionare il vassoio dissezione su un secchio di ghiaccio.
- Utilizzare i topi prese a Day 0-3. Euthanize animali con una pressione di CO 2 serbatoio seguita da decapitazione.
- Utilizzare il set più piccolo di forbici per tagliare lungo la schiena del cucciolo che segue la colonna vertebrale da cervi cal per caudale regione. Assicuratevi di tagliare superficialmente sotto la pelle e non penetrare nella cavità del corpo.
- Avanti, pelle a buccia lontano da spina dorsale in modo che la muscolatura sia esposto ad avere una visione chiara della colonna vertebrale. Da qui, fare un taglio transectional al midollo spinale cervicale e poi fare due tagli paralleli lungo i lati della colonna vertebrale.
- Con un paio di pinze che tengono il corpo dell'animale, utilizzare l'altra coppia di pinze per afferrare colonna vertebrale e buccia indietro della colonna vertebrale fino reni sono esposti.
- In questo momento, visualizzare le ghiandole surrenali sulla parte superiore dei reni. Poi posizionare accuratamente i due ghiandole di ogni animale in un tubo conico riempito con soluzione di Locke.
NOTA: A volte le ghiandole si attacchi alle pinze. Se questo è il caso, utilizzare delicatamente un altro paio di pinze per aiutare nella rimozione delle ghiandole delle pinze e verso la soluzione di Locke. Le ghiandole possono essere mantenuti in questa condizione per un massimo di 2 ore.
- Nel frattempo, bolla soluzione enzimatica con 5% di CO 2 + 95% O 2 per 15 minuti prima dell'uso. Assicurarsi che la soluzione equilibrata si trasforma da un colore rosa brillante nel colore rosa / arancio.
- Aggiungere la papaina alla soluzione enzimatica appena bolle ad una concentrazione finale di 20-25 unità / ml. Incubare ciascuna coppia di ghiandole di ciascun animale per 40-60 minuti a 37 ° C nella soluzione enzimatica con papaina.
- Aggiungere 75% di soluzione di inattivazione a ciascuna provetta e incubare a 37 ° C per altri 10 min. Questo incubazione inattiva l'attività enzimatica della papaina.
- Dopo i 10 minuti di incubazione con la soluzione di inattivazione, trasferire delicatamente le ghiandole in una provetta nuova etichetta e poi lavare le ghiandole 3x con la cultura dei media.
4. cellulare Dissociazione e placcatura
- Dopo il lavaggio, posizionare i due ghiandole in 200 ml di media cultura e poi titolare delicatamente le ghiandole egiù attraverso la punta della pipetta con una pipetta 200 microlitri fino a quando non vi è più un grosso pezzo di tessuto nella soluzione.
NOTA: Quando titolazione, mantenere ghiandole nella parte inferiore del tubo con una forza verso il basso dalla punta della pipetta 200 microlitri e impegnare il tessuto delicatamente e lentamente. Essere certi di utilizzare lenti, continui colpi, mai pipettaggio veloce o improvviso. - Aggiungere un ulteriore coltura 250 microlitri per portare il volume totale dei terreni di coltura fino a 450 ml.
- Piatto 60 ml di questa soluzione di cellule contenenti su ciascuno dei sette coprioggetto PDL-pre-rivestite 12 mm, che sono collocati in un piatto di coltura 60 x 15 mm.
- Una volta placcato, mettere il piatto in incubatrice che è impostato a 37 ° C e mantenuta con un costante flusso / fornitura di 5% di CO 2 per 30 minuti al fine di garantire un ambiente per la vitalità cellulare. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 5 ml di terreni di coltura pre-riscaldato nel piatto cultura e restituire il piatto di nuovo nel incubatore per 24 ore prima di cellula-addettoregistrazioni d.
NOTA: in genere, le cellule possono essere utilizzate per le registrazioni elettrofisiologiche per un massimo di 4 giorni.
5. cellulare Identificazione e Gigaohm Seal Formazione
- Posizionare il coprioggetto 12 millimetri nella soluzione extracellulare. Dal momento che l'intero ghiandole surrenali sono utilizzati per la preparazione delle cellule, mescolare le cellule cromaffini (in genere molto luminose con un marrone / colorazione beige e una forma quasi perfetta circolare (Figura 1) in coltura con cellule corticali (più piccole e dimmer di cellule cromaffini).
- Tirare le pipette di patch in quattro fasi utilizzando una programmabile P-97 estrattore. Immergere la punta della pipetta in una cera fusa, che contribuirà a ridurre la capacità del vetro e poi sparano lucidare la punta di "blow-away", questa cera dall'interno della punta della pipetta.
NOTA: Quando riempito con una soluzione di patch pipetta, pipette di patch in genere hanno una resistenza di circa 2 MW. - Avvicinarsi alla pipetta di patch vicino alla cella all'interno diversi microns. Per ottenere una configurazione cell-schiera, cercare qualsiasi lieve deformazione cellula durante l'avvicinamento della pipetta di patch più vicino alla cella. Esercitare una leggera aspirazione fino ad ottenere un sigillo GΩ.
6. cellulari-Attached Recordings di capacità
- Una volta che un sigillo GΩ si rivela, effettuare registrazioni cellulari-attached attraverso l'uso di un amplificatore EPC-7 plus patch-clamp e un amplificatore lock-in analogico a due fasi (vedi tabella allegata delle attrezzature). Applicare una sinusoide con ampiezza di 50 mV (rms) e la frequenza di 20 kHz dall'amplificatore lock-in.
- Impostare il filtro di uscita dell'amplificatore lock-in a 1 costante di tempo msec e 24 db. Impostare la fase dell'amplificatore lock-in modo tale che variazioni di capacità transitori prodotte da impulsi di aspirazione dolci appaiono solo nella traccia senza proiezione nel tracciato cerotto conduttanza (Ri) cerotto capacità (Im) (Figura 2).
NOTA: Si prega di vedere i dettagli per la calibrazione del sistema in reFerence 19. - Identificare le tipiche variazioni di capacità di passi "verso il basso" (Figura 3).
NOTA: Una registrazione solido sarà considerata come una "scala" tipo somiglianza con molti passi verso il basso, che indica interiorizzare singole vescicole. Il processo di patching serve da stimolo meccanico in quanto attuale azione può essere in genere registrato dalla maggior parte delle cellule. - Nome file come singole cartelle compresa la data: gg / mm / anno e ogni registrazione cell-attached come propria numerazione individuale (xx) all'interno di quel file.
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Representative Results
La vitalità delle cellule e la qualità di tenuta gigaohm sono critici nel determinare la qualità delle registrazioni capacità della cella collegata. Pertanto, è fondamentale per procurare un coltura cellulare efficace ed efficiente prima di registrazioni elettrofisiologiche, e le cellule vitali tipiche sono illustrate nella figura 1. Practice e il tempo sarà utile nel raggiungimento di un sigillo gigaohm con alta qualità. Se si può vedere chiaramente deformazione cella quando la pipetta di patch sta avvicinando la cella come descritto nel protocollo punto 5.3, vi è una migliore possibilità di ottenere un sigillo di qualità. Figura 3 dimostra una registrazione tipica di capacità di membrana con più passaggi associati a ribasso singolo endocitosi delle vescicole.
Figura 1 Esempi di cellule cromaffini vitali del mouse surrenali24 ore dopo la coltura cellulare. Frecce punto 3 cellule cromaffini vitali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Regolazione di fase nelle registrazioni cellulari iscritti. Con l'impostazione iniziale fase, aspirazioni dolci causano cambiamenti transitori sia in capacità (Im) e conduttanza (Re), le tracce e le proiezioni in traccia Re vengono annullate da una fase di 23 ° spostare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Un tipico cell-attached registrazione con più passaggi verso il basso, associate a singolo endocitosi delle vescicole capacità. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Misure di capacità cellulari iscritti richiedono diversi passaggi critici al fine di ottenere con successo le registrazioni di alta qualità: 1) cellule vitali e sane preparate dalle ghiandole surrenali; 2) il rivestimento PDL dei coprioggetto; 3) formazione sigillo gigaohm; 4) livello di rumore del sistema; e 5) correzione di fase.
Per la chirurgia animali, le modifiche si può potenzialmente fare è quello di regolare l'approccio chirurgico al meglio destrezza vestito e per evitare danni durante la dissezione. Inoltre, la pratica sufficiente su come individuare e rimuovere le ghiandole surrenali è indispensabile come le cellule che verranno utilizzati per le registrazioni elettrofisiologiche provengono esclusivamente dalla midollare della ghiandola surrenale. Per la digestione enzimatica, è fondamentale per equilibrare la soluzione enzimatica facendo gorgogliare la soluzione con 5% di CO 2 + 95% O 2. Accertarsi che il tubo collegato alla bombola è sufficiente e stretto con perdite. Inoltre, essere sicuri che alla fine isoluzione n è correttamente posizionato durante l'intero 15 min Tempo di ribollimento; questo può essere ottenuto con l'immissione di una estremità dell'ago 20 G che è stato attenuato alla fine del tubo in modo da dirigere il flusso d'aria in modo appropriato. Inoltre, il tempo supplementare per questo passaggio non farà male fino a quando il flusso d'aria non è così potente da traboccare la soluzione nel tubo. Titolazione cellulare è un altro componente fondamentale che avrà la pratica. La maggior parte delle cellule può essere danneggiato se titolata eccessivamente; viceversa, se la titolazione non è sufficiente, ci saranno pochissime cellule isolate singole dissociate dai tessuti. Per titolare efficacemente, utilizzare una punta di pipetta 200 microlitri di pipettare su e giù 7-8x, assicurandosi che le ghiandole vengono delicatamente passati attraverso la punta della pipetta 200 microlitri come titolare.
Per il rivestimento PDL, si può sempre prolungare il tempo di incubazione del Pdl sulle coprioggetto fino a 3 ore per garantire rivestimento sufficiente di coprioggetto. Il rivestimento Pdl è fondamentale per cellule cromaffini da allegarea crescere e sui vetrini dopo placcatura cellulare. Se il rivestimento PDL non è sufficiente, la maggior parte delle cellule saranno staccare dal coprioggetti, che renderà la formazione sigillo gigaohm difficile.
Registrazioni cellulari iscritti possono sempre essere modificati e migliorati, come la tecnica di patch è un processo dedicato. Aspirazione delicata e sottile è fondamentale nel facilitare la formazione sigillo gigaohm quando la pipetta di patch e cellulare sono in contatto. Troppo aspirazione distruggerà la zona di contatto punta-cellulare e in situazioni estreme, le celle possono essere risucchiato nella pipetta di patch. Questo sarà molto facilmente osservata sull'oscilloscopio cambiando in una configurazione a cellule intere o da una resistenza molto minimale ritorno a uno molto grande; pratica è della massima importanza per ottenere una qualità elevata formazione sigillo gigaohm.
Mentre ad alta resistenza di tenuta è fondamentale per ridurre al minimo il livello di rumore nelle registrazioni delle cellule-allegato, le seguenti due passaggi sono ancheimportante per ridurre il livello di rumore di risolvere eventi endocitiche singoli: (1) Nella soluzione cerotto pipetta, TEACL viene utilizzato per bloccare i canali K + voltaggio-dipendenti; (2) la punta della pipetta è rivestita con cera collante e la cera all'interno della punta della pipetta può essere rimosso mediante lucidatura calore.
Mentre la regolazione della fase dettagliato nel Protocollo passo 6.2 è fondamentale per impostare la fase iniziale per la registrazione, questo passaggio potrebbe non essere l'ideale. Pertanto, è importante eseguire la correzione di fase durante l'analisi fissione-pori per i singoli eventi. Ad un potenziale di membrana di riposo di -65 mV, registrazioni a cellule intere dimostrare che una cella cromaffini tipica mouse ha una capacità di ingresso di 5 pF e una resistenza d'ingresso di 500 MW, che calcola la conduttanza di membrana delle cellule cromaffini topo come ~ 0,4 pS / fF. Ciò implica che un evento endocitica con una dimensione capacità di 1 FF si tradurrà in una perdita netta di membrana conduttanza di ~ 0,4 pS. Questo valore è trascurabile rispetto aypical 50-100 pS sostituzione della membrana conduttanza associata con endocitica chiusura a fissione-pori in registrazioni cellulari-attached. Pertanto, siamo fiduciosi che la nostra correzione di fase ci permette di regolare la linea di base della membrana conduttanza tale che la chiusura pre e post fissione-poro è allo stesso livello; questo processo può portare <1% di errore nella nostra analisi dei dati.
In sintesi, il protocollo qui descritto dimostra come le registrazioni di capacità di cella-attached possono essere utilizzati per monitorare singolo endocitosi delle vescicole usando cellule cromaffini del mouse come sistema modello. Questa tecnica permette di analizzare i meccanismi normativi per vescicola fissione durante endocitosi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
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