Introduction
La transmisión sináptica es mediada por exocitosis de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores, y estas vesículas debe someterse a endocítica reciclado local dentro de la terminal nerviosa para mantener la comunicación neuronal en el largo plazo. Dado el papel esencial de la transmisión sináptica en el cerebro, la comprensión de la maquinaria molecular que constituye el ciclo de la vesícula sináptica es una base esencial para lograr una mejor comprensión en la comunicación celular en su conjunto. Entre los sistemas modelo de célula, la célula cromafines adrenales ha proporcionado algunas de la visión más definitivo en la maquinaria molecular subyacente de reciclado de vesículas sinápticas. La exocitosis, el paso final en la liberación de neurotransmisores, se ha estudiado y se examinaron mediante el uso de la célula cromafines adrenales 1,2 inmensamente. De hecho, la mayoría de los jugadores moleculares que orquestan la formación, la orientación, soporte, y la fusión de los gránulos secretores han sido identificados debido a la aplicación de divtécnicas ERSE en células cromafines 1. Además, al proporcionar una oportunidad para permitir la resolución de una sola vesícula de la maquinaria de proteína implicada en la exocitosis, la cromafín sigue siendo un modelo de gran alcance para hacer frente a las cuestiones de la fusión de vesículas 3.
Mediciones de capacitancia de célula-adjunta se utilizaron primero en la solución de fusión de una sola vesícula durante la exocitosis 3. Exocitosis de vesículas tan pequeñas como ~ 60 nm de diámetro se ha demostrado que puede detectar mediante mediciones de admisión de la membrana celular con la técnica de patch clamp en la configuración de células vinculada 4-7. De admisión se define como una medida de la facilidad con que un circuito o dispositivo permitirá que fluya una corriente; es la inversa de la impedancia. Por lo tanto, las mediciones de admitancia proporcionan una comprensión de la capacitancia de la membrana. Esto se logra mediante la incorporación de la membrana vesicular en la membrana plasmática; esta incorporación revela cambios en la superficiezona 8. Cada vesícula fusión causa un aumento gradual en 9,10 capacitancia de la membrana. Además, esta medida admisión proporciona la conductancia de la membrana y la conductancia poro de fusión durante un evento de exocitosis 3. Como esta técnica ha proporcionado una herramienta única en la identificación de la cinética de una sola vesícula durante la exocitosis, nuestro laboratorio ha aplicado recientemente este concepto para detectar la endocitosis de vesículas individuales 11,12.
Nuestro interés específico es mediada por clatrina endocitosis (CME), que ha sido considerada como un componente fundamental de limpieza en muchas células y 13 como una vía principal para la endocitosis de las vesículas sinápticas en los terminales neuronales 14,15. CME es conocido por ser biológicamente importante, sin embargo, su cinética no quedan bien entendidos debido a limitaciones técnicas en el seguimiento de eventos endocíticas singulares. Dadas las similitudes en los mecanismos exocytic entre las células cromafines y neuronas 1, es plausible que los mecanismos de fisión en células cromafines pueden aplicar probablemente a la endocitosis de vesículas sinápticas en las neuronas. Las mediciones de capacitancia de célula-adjunto se han utilizado para controlar los eventos de endocítica individuales y analizar la cinética de fisión, que la mayoría de los métodos son incapaces de resolver. En nuestras grabaciones celulares inscritos, una onda sinusoidal a 20 kHz se superpone sobre el potencial de mantenimiento, y la corriente de salida se separa en la conductancia de la membrana en un canal y la membrana capacitancia en el otro canal de dos fases amplificador lock-in de 16 18. A partir de los cambios en la conductancia de la membrana y la capacitancia, se puede calcular la cinética de la fisión de poros, que probablemente corresponde a la membrana tubular cuello que conecta la vesícula internalización a la membrana plasmática antes de la vesícula de pinzamiento. En conjunto, esta técnica nos da la oportunidad de examinar los mecanismos de regulación de la fisión de vesículas durante CME.
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Protocol
NOTA: Todo el procedimiento se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. Soluciones y Medios de Cultivo Preparados
- Mantenga todas las soluciones a -20 ° C durante un máximo de seis meses. Mantenga los medios de cultivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
- Preparar 100 ml de medio de cultivo mediante la mezcla de 1 ml de solución-pen estreptocócica y 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selenio-suplementación) a 100 ml con DMEM.
- Preparar la solución de enzima mediante la mezcla de 250 ml de DMEM, 2,5 ml de 100 mM CaCl 2, y 2,5 ml de EDTA 50 mM.
- Prepare la solución de inactivación mediante la mezcla de 225 ml de DMEM, 25 ml de FBS, 625 mg de albúmina, y 625 mg de inhibidor de tripsina.
- Preparar la solución de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM de glucosa de un Locke. Ajustar el pH a 7,3 con NaOH.
- Preparar una solución de poli-D-lisina (PDL) de 50 mg / ml. Utilice una concentración final de 1 mg / ml a cubreobjetos capa.
- Preparar una solución extracelular de NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de HEPES-NaOH, y glucosa 10 mM. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH con una osmolaridad de ~ 310 nmol / kg.
- Preparar una solución de la pipeta de NaCl 50 mM, TEACl 100, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM HEPES. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH con una osmolaridad de ~ 290 nmol / kg.
2. glándula suprarrenal Aislamiento
- Autoclave un par de grandes y pequeñas tijeras de disección y dos pares de pinzas. Use guantes durante todo el proceso y coloque la bandeja de disección en un cubo de hielo.
- Utilice los ratones tomadas en el día 0-3. La eutanasia a los animales con un tanque presurizado CO 2 seguido por decapitación.
- Utilizar el más pequeño conjunto de tijeras para cortar por la parte posterior del cachorro después de la columna vertebral de Cervi cal a caudal región. Asegúrese de cortar superficialmente bajo la piel y no penetrar en la cavidad del cuerpo.
- A continuación, exfoliación de la piel lejos de la columna vertebral de modo que la musculatura está expuesto a tener una visión clara de la columna vertebral. A partir de aquí, hacer un corte transeccional en la médula espinal cervical y luego hacer dos cortes paralelos a lo largo de los lados de la columna vertebral.
- Con un par de pinzas que sujetan el cuerpo principal del animal, utilice el otro par de pinzas para agarrar la columna vertebral y pelar la columna vertebral hasta los riñones están expuestos.
- En este momento, visualizar las glándulas suprarrenales en la parte superior de los riñones. A continuación, coloque cuidadosamente las dos glándulas de cada animal en un tubo cónico lleno de solución de Locke.
NOTA: A veces, las glándulas se apegará a los fórceps. Si este es el caso, utilice suavemente otro par de fórceps para ayudar en la eliminación de las glándulas de las pinzas y en la solución de Locke. Las glándulas se pueden mantener en esta condición para un máximo de 2 horas.
- Mientras tanto, burbuja de la solución de enzima con 5% de CO 2 + 95% de O 2 durante 15 min antes de su uso. Asegúrese de que la solución equilibrada pasa de un color rosa brillante en color rosado / naranja.
- Añadir la papaína a la solución de enzima recién burbujeó a una concentración final de 20-25 unidades / ml. Incubar cada par de glándulas de cada animal para 40-60 min a 37 ° C en la solución de enzima con papaína.
- Añadir 75% de solución de inactivación a cada tubo y se incuba a 37 ° C durante otros 10 min. Esta incubación inactiva la actividad de la enzima de la papaína.
- Después de la incubación de 10 min con la solución de inactivación, transferir suavemente las glándulas en un tubo recién marcado y luego se lavan las glándulas 3x con medios de cultivo.
4. Disociación Celular y Plating
- Después del lavado, colocar las dos glándulas en 200 l de los medios de cultivo y a continuación, valorar con cuidado las glándulas yabajo a través de la punta de pipeta con una pipeta de 200 l hasta que ya no hay un gran trozo de tejido en la solución.
NOTA: Cuando se titulan, mantener glándulas en la parte inferior del tubo con una fuerza hacia abajo desde la punta de la pipeta 200 l y enganchar el tejido suave y lentamente. Asegúrese de utilizar, trazos continuos lentos, nunca pipeteo rápido o abrupto. - Añadir un medio de cultivo de 250 l adicional para llevar el volumen total de medios de cultivo de hasta 450 l.
- Placa de 60 l de esta solución que contiene células en cada uno de siete 12 mm cubreobjetos PDL-pre-recubiertas, que se colocan en una placa de cultivo de 60 x 15 mm.
- Una vez plateado, colocar la cápsula en la incubadora que se ajusta a 37 ° C y se mantuvo con un flujo / suministro constante de 5% de CO 2 durante 30 min para asegurar un entorno para la viabilidad celular. Después de la incubación, añadir con cuidado 5 ml de medios de cultivo pre-calentado en la placa de cultivo y devolver el plato de nuevo en la incubadora durante 24 horas antes de la célula-agregadograbaciones d.
NOTA: Normalmente, las células se pueden utilizar para los registros electrofisiológicos para un máximo de 4 días.
5. Cell Identificación y gigaohmio Seal Formación
- Coloque el cubreobjetos de 12 mm en la solución extracelular. Desde el conjunto de glándulas suprarrenales se utilizan para la preparación de células, mezclar las células cromafines (típicamente muy brillantes con un marrón / coloración beige y una forma circular casi perfecta (Figura 1) en cultivo con células corticales (más pequeños y más débiles que las células cromafines).
- Tire de las pipetas de parche en cuatro etapas, utilizando una programable P-97 extractor. Sumerja la punta de la pipeta en una cera derretida, lo que ayudará a reducir la capacitancia de la copa y luego disparar el pulimento de la punta a "soplar-away" esta cera desde el interior de la punta de la pipeta.
NOTA: Cuando se llena con una solución de parche pipeta, pipetas de parche suelen tener una resistencia de ~ 2 mW. - Acérquese al parche pipeta cerca de la célula dentro de varios microns. Para lograr una configuración de célula-adjunto, buscar cualquier deformación celular ligero durante la aproximación de la pipeta de parche más cerca de la célula. Aplicar una suave succión hasta que se logre un sello GΩ.
6. Grabaciones capacitancia celular-Attached
- Una vez que un sello GΩ se revela, hacer grabaciones de células-unido a través de la utilización de un amplificador EPC-7 además de patch-clamp y un amplificador lock-in analógico de dos fases (ver tabla adjunta de equipos). Aplicar una onda sinusoidal con una amplitud de 50 mV (rms) y la frecuencia de 20 kHz desde el amplificador lock-in.
- Ajuste el filtro de salida del amplificador lock-in 1 constante de tiempo ms y 24 db. Ajuste la fase del amplificador lock-in de tal manera que los cambios de capacitancia transitorios producidos por pulsos suave succión sólo aparecen en la traza capacitancia parche (Im) sin proyección en la traza de la conductancia parche (Re) (Figura 2).
NOTA: Por favor, vea los detalles para la calibración del sistema de reConferencia 19. - Identificar los cambios de capacitancia típicos por pasos "hacia abajo" (Figura 3).
NOTA: Una grabación sólida será visto como una "escalera" de tipo parecido con muchos pasos a la baja, lo que indica la internalización de las vesículas individuales. El proceso de actualización sirve como estimulación mecánica ya la acción actual puede ser típicamente registra en la mayoría de las células. - Nombre los archivos como carpetas individuales, incluyendo la fecha: mm / dd / año y cada grabación de células-que se adjunta como su propia numeración individuo (xx) dentro de ese archivo.
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Representative Results
La viabilidad celular y la calidad del sello gigaohmio son críticos en la determinación de la calidad de las grabaciones capacitancia de célula-adjunto. Por lo tanto, es fundamental procurar un cultivo celular eficaz y eficiente antes de registros electrofisiológicos y células viables típicos se ilustran en la Figura 1. Práctica y la hora serán útiles en la consecución de un sello gigaohmio con alta calidad. Si uno puede ver claramente la deformación celular cuando la pipeta parche está acercando a la célula como se describe en el protocolo de la Etapa 5.3, hay una mejor oportunidad en la obtención de un sello de alta calidad. La Figura 3 muestra un registro típico de capacitancia de la membrana hacia abajo con múltiples pasos asociados con solo endocitosis de vesículas.
Figura 1. Ejemplos de células cromafines adrenales viable ratón24 horas después del cultivo celular. Flechas punto a 3 células cromafines viables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. ajuste de fase en las grabaciones de células inscritos. Con la configuración de fase inicial, succiones suaves causan cambios transitorios en tanto capacitancia (Im) y conductancia (Re), los rastros y las proyecciones en Re rastro se cancelan por una fase de 23 ° cambiar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 A c típicocapacitancia ell unida-grabando con varios pasos a la baja, asociados con solo endocitosis de vesículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mediciones de capacitancia celular conectado requieren varios pasos críticos a fin de recabar las grabaciones de alta calidad: 1) células viables y saludables preparados a partir de las glándulas suprarrenales; 2) recubrimiento PDL de los cubreobjetos; 3) la formación de sello gigaohmio; 4) nivel de ruido del sistema; y 5) de corrección de fase.
Para la cirugía animal, modificaciones potencialmente uno puede hacer es ajustar el abordaje quirúrgico de la mejor destreza traje y para evitar cualquier daño durante la disección. Además, la práctica suficiente sobre la localización y la eliminación de las glándulas suprarrenales es imperativo como células que se utilizarán para las grabaciones electrofisiológicas proceden exclusivamente de la médula de la glándula suprarrenal. Para la digestión de la enzima, es crítico para equilibrar la solución de enzima por burbujeo de la solución con 5% de CO 2 + 95% de O 2. Asegúrese de que el tubo conectado al cilindro es suficiente y ajustado sin fugas. Además, asegúrese de que el extremo isolución de n está correctamente colocado durante todo el tiempo de burbujeo 15 min; esto se puede lograr con la colocación de un extremo de la aguja 20 G que ha sido mitigado en el extremo de la tubería para dirigir el flujo de aire adecuadamente. Además, el tiempo adicional para este paso no hará daño siempre y cuando el flujo de aire no es tan poderoso como para desbordar la solución en el tubo. Titulación celular es otro componente crítico que se llevará a la práctica. La mayoría de las células se puede dañar si se valora sobre-; por el contrario, si la titulación no es suficiente, habrá muy pocas células aisladas individuales disociados de los tejidos. Para valorar efectivamente, utilizar una punta de pipeta 200 l pipetear arriba y abajo 7-8x, asegurándose de que las glándulas se pasan suavemente a través de la punta de pipeta de 200 l como titra.
Para el revestimiento PDL, siempre se puede extender el tiempo de incubación de la PDL en los cubreobjetos hasta 3 horas para asegurar el revestimiento suficiente de cubreobjetos. El recubrimiento PDL es crítico para las células cromafines para adjuntaray crece en los cubreobjetos después de placas de células. Si recubrimiento PDL no es suficiente, la mayoría de las células se desprenden de la cubreobjetos, lo que hará que la formación del sello gigaohmio difícil.
Grabaciones celulares conectado siempre pueden ser modificadas y mejoradas, como la técnica de aplicación de parches es un proceso dedicado. Succión suave y sutil es fundamental para facilitar la formación del sello gigaohmio cuando el parche pipeta y de la célula están en contacto. Demasiada succión destruirá el contacto de parches de células punta y en situaciones extremas, las células pueden ser absorbidos por el parche pipeta. Esto se observa muy fácilmente en el osciloscopio mediante el cambio en una configuración de célula completa o por una resistencia muy mínima de regresar a uno muy grande; la práctica es de suma importancia para obtener una formación sello gigaohmio alta calidad.
Mientras que la resistencia alta sello es crítico para minimizar el nivel de ruido en las grabaciones de células inscrito, los dos pasos siguientes son tambiénimportante para reducir el nivel de ruido para resolver eventos endocíticas individuales: (1) En la solución de la pipeta parche, TEACl se utiliza para bloquear canales de K + dependientes de voltaje; (2) la punta de pipeta se recubre con cera pegajosa y la cera dentro de la punta de la pipeta puede ser eliminado por pulido de calor.
Mientras que el ajuste de fase se detalla en el Protocolo de paso 6,2 es crítico para configurar la fase inicial de la grabación, este paso no puede ser ideal. Por lo tanto, es importante llevar a cabo corrección de fase durante el análisis de la fisión de poro para los eventos individuales. A un potencial de membrana en reposo de -65 mV, grabaciones de células enteras demostrar que una célula cromafines ratón típico tiene una capacitancia de entrada de 5 pF y una resistencia de entrada de 500 mW, que calcula la conductancia de la membrana de las células cromafines de ratón como ~ 0,4 pS / fF. Esto implica que un evento endocítica con un tamaño capacitancia de 1 fF se traducirá en una pérdida neta de conductancia de la membrana de ~ 0,4 pS. Este valor es insignificante en comparación a por loypical 50-100 pS cambio conductancia de la membrana asociada con cierre de fisión de poro endocítica en las grabaciones de células-adjunto. Por lo tanto, estamos seguros de que nuestra corrección de fase nos permite ajustar la línea de base de conductancia de la membrana de tal manera que el cierre de pre y post-fisión de poro está en el mismo nivel; este proceso puede traer <1% de error en el análisis de datos.
En resumen, el protocolo aquí descrito demuestra cómo grabaciones capacitancia de célula-adjunta se pueden utilizar para supervisar sola endocitosis de vesículas usando células cromafines de ratón como sistema modelo. Esta técnica permite analizar los mecanismos de regulación de la fisión de la vesícula durante la endocitosis.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
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