Summary
I denne artikel beskrives metoder til syntese og fluorescerende mærkning af nanopartikler (NP'er). NPS blev anvendt i puls-chase forsøg at mærke endo-lysosomale system eukaryote celler. Manipulation af endo-lysosomale system ved aktiviteter af den intracellulære patogen Salmonella enterica blev fulgt af levende celler og kvantificeret.
Abstract
Fluorescerende nanopartikler (NPS) med ønskelig kemiske, optiske og mekaniske egenskaber er lovende redskaber at mærke intracellulære organeller. Her indfører vi en fremgangsmåde ved hjælp af guld-BSA-rhodamin NP'er at mærke endo-lysosomale system eukaryote celler og overvåge manipulationer af værten cellulære veje af intracellulært patogen Salmonella enterica. NPS blev let internaliseret af HeLa-celler og lokaliseret i sene endosomer / lysosomer. Salmonella infektion fremkaldt omlægning af vesiklerne og akkumulering af nationale parlamenter i Salmonella- induceret membranstrukturer. Vi implementerede Imaris software pakke til kvantitative analyser af konfokal mikroskopi billeder. Antallet af objekter og deres størrelsesfordeling i ikke-inficerede celler var forskellige fra dem i Salmonella -inficerede celler, hvilket indikerer meget ombygning af endo-lysosomale system ved WT Salmonella.
Introduction
Fluorescerende nanopartikler (NPS), herunder metal NP'er, kvantepunkter, polymer NP'er, silica NP'er, carbon prikker osv har stor opmærksomhed i de seneste årtier 1,2. Sammenlignet med traditionelle organiske farvestoffer, fluorescerende NP'er viser ønskelige kemiske, optiske og mekaniske egenskaber, såsom stærkt signal styrke, modstandsdygtighed over for fotoblegning og høj biokompatibilitet 3,4. Disse fordele gør dem til foretrukne metode til intracellulær detektering og levende celler billeddannelse. Endvidere en række elektron-tætte NP'er er synlige ved elektronmikroskopi (EM), hvilket letter deres anvendelse til korreleret mikroskopisk analyse, som tillader kombination af levende celler sporing med lysmikroskopi (LM) og højere opløsning på ultrastrukturelle niveau med EM 5. For eksempel har guld NP'er været lang tid effektivt anvendes som biosensorer i levende celler til følsom diagnose samt inden for immuno-mærkning 6. Seneste studies indikerer, at guld NP'er med forskellig størrelse og form kan være let optagelse af en lang række cellelinier og rutinemæssigt transport gennem den endosomale pathway, har derfor stort potentiale nu anvendes til intracellulær vesikel transport sporing og endo-lysosomale mærkningsordning 7,8 .
Mikrobielle patogener, såsom Salmonella enterica, Shigella flexneri og Listeria monocytogenes, har udviklet forskellige mekanismer til at invadere ikke-fagocytiske værtsceller 9. Efter at være blevet internaliseret, patogener, enten lokaliseret i cytosolen eller afsondret i membranbundne rum, samspil med deres værtsmiljøer og modulerer disse til at favorisere deres egen overlevelse 10. For eksempel Salmonella enterica bosat og replikerer i en intracellulær phagosomal rum kaldes Salmonella holdige vacuole (SCV) efter infektion 11. Den modning SCVtrafikker mod Golgi-apparatet, undergår kontinuerlige interaktioner med endocytiske proces, og inducerer dannelse af omfattende rørformede strukturer, såsom Salmonella -inducerede filamenter (SIF), sortering nexin tubuli, Salmonella induceret sekretorisk carrier membran protein 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Studer hvordan disse bakterielle patogener manipulere vært-celle veje er afgørende for forståelsen infektionssygdom.
Her blev guld-BSA-rhodamin NP'er anvendes som flydende sporstoffer til mærkning værten cellulære endo-lysosomal system og den humane mave patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) blev anvendt som en model bakterie at studere vekselvirkninger patogenet med vært endocytiske pathway. Intracellulære guld-BSA-rhodamin nationale parlamenter i ikke-inficerede celler og celler inficeret med WT Salmonella eller mutantstammer blev afbildet med en konfokal laser-scanning mikroskop (CLSM).Derefter Imaris software blev anvendt til at kvantificere fordelingen af NP'er, hvilket indikerer, at Salmonella infektion induceret ekstrem omlejring af endosomer / lysosomer. Efter beskrivelse af denne metode, kan analoge eksperimenter designet til at spore langsigtet skæbne internaliserede NPs og til at undersøge indflydelsen af forskellige eksogene stoffer eller endogene faktorer på endocytiske pathway af eukaryote celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af 10 nm Gold Nanopartikler (Gold NP'er) 15
- Forbered løsning A: tilsættes 2 ml 1% vandig guld chlorid i 160 ml Milli-Q, eller dobbelt destilleret vand.
- Forbered opløsning B: tilsæt 8 ml 1% tri-natriumcitrat x 2 H2O og 160 pi 1% garvesyre i 32 ml Milli-Q eller dobbelt destilleret vand.
- Varm op opløsning A og B til 60 ° C og blande dem under omrøring. Overhold en mørk blå farve med det samme. Observer rød farve efter ca. 15 minutter. Derefter opvarmes til 95 ° C, holde 5 min, og opløsningen afkøles til stuetemperatur.
- Tilføj en dråbe af NP suspensionen på en carbon belagt gitter og lad det tørre i luften. Kontroller størrelse og morfologi af nationale parlamenter ved transmission elektronmikroskopi.
2. Belægning af Gold NP'er med BSA og mærkning med Rhodamin N-hydroxysuccinimidylester (NHS) 16
- Tilføj 900 pi guld NP'er i et 1,5 ml Eppendorf-rør, centrifugeres ved 15.000 xg i 30 min. Opnalt, forberede flere rør kan på én gang.
- Supernatanten fjernes, re-suspendere pellet i 900 pi steriliseret Milli-Q-vand, og der tilsættes 100 pi 2 mg / ml BSA / PBS, blandes på en Vortex ved 800 rpm i 30 min.
- For at fjerne overskydende BSA, centrifugeres præparatet ved 15.000 xg i 60 min.
- Supernatanten fjernes, og re-suspendere guld-BSA nationale parlamenter i 125 pi PBS, tilsættes 12,5 pi 1 M bicarbonat.
- Umiddelbart før brug forberede en opløsning af rhodamin NHS / DMSO 10 mg / ml, tilsættes 30 pi rhodamin NHS / DMSO-opløsning til 1 ml af det guld-BSA NP'er suspension. Inkubér reaktionen i 2 timer (eller O / N) ved stuetemperatur i løbet af 800 rpm opblanding undgå udsættelse for lys.
- Rense guld-BSA-rhodamin nationale parlamenter gennem dialyse mod PBS ved 4 ºC med 5 buffer ændringer over perioden 36-48 timer.
- For at stabilisere NP'er tilsættes 10 pi 200 mg / ml BSA / PBS i hver 1 ml guld-BSA-rhodamin NP'er. For at fjerne gratis eller frigivet BSA-rhodamin, centrifuge ved 15,000 xg i 60 min. Pellet resuspenderes i 2 mg / ml BSA / PBS, måle OD 520, og opbevares ved 4 ° C, undgå udsættelse for lys.
- Fortynd NPS 10 gange med Milli-Q eller dobbelt destilleret vand, tilsæt en dråbe på en carbon-belagt gitter, og lad det tørre i luften. Check størrelse og morfologi nationale parlamenter ved transmission elektron mikroskopi (TEM).
BEMÆRK: Alle materialer, der anvendes til NP forberedelse blev steriliseret, og operationen blev gennemført i en cellekultur hætte eller på en bænk ved siden af en flamme.
3. Kultur af HeLa-celler
- HeLa-celler permanent udtrykker LAMP1-GFP er dyrket i DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS) og dyrket ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO2.
- Seed cellerne ved en densitet på 50.000 per brønd i en 8-brønds kammer slide (Ibidi) og inkuber O / N.
4. Kultur Bacteria
- Brug Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) stamme. Til sammenligning bruger mutantstammer Δ ssaV defekte i SPI2-T3SS og Δ Sifa mangler nøgle effektor Sifa for SIF. Brug stammer der indeholder plasmid pFPV25.1 for konstitutiv ekspression af et forstærket GFP.
BEMÆRK: Bakterielle stammer dyrkes rutinemæssigt i Luria-Bertani-bouillon (LB) med tilsætning af 50 ug / ml carbenicillin (WT) og LB med tilsætning af 50 ug / ml carbenicillin og / eller 50 pg / ml kanamycin (Δ ssaV, Δ Sifa ) af nødvendig for at opretholde plasmider. - Podes en enkelt koloni af bakterier i 3 ml LB med passende antibiotika og vokse O / N på 37 ºC under rystende forhold til beluftning, så fortynde 1:31 i frisk LB og fortsætte væksten i 3,5 timer. På dette tidspunkt-punkt kulturerne nå den sene log-fase og bakterier er meget invasiv. En "rulle tromme 'er praktisk at inkubere reagensglas kulturer med beluftning.
5. Infektion af HeLa-celler vedSalmonella og Guld-BSA-rhodamin NP'er Pulse Chase-mærkning (se figur 1 for ordning)
- Mål OD 600 af sub-dyrket bakterier og fortyndes til OD600 = 0,2 i 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml), tilsættes passende mængder af bakterier til HeLa-celler i 8 brønde kammer slides for at opnå en flerhed af infektion (MOI) på 100.
- Inkuber i 30 minutter i cellen inkubator, vaskes 3 gange med PBS for at fjerne ikke-internaliserede bakterier (dette tidspunkt blev angivet som 0 timer efter infektion, eller 0 timer pi). Tilføj 300 pi frisk dyrkningsmedium indeholdende 100 ug / ml gentamicin og vedligeholde i 1 time. Derefter udskiftes mediet med frisk medium indeholdende 10 ug / ml gentamicin for resten af inkubationstiden.
- Efter inkubation med dyrkningsmedium indeholdende 100 ug / ml gentamicin i 1 time, mediet erstattes med billeddannende medium (Eagles MEM uden FCS, L-glutamin, phenolrødt og natriumbicarbonat, med 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml gentamicin. Guld-BSA-rhodamin NP'er tilsættes til HeLa-celler til opnåelse af en slutkoncentration på OD 520 = 0,1.
BEMÆRK: Guld-BSA-rhodamin NP'er kan også tilsættes til celler før infektion eller på forskellige tidspunkter pi - Efter 1 times inkubation fjernes mediet, vaskes 3 gange med PBS, og der tilsættes 300 pi frisk billeddannende medium indeholdende 10% FCS og 10 ug / ml gentamicin for resten af inkubationstiden.
BEMÆRK: inkubationstiden kan variere afhængig af koncentrationen NPS og cellelinier anvendes. For RAW264.7 makrofager, bemærkede vi, at 30 minutters inkubation med nationale parlamenter i en koncentration på OD 520 = 0,05 tilladt tilstrækkelig internalisering.
6. Imaging
- Brug en konfokal billeddannelse såsom en konfokal laser-scanning (CLSM) eller rotationsskive (SD) mikroskop med et fugtigt miljø kammer til høj opløsning billeddannelse på forskellige tidspunkter.
- Tænd for temperaturen control systemet og vente, indtil det er stabilt. Optimer de billeddannende indstillinger som forstørrelse, scanning hastighed, opløsning, Z-stack osv Brug passende indstillinger excitation / emission for GFP og guld-BSA-rhodamin NP'er. Til denne protokol, skal du bruge en 400 Hz scanning hastighed, opløsning på 512 x 512 pixels og Z-trins størrelse på 0,25 um. Excite GFP og guld-BSA-rhodamin ved anvendelse af en Ar-laser (488 nm) og en HeNe laser (543 nm) hhv. Inkluderer en lys-felt (BF) kanal til at observere formen af cellerne. For andre mikroskopi systemer og infektion betingelser, indstillingen justeres i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Brug den samme Ar laser som lyskilde til BF kanal og signal blev påvist med et foto multiplikator (PMT) detektor. - Ved angivne tidspunkter pi, montere 8 brønde kammer slides indeholder inficerede celler på mikroskopbordet og optage billeder.
7. Analyse af billeder
- Brug mikroskopi billedanalyse software (se
BEMÆRK: Alternativt kan open source software-pakker som ImageJ eller FIJI anvendes til kvantitativ billede analyser. - I objekter værktøjslinjen i Overgå visningen på ikonet
at tilføje en ny overflade element. Klik på 
(Næste). - At analysere et område af interesse (ROI), skal du vælge segment en ROI. I et visningsområde, er et rektangel-omkranset sektion overlejret på billedet repræsenterer ROI. Indtast værdierne i den tilsvarende x-, y- og z- marker, eller direkte klikke på pilene i preview rektangel for at ændre størrelse og placering af ROI. Klik derefter på
= "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (næste).
- Som en kilde kanal ved at vælge kanal 3 (signal for Gold-BSA-Rhodamin NP'er). Tjek den glatte mulighed for at oprette glathed af den resulterende område. Definer en værdi manuelt eller acceptere den automatisk genererede værdi. For Threshold, vælg Absolut Intensity mulighed.
- For justering tærskel, skal du vælge den manuelle indstilling, og angive en værdi. I visningsområdet, er en overflade tærskel forhåndsvisning vises i grå.
- På fanen Klassificere Overflader den resulterende overflade kan filtreres efter forskellige kriterier. En standard filter er »antal voxels> 10", og andre filtre kan også inkluderes ved at klikke på 'Tilføj'. Hvis en filtrering ikke er nødvendigt, og slet derefter alle filtre ved at klikke på knappen Slet. Klik (Næste).
- For at fuldføre Surface skabelse, skal du klikke på/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). På listen Object, nu un-markere feltet for elementet Volumen og ny skabte overflade vises i visningsområdet.
- Eksporter statistikkerne. Nu, i Overgå opfattelse farven på de emner varierer fra violet til rød efter deres område. Og den "Plot Numbers område« tabel viser statistikken oplysninger (f.eks, ID-nummer og området for genstande). Eksporter alle statistikker på overfladen 1 til en Excel-fil ved at klikke
(Gem).
at tilføje en ny overflade element. Klik på 
(Næste). 
(Gem). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Guld NP'er blev genereret gennem et veletableret metode via reduktion af chlorguldsyre ved citrat og garvesyre. Som vist i figur 2A, de syntetiserede guld NP var kvasi-sfærisk form med en størrelse på ca. 10 nm. BSA-belægning og rhodamin-mærkning påvirkede ikke deres morfologi eller størrelse (figur 2B).
Det er blevet rapporteret, at guld NP'er kan let tages op af forskellige pattedyrceller og endte i de endocytiske systemer 7. I overensstemmelse med tidligere værker blev lyse røde fluorescenssignaler observeret i HeLa-celler efter 1 times inkubation med guld-BSA-rhodamin NP'er (Figur 3, WT 5 hr pi), hvilket indikerer en effektiv internalisering af NPS af cellerne. De fleste af de røde signaler blev fundet colocalized med grønne signaler, der viser, at de nationale parlamenter var begrænset i sene endosomer eller lysosomer. Men i modsætning til ensartet fordeling af NP'er i sene endosomer / lysosomeri ikke-inficerede celler (Figur 3, mock), blev deres placeringer stort set omarrangeret i WT Salmonella -inficerede celler. I den tidlige fase af infektion (figur 3, WT 5 timer pi), Salmonella replikerer i SCV og SIF undergår hurtig udvidelse eller sammentrækning bevægelse. På dette tidspunkt blev en del af NPS fundet i SCV og SIF, mens en anden del stadig var placeret i frie sene endosomer / lysosomer. Ved 8 timer pi (figur 3, WT 8 timer pi), en stabiliseret netværk af SIF blev dannet, og de fleste NP blev fundet akkumuleret inden for de rørformede strukturer, mens kun en meget lille del forblev placeret i gratis sen endosomer / lysosomer. De mutantstammerne Δ ssaV og Δ Sifa udstillet forskellige adfærd. Som vist i figur 3 (Δ ssaV) ved 8 timer pi blev Δ ssaV afgrænset af SCV mens ingen SIF strukturer blev dannet. Nogle NP'er blev observeret omkring Salmonella inde i SCV, men flertallet af de nationale parlamenter stadig placeret i frie sene endosomer / lysosomer. For Δ Sifa stammen (figur 3, Δ Sifa), udslip af Salmonella i cytoplasma opstod, og ingen sammenhæng mellem nationale parlamenter og bakterier blev observeret.
Det var i vores tidligere undersøgelse viste, at SIF display meget dynamiske egenskaber i den tidlige fase af infektion (3 - 5 timer pi), men bliver stabiliseret i den senere periode (> 8 t pi) 12. Derfor er vi spekulerer på, om salmonella i tidlige og sene faser af infektion sammenlignelig evne til at omarrangere distribution af intracellulære NP'er. Som vist i figur 4, blev guld NP'er inkuberet med HeLa-celler O / N før infektion, eller på forskellige tidspunkter efter infektion (1 - 7 timer pi) i 1 time, i alle tilfælde de fleste af de internaliserede NP'er blev observeret akkumuleret i SCV eller SIF.
Mikroskopisk observtioner viste, at infektion med Salmonella resulterer i massiv omlægning af endo-lysosomale system værtsceller. Som et næste skridt, vi brugte Imaris softwarepakke til at analysere Salmonella induceret vært cellefænotyper på en kvantitativ måde. Ved hjælp af billedet af en inficeret HeLa celle på 8 timer pi som et eksempel, er en trin-for-trin instruktion for kvantitativ analyse afbildet i figur 5. Gennem en intensitet tærskel på 15 og en »række voxels> 10 'filter, 3D genstande blev ekstraheret fra den oprindelige billedfil. Objekterne skulle være intracellulære strukturer, hvor guld-BSA-rhodamine NP'er placeret med. I dette eksempel blev 67 objekter ekstraheret i alt, med en summeret område som 1,974.64 pm2. Den største genstand, der colocalized med SIF netværket, har et areal på 1,836.23 um 2, mens de andre er mindre end 50 um 2. Til sammenligning, et eksempel viser quantitative analyseresultat af en ikke-inficeret celle blev givet i. Her blev 431 objekter ekstraheret i alt, inden for hvilket den gennemsnitlige værdi af området er 5 um 2 og den største genstand har et areal på 34 um 2. Den opsummerede område af objekterne er 2.252 um 2, som er sammenlignelig med den inficerede celle i figur 4 (1,975 um 2). Men antallet af objekter er meget større end den anden (431 og 67 genstande, henholdsvis), hvilket indikerer stor udstrækning fusion af vesikler med Salmonella inducerede rørformede strukturer.
Figur 1. Skema til fremstilling af HeLa-celler for levende celler. HeLa-celler blev podet i kammerobjektglas, mock-inficeret eller inficeret med forskellige Salmonella-stammer i 30 minutter, vasket 3 gange med PBS, derefter incubat ed med medium indeholdende 100 ug / ml gentamicin i 1 time. Derefter blev mediet erstattet af billeddannende medium indeholdende 10 nm guld-BSA-rhodamin NP'er (OD 520 = 0,1) og 10 ug / ml gentamicin, inkuberet i 1 time og derefter forfulgt af NP-frit medium for resten af eksperimentet . Levende cell imaging blev udført på forskellige tidspunkter efter infektion (pi). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. TEM billeder af kolloidt guld nationale parlamenter før (a), og efter mærkning (b). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Remodeling værtens cellulære endo-lysosomale system ved intracellulære Salmonella. HeLa-celler blev mock-inficeret eller inficeret med Salmonella WT, Δ ssaV eller Δ Sifa mutantstammer og puls / jage med 10 nm guld-BSA-rhodamin NP'er ( OD 520 = 0,1) blev udført som beskrevet i figur 1. Maksimale intensitet projektioner af CLSM Z-stakke er vist. Scale barer, 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Tilgængelighed af endo-lysosomale system på forskellige faser af Salmonella infektion. HeLaCellerne blev pulseret med 10 nm guld-BSA-rhodamin NP'er (OD 520 = 0,1) O / N forudgående infektion eller i 1 time ved forskellige tidspunkter pi som angivet. Levende cell imaging blev udført ved 8-9 timers pi Maksimal intensitet fremskrivninger af CLSM Z-stakke er vist. Scale barer, 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Trin for trin instruktion til kvantitativ analyse ved Imaris hjælp af et billede af en inficeret HeLa celle ved 8 timers pi som eksempel. (A) Åbn dataene ved at klikke på 'Åbn' og vælge filen. (B) i objekter værktøjslinjen i Overgå Vis Tilføj en ny overflade element. (C) For at analysere en ROI, og vælg derefter segment en ROI. (D) Indtast værdierne i den tilsvarende x-, y- og z-felter eller (E) klikke direkte på pilene i preview rektangel for at ændre størrelsen og placeringen af ROI. I dette eksempel blev en ROI ikke behøver og hele billedet blev analyseret. (F) Som en kilde kanal Vælg den kanal 3 (signal om Gold-BSA-Rhodamin NP'er). Tjek den glatte mulighed for at oprette glathed af den resulterende område. Definer en værdi manuelt eller acceptere den automatisk genererede værdi. Her var 0,1 um anvendes. For "Threshold" vælge "Absolut Intensity" valgmulighed. (G) Med henblik på tilpasning tærsklen vælge den manuelle indstilling, og angive en værdi (i dette eksempel 15 blev anvendt). I visningsområdet en overflade tærskel preview vises i gråt. (H) under fanen 'Klassificer Surfaces "den resulterende overflade kan filtreres efter forskellige kriterier. En standard filter er »antal voxels> 10«. Denfilter kan justeres ved at indtaste en ny værdi og andre filtre kan tilføjes. I dette eksempel har vi holdt »antal voxels> 10 'filteret. (I) For at fuldføre Surface skabelse Klik på 'Finish'. På listen Objekt nu un-Marker afkrydsningsfeltet for elementet Volumen og ny skabte overflade vises i visningsområdet i rødt. (J) I Overgå opfattelse farven på de emner varierer fra violet til rød efter deres område. (K) Den »Plot Numbers område« tabel viser statistik information. Statistik eksport til en Excel-fil. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Kvantitativ analyse resultat af en ikke-inficeret celle. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den endo-lysosomal system pattedyrceller styrer vigtige fysiologiske processer, herunder absorption af næringsstoffer, hormon-formidlet signaltransduktion, immunovervågning, og antigenpræsentation 17. Indtil nu har en række markører er blevet anvendt til mærkning af de endocytiske pathway og sporing studier. For eksempel lysoTracker sonder er fluorescerende acidotropic sonder udviklet af Molecular Probes (Life Technologies, USA) for lysosom mærkning, som selektivt kan ophobes i cellulære rum med lav indre pH og effektivt etikettering levende celler i nanomolære koncentrationer 18. Længe inkubation af lysoTracker prober med celler kan imidlertid inducere en stigning i lysosomal pH og føre til potentielle fysiologiske ændringer i lysosomer 19. Nogle store biomolekyler såsom fluoroforen-mærkede dextraner, er også ofte brugt til endosomet / lysosomer mærkning. Men lav fotostabilitet korte cirkulerende liv, og poor tilbageholdelse under fiksering hindre deres ansøgninger på lang sigt levende celler billeddannelse og korrelationsmaalinger mikroskop studerer 16,19. Her blev guld-BSA-rhodamin NP'er brugt som flydende sporstoffer til at mærke værten cellulære endo-lysosomale system. Blev observeret høj optagelse effektivitet og stærke intracellulære fluorescenssignaler. Den næsten fuldstændige colokalisering af nationale parlamenter med lysosomale glycoprotein LAMP1, som er stærkt beriget på membranen af sene endosomer / lysosomer, verificeret korrekt mærkning af endo-lysosomale system ved NPS. Ved at kombinere brugen af fluorescerende NP'er med de andre markører, såsom lysoTracker kan give supplerende oplysninger om værtscelle vesikulær menneskehandel og modning.
Det er værd at nævne, at cellulær internalisering af NP'er er stærkt afhængig af deres fysiske dimensioner og kemiske komponenter. Vi har testet guld-BSA-rhodamin nationale parlamenter med en størrelse på 5 nm, 10 nm, 15 nm og 30 nm, og lignende intracellulær fordeling iside HeLa-celler blev observeret (resultater ikke vist). Vi brugte HeLa-celler praktisk cellelinie for salmonellainfektion studier. Imidlertid guld-BSA-rhodamin NP'er kan også let internaliseres af forskellige andre cellelinier og primære celler er medgørlige. For eksempel har vi observeret Salmonella -induceret rørformede strukturer og mærkning af NP i CHO, COS-7, Caco2 eller 3T3-celler, såvel som i interferon-γ-stimuleret RAW264.7 makrofag-lignende cellelinje celler eller primære murine makrofager og dendritiske celler. Dog vil hver cellelinie kræve justering af infektionen og puls / chase protokoller.
Det er blevet rapporteret, at farvestof indesluttet silica NP'er kan anvendes som en biokompatibel, lever længe, og meget fotostabilt lysosom markør 19, og vi også sammenlignet adfærd rhodamin-doped silica NP'er med varierende størrelse (30 - 1.000 nm). Korrekt mærkning af sene endosomer / lysosomer af silica nationale parlamenter i ikke-inficerede celler og akkumulering af nationale parlamenter i SCV og SIF i Salmonella inficerede celler blev observeret. Men på grund af dannelsen af aggregater NPS eller den store størrelse af enkelte silica NP'er, distribution NPS sammen med Salmonella inducerede rørformede strukturer var ikke ensartet (data ikke vist).
Et karakteristisk træk ved SCV samt SIF er tilstedeværelsen af meget rigelige lysosomale glycoproteiner såsom LAMP1 12. Her blev en HeLa-cellelinie, der stabilt udtrykker LAMP1-GFP anvendes til hjælp for levende celler billeddannelse af endo-lysosomale system, og SCV og Sif strukturer. Salmonella-stammer konstitutivt udtrykker forbedret GFP blev anvendt i infektionsforsøg at angive placeringen af bakterier . På grund af ensartet størrelse og form af de intracellulære bakterier, den bakterielle GFP-fluorescens i almindelighed er let skelnes fra GFP etiketten på endo-lysosomal membraner. Men for fremtidige eksperimenter, hvor fluorescerende signal fra bakterier og membran proteins skal være præcist skelne, andre fluorescerende fusionsproteiner, fx mTurquoise, anbefales at blive integreret. Dette er dog resulterer i yderligere runder af belysning og billedoptagelse, bærer risikoen for større foto-skader i levende celle eksperimenter.
For at finde ud essentielle gener og mekanismer for bakterielle patogener at manipulere vært-celle veje, har brug for mange mutanter, der skal oprettes, og deres præstationer skal nøje sammenlignes. For eksempel er Salmonella-mutantstammer Δ ssaV og Δ Sifa stærkt svækket i systemisk virulens og intracellulær replikation 20,21. Både Δ ssaV og Δ Sifa stammer undlader at inducere SIF, og derudover Δ Sifa Salmonella mister SCV membran i løbet af infektion 12. Sammenligning fænotyper af WT og mutantstammer er medvirkende til at forstå evne Salmonella til remodel værtscelle vesikulær trafik. Baseret på mikroskopisk undersøgelse, er det indlysende, at WT Salmonella undergrave værtscelle endocytiske veje til en meget højere grad i forhold til Δ ssaV og Δ Sifa mutantstammer. Denne funktion kan gøre det muligt intracellulær Salmonella at få flere næringsstoffer for deres intracellulære overlevelse og replikation.
Konfokal mikroskopi billeder viser tydeligt ombygningen af værtens cellulære endo-lysosomale system ved intracellulære bakterier. Imidlertid er kvantitativ analyse af billederne kræves til nøjagtig sammenligning. I den her beskrevne fremgangsmåde, er Imaris software, der anvendes til ekstraktion af 3D-objekter, der har fluorescensintensitet i Channel 3> 15 og antallet af voxels> 10. Disse formål formodes at være intracellulære membranstrukturer indeholdende guld-BSA-rhodamin NP'er. Kan defineres Fluorescensintensiteten tærskel og filtre efter kvaliteten af billederne, men should holdes konstant for at sammenligne forskellige betingelser eller stammer. Her vises eksempler på en ikke-inficeret celle og en WT Salmonella inficerede celle ved 8 timers pi, med 431 og 67 genstande udvundet hhv. Trods den tilsyneladende forskel er det ikke rationelt at sammenligne kun antallet af genstande, da størrelsen af cellerne er ikke det samme. En løsning er at normalisere antallet af objekterne til summerede område (i dette eksempel, 2252 um 2 og 1,975 um 2, henholdsvis) eller summen af fluorescerende intensiteter af objekterne i celler. Alternativt er det også muligt at spore en celle før infektion og på forskellige tidspunkter PI for at sammenligne fordelingen NPS på forskellige stadier af infektion.
Afslutningsvis i denne fremgangsmåde guld-BSA-rhodamin NP blev anvendt til at mærke endo-lysosomal system eukaryote celler. Manipulation af værtens cellulære endo-lysosomal system med et intracellular patogen blev observeret ved levende celler CLSM og kvantitative analyseresultater er angivet ekstreme omlejringer af forsinket endosomer / lysosomer vægt- Salmonella. Salmonella blev anvendt som en model patogen i denne undersøgelse, men intracellulær adfærd andre bakterielle patogener, såsom Shigella flexneri og Listeria monocytogenes kan også undersøges ved hjælp af denne fremgangsmåde. I princippet kunne gold-BSA-rhodamin NP'er internaliseres af en lang række cellelinjer, derfor er lovende bliver bredt anvendt i undersøgelser af interaktionen af endocytiske pathway divergerende endogene eller exogene stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X.
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S.
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
