Summary
Denna artikel beskriver metoder för syntes och fluorescerande märkning av nanopartiklar (NP). NPS tillämpades i puls-chase experiment för att märka endo-lysosomala system av eukaryota celler. Manipulering av endo-lysosomala systemet genom verksamheten i intracellulär patogen Salmonella enterica följdes av levande cell imaging och kvantifierad.
Abstract
Fluorescerande nanopartiklar (NP) med önskvärd kemiska, optiska och mekaniska egenskaper, är lovande verktyg för att märka intracellulära organeller. Här presenterar vi en metod som använder guld BSA-Rhodamine NP att märka endo-lysosomala systemet av eukaryota celler och övervaka manipulationer av värd cellulära vägar genom intracellulär patogen Salmonella enterica. NPS var lätt internaliseras av HeLa-celler och lokaliserade i sena endosomer / lysosomer. Salmonella infektion inducerad ombildning av blåsor och ackumulering av NP i Salmonella- inducerade membranstrukturer. Vi utplacerade Imaris programpaket för kvantitativa analyser av konfokalmikroskopi bilder. Antalet objekt och deras storleksfördelning i icke-infekterade celler var skild från de i Salmonella infekterade celler, vilket indikerar extremt ombyggnad av endo-lysosomala systemet genom WT Salmonella.
Introduction
Fluorescerande nanopartiklar (NPS), inklusive metall NP, kvantprickar, polymer NP, kisel NP, kol punkter etc., har fått stor uppmärksamhet under de senaste decennierna 1,2. Jämfört med traditionella organiska färgämnen, fluorescerande NP visar önskvärda kemiska, optiska och mekaniska egenskaper, såsom stark signalstyrka, motstånd mot fotoblekning och hög biokompatibilitet 3,4. Dessa fördelar gör dem metoden för intracellulär avkänning och levande cell imaging. Dessutom en mängd elektrontäta NP är synliga genom elektronmikroskopi (EM), lättare att tillämpa för korrelerade mikroskopisk analys, som möjliggör en kombination av levande cell spårning med ljusmikroskop (LM) och högre upplösning på ultra nivå med EM 5. Till exempel har guld NP varit lång tid effektivt användas som biosensorer i levande celler för känslig diagnos samt i fråga om immun märkning 6. Nya studies indikerar att guld NP med olika storlek och form kan vara lätt upptag av ett stort antal olika cellinjer och rutinmässigt transportera genom endosomal vägen, därför har stor potential varelse sökt intracellulär vesikler transporter spårning och endo-lysosomala märkningssystem 7,8 .
Patogena mikroorganismer, såsom Salmonella enterica, Shigella flexneri och Listeria monocytogenes, har utvecklat olika mekanismer för att invadera icke-fagocytiska värdceller 9. Efter att internaliseras, patogener, antingen lokaliserade i cytosolen eller sekvestrerade i membranbundna fack, interagera mycket med sina värdmiljöer och modulera dessa att gynna sin egen överlevnad 10. Till exempel, bosatt Salmonella enterica och replikerar inom en intracellulär phagosomal fack kallas Salmonella -innehållande vacuole (SCV) vid infektion 11. Den mognande SCVtrafikerar mot Golgiapparaten, genomgår kontinuerliga interaktioner med endocytiska vägen, och inducerar bildandet av omfattande rörformiga strukturer, såsom Salmonella inducerade trådar (SIF), sortering nexin tubuli, Salmonella inducerad sekretorisk carrier membranprotein 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Studera hur dessa bakteriella patogener manipulera värdcellvägar är viktigt att förstå infektionssjukdom.
Här, var guld-BSA-Rhodamine NP används som vätskespårämnen för att märka värd cellulära endo-lysosomala systemet, och det mänskliga gastrointestinal patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) användes som modell bakterie att studera interaktioner patogenen med värd endocytic vägen. Intracellulära guld-BSA-Rhodamine NP i icke-infekterade celler och celler som infekterats med WT Salmonella eller muterade stammar avbildades med en konfokala laserskanning mikroskop (CLSM).Därefter Imaris mjukvara användes för att kvantifiera fördelningen av NP, vilket tyder på att Salmonella-infektion inducerad extrem omlagring av endosomer / lysosomer. Efter beskrivning av denna metod, kan analoga experiment utformas för att spåra långsiktiga öde internaliserade nationella parlamenten och att undersöka påverkan av olika exogena ämnen eller endogena faktorer på endocytiska vägen för eukaryota celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av 10 nm Gold Nanopartiklar (Guld NP) 15
- Förbered lösning A: tillsätt 2 ml 1% vattenguldklorid i 160 ml Milli-Q, eller dubbeldestillerat vatten.
- Förbered lösning B: till 8 ml 1% trinatriumcitrat x 2 H2O och 160 pl 1% Garvsyra i 32 ml Milli-Q, eller dubbeldestillerat vatten.
- Värm upp lösningen A och B till 60 ° C och blanda dem under omrörning. Observera en mörkblå färg omedelbart. Beakta röd färg efter ca 15 min. Värm sedan upp till 95 ° C, håll 5 min och kyla lösningen till RT.
- Lägg en droppe av NP fjädring på ett kol belagt galler och låt torka i luft. Kontrollera storlek och morfologi NP genom transmissionselektronmikroskop.
2. Beläggning av guld NP med BSA och Märkning med Rhodamine N-hydroxisuccinimidylester (NHS) 16
- Lägg 900 pl guld NP i en 1,5 ml Eppendorf-rör, centrifugera vid 15.000 xg under 30 minuter. Opnellt, förbereda flera rör kan på en gång.
- Kassera supernatanten, åter avbryta pelleten i 900 pl steriliserad Milli-Q vatten och tillsätt 100 ^ 2 mg / ml BSA / PBS, blanda på en Vortex vid 800 rpm i 30 min.
- För att ta bort överskott av BSA, centrifugera preparatet vid 15.000 xg under 60 min.
- Kassera supernatanten och åter upphäva guld BSA NP i 125 l PBS, till 12,5 pl 1 M bikarbonat.
- Omedelbart före användning, förbereda en 10 mg / ml lösning av rodamin NHS / DMSO, till 30 pl rhodamin NHS / DMSO-lösning till 1 ml av den guld BSA NP fjädring. Inkubera reaktionen under 2 h (eller O / N) vid RT under 800 rpm blandning, undvikande av exponering för ljus.
- Rena guld-BSA-rodamin NP genom dialys mot PBS vid 4 ºC med fem buffert förändringar under perioden 36-48 timmar.
- För att stabilisera NP, tillsätt 10 ìl av 200 mg / ml BSA / PBS i vardera 1 ml guld-BSA-Rhodamine NP. För att ta bort det fria eller utsläppt BSA-rodamin, centrifugera vid 15,000 xg under 60 min. Suspendera pelleten i 2 mg / ml BSA / PBS, mäta OD 520, och förvara vid 4 ° C, undvika exponering för ljus.
- Späd de nationella parlamenten 10 gånger med Milli-Q eller dubbel destillerat vatten, tillsätt en droppe på en kolbelagt galler, och låt torka i luft. Kontrollera storlek och morfologi NP genom transmissionselektronmikroskop (TEM).
NOTERA: Alla material som används för NP beredning steriliserades och operationen genomfördes i en cellkultur huva eller på en bänk bredvid en flamma.
3. Kultur av HeLa-celler
- HeLa-celler permanent uttrycker LAMP1-GFP odlades i DMEM med 10% fetalt kalvserum (FCS) och odlades vid 37 ° C i en atmosfär innehållande 5% CO2.
- Seed cellerna vid en densitet av 50.000 per brunn i en 8-brunnars kammarobjektglas (Ibidi) och inkubera O / N.
4. Kultur Bacteria
- Använd Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-typ (WT) stam. Som jämförelse, använd muterade stammar Δ ssaV defekta i SPI2-T3SS och Δ Sifa saknar nyckel effektor Sifa för SIF. Använd stammar som härbärgerar plasmiden pFPV25.1 för konstitutivt uttryck av förstärkt GFP.
OBS: Bakteriella stammar är rutinmässigt i Luria-Bertani-buljong (LB) med tillsats av 50 pg / ml karbenicillin (WT) och LB med tillsats av 50 pg / ml karbenicillin och / eller 50 | ig / ml kanamycin (Δ ssaV, Δ Sifa ) av krävs för att upprätthålla plasmider. - Inokulera en enda koloni av bakterier i 3 ml LB med lämpliga antibiotika och växa O / N vid 37 ºC under skakar förutsättningar för luftning, sedan späd 1:31 i färskt LB och fortsätta tillväxten under 3,5 timmar. Vid denna tid-punkt, kulturerna når den sena log-fasen och bakterier är mycket invasiva. En "rulltrumma" är bekvämt att inkubera provrörskulturer med luftning.
5. Infektion av HeLa-celler genomSalmonella och Gold-BSA-Rhodamine NP Pulse Chase-märkning (se figur 1 för schema)
- Mät OD 600 av sub-odlade bakterier och späd till OD 600 = 0,2 i 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml), till lämpliga mängder av bakterier till HeLa-celler i 8 brunnar kammare diabilder för att uppnå en mångfald av infektion (MOI) på 100.
- Inkubera under 30 min i cellinkubator, tvätta tre gånger med PBS för att avlägsna icke-internaliserade bakterier (denna tidpunkt sattes som 0 h efter infektion, eller 0 h pi). Lägg 300 | il färskt odlingsmedium innehållande 100 | ig / ml gentamicin och underhålla under 1 timme. Sedan ersätta mediet med färskt medium innehållande 10 | ig / ml gentamicin för resten av inkubationstiden.
- Efter inkubering med odlingsmedium innehållande 100 | ig / ml gentamicin under 1 timme, ersätts mediet genom avbildning medium (Eagles MEM utan FCS, L-glutamin, fenolrött och natriumbikarbonat, med 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 | ig / ml gentamicin. Guld-BSA-rodamin NP sätts till HeLa-celler för att erhålla en slutlig koncentration av OD 520 = 0,1.
OBS: kan guld-BSA-Rhodamine NP även sättas till celler före infektion, eller vid olika tidpunkter pi - Efter 1 h inkubering, avlägsna mediet, tvätta tre gånger med PBS, och tillsätt 300 | il färskt avbildningsmedium innehållande 10% FCS och 10 pg / ml gentamicin för resten av inkubationstiden.
OBS: varaktighet inkubation kan variera beroende på koncentrationen av NPS och cellinjer som används. För RAW264.7 makrofager, konstaterade vi att 30 min inkubation med NP vid en koncentration av OD 520 = 0,05 tillåts tillräcklig interna.
6. Imaging
- Använd ett konfokalt avbildningssystem såsom en konfokala laserskanning (CLSM) eller roterande skiva (SD) mikroskop med en fuktad miljö kammare för högupplöst bildbehandling vid olika tidpunkter.
- Slå på temperaturen cKONTROLL systemet och vänta tills den är stabil. Optimera bildinställningar såsom förstoring, skanningshastighet, upplösning, Z-stack etc. Använd lämpliga inställningar excitation / emissions för GFP och guld-BSA-Rhodamine NP. För detta protokoll, använd en 400 Hz skanningshastighet, upplösning på 512 x 512 bildpunkter och Z-stegstorlek på 0,25 um. Excite GFP och guld-BSA-rodamin med användning av en Ar-laser (488 nm) och en HeNe-laser (543 nm), respektive. Inkludera ett ljusfält (BF) kanal för observation av formen av cellerna. För andra mikroskopi system och infektionsförhållanden, inställningen måste anpassas därefter.
OBS: Använd samma Ar laser som ljuskälla för BF-kanal och signal detekterades med ett foto multiplikator (PMT) detektor. - Vid angivna tidpunkter pi, montera 8 brunnar kammare diabilder som innehåller infekterade celler på mikroskop scenen och spela in bilder.
7. analys av bilder
- Använd mikroskopi bildanalys mjukvara (se
OBS: Alternativt kan öppen källkod paket såsom ImageJ eller FIJI användas för kvantitativ bild analyser. - I objekten verktygsfältet för klicket Surpass syn på ikonen
att lägga till en ny yta post. Klicka på 
(Next). - För att analysera ett område av intresse (ROI), välj segmentet en ROI. I en visningsyta, är en rektangel-gränsade avsnitt överlagras på bilden representerar ROI. För in värdena i motsvarande x-, y- och z-områden, eller klicka direkt på pilarna i förhandsvisnings rektangeln för att ändra storlek och position för ROI. Klicka sedan på
= "/ Filer / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Next).
- Som en källa kanal väljer Kanal 3 (signal för Gold-BSA-Rhodamine NP). Kontrollera smidig möjlighet att ställa upp jämnhet resulte området. Definiera ett värde manuellt eller acceptera den automatiskt genererade värdet. För Threshold markerar Absolute Intensity alternativet.
- För justeringströskeln, väljer den manuella alternativet och ange ett värde. I visningsområdet, är en tröskel yta förhandsgranskning visas i grått.
- På fliken Klassificera Ytor kan filtreras den resulterande ytan av olika kriterier. En standardfilter är "antal voxlar> 10 ', och andra filter kan också inkluderas genom att klicka" lägg till ". Om en filtrering är inte nödvändigt, ta sedan bort alla filter genom att klicka på knappen Ta bort. Klicka (Next).
- För att slutföra Surface skapande, klicka på/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). I objektlistan, nu avmarkera rutan för objektet volym och ny skapade yta visas i visningsområdet.
- Exportera statistiken. Nu, i Surpass uppfattning färgen av ämnena varierar från lila till rött beroende på deras område. Och den "Plot Numbers Area" tabell visar statistik information (t.ex., ID-nummer och området från föremål). Exportera alla statistik över ytan 1 till en Excel-fil genom att klicka
(Spara).
att lägga till en ny yta post. Klicka på 
(Next). 
(Spara). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Guld NP genererades genom en väl etablerad metod via reduktion av klorsyra med citrat och garvsyra. Såsom visas i fig 2A, de syntetiserade guld NP var kvasi-sfäriska till formen med en storlek av ungefär 10 nm. BSA-beläggning och rodamin-märkning inte påverka deras morfologi eller storlek (Figur 2B).
Det har rapporterats att guld NP lätt kan tas upp av olika däggdjursceller och hamnade i endocytiska system 7. I enlighet med tidigare verk, var ljusa röda fluorescens signaler observerats i HeLa-celler efter 1 timme inkubation med guld-BSA-Rhodamine NP (Figur 3, WT 5 h pi), vilket indikerar effektiv internalisering av de nationella parlamenten av celler. De flesta av de röda signaler hittades samlokaliserades med gröna signaler, som visar att de nationella parlamenten begränsades i sena endosomer eller lysosomer. Men till skillnad jämn fördelning av NP i sena endosomer / lysosomeri icke-infekterade celler (Figur 3, mock), var deras platser i stort sett omlagras i WT Salmonella infekterade celler. I den tidiga fasen av infektion (Figur 3, WT 5 h pi), replikerar salmonella inom SCV och SIF genomgår snabba utvidgning eller sammandragning rörelse. Vid denna tidpunkt, var en bråkdel av de nationella parlamenten finns i SCV och SIF, medan en annan fraktion fortfarande ligger i fria sena endosomer / lysosomer. Vid 8 h pi (Figur 3, WT 8 h pi), en stabiliserad nätverk av SIF bildades, och de flesta nationella parlamenten hittades ackumulerats inom de rörformiga strukturer, medan endast en mycket liten del förblev ligger i fria sena endosomer / lysosomer. De muterade stammar Δ ssaV och Δ Sifa uppvisade tydliga beteenden. Såsom visas i figur 3 (Δ ssaV), vid 8 h pi, var Δ ssaV begränsas inuti SCV medan inga SIF strukturer bildades. Vissa NP observerades kring Salmonella inne i SCV, men majoriteten av de nationella parlamenten fortfarande ligger i fria sena endosomer / lysosomer. För Δ Sifa stammen (Figur 3, Δ Sifa), flykt av Salmonella i cytoplasma inträffat, och associering mellan NPS och bakterier observerades.
I vår tidigare studie fann man att SIF visnings mycket dynamiska egenskaper i den tidiga fasen av infektionen (3-5 tim pi), men blir stabiliserats under den senare perioden (> 8 tim pi) 12. Därför är vi undrar om salmonella i tidiga och sena faser av infektion har jämförbar förmåga att ordna distribution av intracellulära NP. Som visas i Figur 4, var guld NP inkuberade med HeLa-celler O / N innan infektion, eller vid olika tidpunkter efter infektion (1-7 tim pi) under 1 timme, i alla fall de flesta av de internaliserade nationella parlamentens observerades ackumulerats i SCV eller SIF.
Mikroskopisk Observsamheten visade att infektion av Salmonella resultat i massiv ombildning av endo-lysosomala systemet av värdceller. Som ett nästa steg, använde vi Imaris programpaket för att analysera Salmonella inducerad värd cellfenotyper på ett kvantitativt sätt. Använda bilden av en infekterad HeLa-cell vid 8 tim pi som ett exempel, är en steg-för-steg-instruktioner för kvantitativ analys avbildas i figur 5. Genom en intensitetströskel på 15 och ett "antal voxlar> 10" filter, 3D föremål extraherades från den ursprungliga bildfilen. Föremålen skulle vara intracellulära strukturer där guld BSA-rodamin NP ligger med. I detta exempel har 67 föremål utvinns totalt, med en summerad område som 1,974.64 um 2. Det största objektet, vilket samlokaliserades med SIF nätverket, har en yta på 1,836.23 um 2, medan de andra är mindre än 50 pm 2. För jämförelse, ett exempel som visar quantitative analys följd av en icke-infekterad cell gavs i. Här var 431 objekt extraherades totalt, inom vilken det genomsnittliga värdet av området är 5 | im 2 och den största objektet har en area på 34 | j, m 2. Den summerade område av föremålen är 2252 um 2, vilken är jämförbar med den infekterade cellen i figur 4 (1975 ^ m 2). Emellertid är antalet objekt mycket större än den andra en (431 och 67 föremål, respektive), vilket indikerar hög grad fusion av vesiklar med Salmonella -inducerade rörformiga strukturer.
Figur 1. System för framställning av HeLa-celler för live cell imaging. HeLa-celler såddes i kammarobjektglas, mock-infekterade eller infekterade med olika Salmonella-stammar för 30 min, tvättades tre gånger med PBS, därefter incubat ed med medium innehållande 100 pg / ml gentamicin under 1 timme. Därefter ersattes mediet genom avbildning medium innehållande 10 nm guld-BSA-Rhodamine NP (OD 520 = 0,1) och 10 | ig / ml gentamicin, inkuberades under 1 h, och sedan jagade av NP-fritt medium för resten av experimentet . Levande cell imaging utfördes vid olika tidpunkter efter infektion (pi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. TEM bilder av kolloidalt guld NP före (a) och efter märkning (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Ombyggnad av värdens cellulära endo-lysosomala systemet genom intracellulära Salmonella. HeLa-celler var mock-smittade, eller infekterade med Salmonella WT, Δ ssaV eller Δ Sifa muterade stammar och puls / chase med 10 nm guld-BSA-Rhodamine NP ( OD 520 = 0,1) utfördes såsom beskrivs i figur 1. Maximala intensitets projektioner av CLSM Z-stackar är visade. Skala barer, 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tillgängligheten av endo-lysosomala systemet vid olika faser av salmonellainfektion. HeLaceller pulsades med 10 nm guld-BSA-Rhodamine NP (OD 520 = 0,1) O / N tidigare infektion, eller för en timme vid olika tid-punkter pi, såsom anges. Levande cell imaging utfördes vid 8-9 tim pi Maximal intensitet projektioner av CLSM Z-stackar visas. Skala barer, 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Steg för steg instruktion för kvantitativ analys av Imaris hjälp av en bild av en infekterad HeLa cell vid 8 h pi som ett exempel. (A) Öppna data genom att klicka på "Öppna" och välja filen. (B) i objekt verktygsfältet i Surpass uppfattning lägga till en ny yta post. (C) Att analysera ett ROI, välj sedan segmentet en ROI. (D) För in värdena i motsvarande x-, y- och z-fält eller (E) klicka direkt på pilarna i förhandsvisnings rektangeln för att ändra storlek och position på ROI. I detta exempel var en ROI inte behöver och hela bilden analyserades. (F) Som en källa kanalval Kanal 3 (signal om Gold-BSA-Rhodamine NP). Kontrollera smidig möjlighet att ställa upp jämnhet resulte området. Definiera ett värde manuellt eller acceptera den automatiskt genererade värdet. Här, var 0,1 ^ m användes. För "Threshold" välja "Absolut Intensity" alternativet. (G) För att anpassa tröskel väljer den manuella alternativet och ange ett värde (i detta exempel 15 användes). I visningsområdet en yta tröskel förhandsgranskning visas i grått. (H) på fliken "Klassificera Ytor" den resulterande ytan kan filtreras genom olika kriterier. En standardfilter är "antal voxlar> 10 '. Denfiltret kan justeras genom att ange ett nytt värde och andra filter kan läggas till. I det här exemplet, höll vi filtret "antalet voxlar> 10 '. (I) För att slutföra Surface skapande klicka på "Slutför". I Object listan nu avmarkera rutan för objektet volym och ny skapade yta visas i visningsområdet i rött. (J) I Surpass uppfattning färgen av ämnena varierar från lila till rött beroende på deras område. (K) Den "Plot Numbers Area" tabell visar informationen statistik. Export statistik till en Excel-fil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kvantitativ analys resultat av en icke-infekterade cellen. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endo-lysosomala systemet av däggdjursceller styr viktiga fysiologiska processer, inklusive näringsupptag, hormon medierad signaltransduktion, immunövervakning, och antigenpresentation 17. Hittills har en mängd olika markörer har använts för märkning av den endocytiska reaktionsvägen och tracking studier. Till exempel, Lysotracker sonder är fluorescerande acidotropic prober utvecklats av Molecular Probes (Life Technologies, USA) för lysosome märkning, som selektivt kan ackumuleras i cellulära fack med låg inre pH och effektivt märka levande celler vid nanomolära koncentrationer 18. Emellertid kan länge inkubation av Lysotracker sönder med celler inducerar en ökning av lysosomal pH och leda till potentiella fysiologiska förändringar av lysosomer 19. Några stora biomolekyler, såsom fluoroformärkta dextraner, används också ofta för endosom / lysosomer märkning. Emellertid låg fotostabilitet, kort cirkulerande livslängd, och poor behålla under fixering hindrar sina ansökningar på långsiktigt levande cell imaging och korrelat mikroskop studerar 16,19. Här, var guld-BSA-Rhodamine NP används som vätskespårämnen för att märka värd cellulära endo-lysosomala systemet. Hög upptag effektivitet och starka intracellulära fluorescenssignaler observerades. Den nästan totala colocalization av NP med lysosomala glykoprotein LAMP1, som är mycket berikad på membranet av sena endosomer / lysosomer verifierade korrekt märkning av endo-lysosomala systemet genom de nationella parlamenten. Kombinera användningen av fluorescerande NP med övriga markörer som Lysotracker kan ge kompletterande information om värdcell vesikulär människohandel och mognad.
Det är värt att nämna att cellulär internalisering av NP är mycket beroende av deras fysiska dimensioner och kemiska komponenter. Vi har testat guld-BSA-Rhodamine NPS med en storlek av 5 nm, 10 nm, 15 nm och 30 nm, och liknande intracellulära fördelningen isido HeLa-celler observerades (resultat ej visade). Vi använde HeLa-celler som bekvämt cellinje för salmonellainfektion studier. Men guld BSA-rodamin NP kan också lätt internaliseras av olika andra cellinjer och primära celler är mottagliga. Till exempel, observerade vi Salmonella -inducerad rörformiga strukturer och märkning av NP i CHO, COS-7, Caco2, eller 3T3-celler, såväl som i Interferon-γ-stimulerad RAW264.7 makrofagliknande cellinjeceller eller primära murina makrofager och dendritiska celler. Dock kommer varje cellinje kräva justering av infektionen och puls / chase-protokoll.
Det har rapporterats att färgämnes infångad kiseldioxid NP kan användas som ett biokompatibelt, långlivade, och mycket fotostabila lysosome markör 19, och vi jämförde också beteendet hos rodamin dopad kiseldioxid NPS med varierande storlek (30 - 1000 nm). Korrekt märkning av sena endosomer / lysosomer av kiseldioxid NP i icke-infekterade celler och ackumulering av NP i SCV och SIF i Salmonella infekterade celler observerades. Emellertid, på grund av bildning av aggregat av NPS eller den stora storleken av enstaka kisel NPS distribution av NP tillsammans med Salmonella -inducerade rörformiga strukturer var inte enhetlig (data ej visade).
Ett typiskt kännetecken för SCV liksom SIF är närvaron av mycket rikliga lysosomala glykoproteiner såsom LAMP1 12. Här gjordes en HeLa-cellinje som stabilt uttrycker LAMP1-GFP användes för att underlätta för levande cell-avbildning av endo-lysosomala systemet och SCV och SIF strukturer. Salmonella-stammar som konstitutivt uttrycker förstärkta GFP användes i infektionsexperiment för att indikera platsen för bakterier . På grund av den enhetliga storleken och formen av de intracellulära bakterierna, är den bakteriella GFP fluorescens i allmänhet lätt att skilja från GFP etiketten på endo-lysosomala membraner. Men för framtida experiment där fluorescerande signal från bakterier och membran proteins behöver vara exakt differentiera, andra fluorescerande fusionsproteiner, t.ex. mTurquoise, rekommenderas för att integreras. Detta resulterar emellertid i ytterligare rundor av belysning och bild förvärv, som tar risken att högre fotoskador i levande cellförsök.
För att ta reda essentiella gener och mekanismer för bakteriella patogener att manipulera värdcellvägar, många mutanter måste skapas och deras prestationer måste noga jämföras. Till exempel är muterade stammar Salmonella Δ ssaV och Δ Sifa mycket försvagat i systemisk virulens och intracellulär replikering 20,21. Både Δ ssaV och Δ Sifa stammar misslyckas att inducera SIF, och dessutom Δ Sifa Salmonella förlorar SCV membranet under loppet av infektion 12. Jämföra fenotyper av WT och mutantstammar är avgörande för att förstå förmåga Salmonella till remodel värdcell vesikulär trafik. Baserat på undersökning i mikroskop, är det uppenbart att WT Salmonella gräva värdens cellulära endocytiska vägar till en mycket högre grad jämfört med Δ ssaV och Δ Sifa mutantstammar. Denna funktion kan göra det möjligt intracellulär Salmonella att få mer näring för sin intracellulär överlevnad och replikering.
Konfokalmikroskopi bilder visar tydligt ombyggnad av värdcell endo-lysosomala systemet genom intracellulära bakterier. Emellertid krävs kvantitativ analys av bilderna för exakt jämförelse. I metoden som beskrivs här, är Imaris programvara som används för att extrahera 3D-objekt som har fluorescensintensiteten i kanal 3> 15 och antalet voxlar> 10. Dessa objekt är tänkta att vara intracellulära membranstrukturer som innehåller guld-BSA-Rhodamine NP. Fluorescensintensiteten tröskel och filter kan definieras beroende på kvaliteten på bilderna, men should hållas konstant för att jämföra olika villkor eller stammar. Här visas exempel på en icke-infekterad cell och en WT Salmonella infekterade cellen vid 8 tim pi, med 431 och 67 föremål extraherade, respektive. Trots den uppenbara skillnaden är det inte rationellt att jämföra bara antalet föremålen, eftersom storleken av cellerna är inte samma sak. En lösning är att normalisera antal av objekten till den summerade område (i detta exempel, 2252 ^ m 2 och 1975 | im 2, respektive) eller summan av fluorescerande intensiteter av föremålen inuti cellerna. Alternativt är det också möjligt att spåra en cell innan infektion och vid olika tid-punkter PI för att jämföra fördelningen av NP i olika stadier av infektion.
Sammanfattningsvis, i denna metod guld-BSA-Rhodamine NP applicerades att märka den endo-lysosomala system av eukaryota celler. Manipulering av värdens cellulära endo-lysosomala systemet genom en intracellular patogen observerades av levande cell CLSM och kvantitativa analysresultat visade extrema omdisponeringar av sena endosomer / lysosomer av WT Salmonella. Salmonella användes som modell patogen i denna studie, men intracellulär beteendet hos andra bakteriella patogener, såsom Shigella flexneri och Listeria monocytogenes skulle också kunna undersökas med hjälp av denna metod. I princip skulle guld-BSA-Rhodamine NP internaliseras av en stor mängd cellinjer, därför är lovande tillämpas i stort sett i studier som undersöker samspelet mellan den endocytiska reaktionsvägen med divergerande endogena eller exogena substanser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X.
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S.
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
