Abstract
Hovedparten af alle kendte sygdomme er ledsaget af lidelser i det kardiovaskulære system. Undersøgelser af kompleksiteten af de interagerende veje aktiveres under cardiovaskulære patologier er dog begrænset af mangel på robuste og fysiologisk relevante metoder. For at modellere patologiske vaskulære hændelser har vi udviklet et in vitro assay til undersøgelse af interaktionen mellem endothel og fuldblod. Assayet består af primære humane endotelceller, som er placeret i kontakt med humant fuldblod. Fremgangsmåden anvender native blod med ingen eller meget lidt antikoagulant, muliggør undersøgelse af delikate vekselvirkninger mellem molekylære og cellulære komponenter i et blodkar.
Vi undersøgte funktionaliteten af assayet ved at sammenligne aktivering af koagulation af forskellige blod inkuberet med eller uden humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC) mængder. Hvorimod en større blodvolumen bidraget tilen stigning i dannelsen af thrombin antithrombin (TAT) komplekser, tilstedeværelsen af HUVEC resulterede i reduceret aktivering af koagulation. Desuden vi anvendt billedanalyse af leukocyt tilknytning til HUVEC stimuleret med tumornekrosefaktor (TNFa) og fundet tilstedeværelsen af CD16 + celler til at være væsentlig højere på TNFa stimulerede celler sammenlignet med ikke-stimulerede celler efter kontakt blod. Afslutningsvis kan assayet anvendes til at studere vaskulære patologier, hvor interaktioner mellem endotelet og blodrummet er forstyrret.
Introduction
Metoder til analyse af interaktioner blod-kar i hjertekarsygdomme involverer generelt dyreforskning eksperimenter. Resultaterne er oprettet i eksperimentel forskning dyremodeller kan dog have ringe eller ingen virkning på human sygdom. 1,2 Som sådan er der et behov for god og pålidelig in vitro-modeller til at undersøge cellulære interaktioner mellem blodrummet og vaskulære endotelceller en human-lignende system. Vi har derfor etableret en blod endotelcelle kammer model. Dette er baseret på en tidligere beskrevet model, der anvendes til at undersøge interaktionen mellem biomaterialer og humant fuldblod. 3 I modsætning til andre in vitro opsætninger, hvor normalt kun antallet af oprensede komponenter, dvs. thrombocytter, leukocytter eller endotelceller er til rådighed, den foreliggende model inkorporerer alle de tilstedeværende bestanddele i et blodkar.
Opsætningen af blodet endotel cell kammer model er designet til at muliggøre anvendelse af frisk udtaget humant blod med lidt eller ingen tilsat antikoaguleringsmiddel. Blod opbevaret i længere tidsperioder erhverve såkaldte storage læsioner, hvor opdeling af erythrocytter kan interferere med sarte interaktioner mellem blod og endotelceller. 4
For at undgå koageldannelse under håndtering af fuldblod ex vivo kræver enten høje doser af antikoagulans, eller at alt materiale i kontakt med blod skal være ikke-aktiverende. Som ikke-aktiverende overflader er sjældne i laboratoriet miljøet, kan materialer alternativt være forsynet med et beskyttende lag af immobiliseret heparin. Et beskyttende lag af immobiliseret heparin (i det følgende benævnt Corline heparin overflade (CHS)), der kan anvendes til de fleste materialer skaber en overflade, hvor kontakt blodet kan forekomme uden at forårsage en aktivering af koagulationskaskaden. 5 således ved at give kamrene med CHS, blod endotel cell kammer model muliggør brug af meget lave koncentrationer af antikoagulerende i blodet. Undgå tilsætning af høje koncentrationer af antikoagulerende i blodet endotel kammer model gør det muligt at studere følsomme interaktioner inden for et blodkar, som ellers ville være maskeret. 6
Blod endotelcelle kammer model består af to kamre, der er dannet ved at fastgøre plastcylindre (højde: 8 mm; radius: 9 mm) på en plast mikroskopobjektglas. Kanterne vender opad på cylindrene er udstyret med riller, som er forsynet med gummi-O-ring til tætning af kamrene mod cellekultur slide. Kamrene er kun delvis fyldt med blod, da luft i kammeret holder blod i bevægelse, når kamrene efterfølgende roteres i en lodret position (figur 1).
For at vurdere funktionaliteten af modellen, udførte vi forsøg med enten en helt CHS belagtkammer eller human navlestrengsveneendotelceller (HUVEC). To separate blodvolumener blev analyseret og dannelsen af thrombin antitrombin (TAT) komplekser (en indirekte markør for koagulation) blev målt med enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Vi derefter vurderet virkningen af blodvolumener og tumornekrosefaktor (TNFa) stimulerede endotelceller på leukocytrekruttering ved billedanalyse.
Figur 1. Opsætning af blodet endotelcelle kammer model. (A) Top vist skematisk tegning af blodkammeret fremstillet i PMMA. (B) Primære humane endotelceller dyrkes på 1-brønds kammerobjektglas. Tilsættes frisk humant fuldblod to kamre på et objektglas. Kamrene og alt materiale, der anvendes til håndtering af blod er behandlet med en beskyttende belægning HS. Efter fjernelse af væggene i cell kultur slide cellerne placeret overfor blod og systemet er fastspændt lukket. (C) Blodet endotelcelle kamre derefter inkuberet under rotation i 37 ° C. Bagefter kan reaktionerne i blodrummet analyseres ved ELISA og endotelceller kan analyseres ved mikroskopi.
Protocol
BEMÆRK: Blod blev udtaget fra raske individer med åbent system venepunktur i godkendelsen med Ethical Review Board i Uppsala (Permit nr 2008/264).
1. Seeding Cells
- Kultur primære humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) ved 37 ° C i 5% CO 2 i T75 kolber overtrukket med 1% gelatine i PBS pH 7,4.
- Fjern kulturmedium fra en T75 kolbe indeholdende HUVEC (eller en anden type af primære humane endotelceller) og vaskes cellerne med 2,1 mM EDTA i PBS pH 7,4. Frigør celler ved at tilsætte 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkubering til 2 - 3 min i 37 ° C.
- Indsamle celler ved at skylle kolben med 9 ml 10% FBS i PBS pH 7,4 og overføre cellesuspensionen til et 15 ml rør. Spin ned cellerne ved 735 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten omhyggeligt endotelcellevækst medium mikrovaskulære (EF GMMV) og tælle cellerne i et Burker kammer. Seed 21.000 calen / cm2 i 1-brønds cellekultur objektglas og inkuberes ved 37 ° C. HUVEC vil blive sammenflydende efter 1 - 2 dage af kultur. Overvåg celle morfologi og sammenflydning dagligt under et lysmikroskop.
2. Fremstilling af fuldblod
- Forberede alle kunstige overflader, der vil være i kontakt med blod med et dobbelt lag af immobiliseret heparin (CHS) i henhold til producentens anvisninger. CHS overtrukne materialer beskyttet mod støv kan opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder uden tab af funktion.
- Brug åbent system venepunktur til at trække blod fra en rask donor kort tid (<30 min), før du starter blodet endotel kammer eksperiment. Par en kanyle (18 G x 50 mm) til CHS belagt silicium slange (indre diameter: 2 mm), før omhyggeligt opsamling af blod i en CHS overtrukket 50 ml rør. Supplement blod med ufraktioneret heparin for at nå frem til en endelig koncentration på 0,75 IU / ml. Bland blod forsigtigt ved inverting røret 2 - 3 gange.
3. Blood Endothelial Chamber Model
- Fabrikere blodkamre (figur 1A, top view) i akryl polymethylmethacrylat (PMMA), der består af to cylindre (højde 8 mm og radius 9 mm), der er limet til en PMMA dias (25 x 75 mm). Passer kanterne af cylindrene opad med gummi O-ringe til at forsegle blodkammeret mod objektglas med dyrkede endotelceller (Figur 1B). Rotere blodkamrene forbundet til kultur objektglas med endotelceller derefter i en lodret position (figur 1C).
- Brug en CHS belagt pipettespids til at overføre 1,5 ml blod i hver CHS belagt kammer pas på ikke at aktivere blodet.
- Overfør 1 ml blod i mikrocentrifugerør indeholdende 30 pi 0,34 MK 3 EDTA for at nå en endelig koncentration på 10 mM K 3 EDTA til bestemmelse af initiale plasma proteinkoncentrationer hjælpen enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Blandes omhyggeligt blodet og holde rørene på is.
- Fjern plastvæggene af objektglas cellekultur i henhold til producentens anvisninger og omhyggeligt vaske cellerne i PBS pH 7,4. Sørg for at efterfølgende at fjerne så meget væske som muligt fra dias. Lad ikke cellerne tørre ud.
- Placer glider på toppen af blodkamrene, med celler overfor blod. Fastgør dias ved at placere en klemme omkring blodet endotelcellen kammer. Brug en plastik dias for yderligere støtte for at undgå brud på cellekultur glasplade, når du placerer klemmen.
- Fix blodet endotelcelle kammer på et roterende hjul (40 cm i diameter) anbringes i et 37 ° C vandbad. Rotere hvert kammer på hjulet 0.5 xg i 30 min.
- Efter inkubation demontere blodet endotelcellen kammer. Vask cellekultur dias i PBS pH 7,4 og fikseres cellerne i iskold 1% paraformaldehyd (PFA) feller 10 min. Overfør 1 ml blod fra hvert kammer til mikrocentrifugerør indeholdende 30 pi 0,34 MK 3 EDTA for at nå en endelig koncentration på 10 mM K 3 EDTA og bland rørene forsigtigt. Hold rørene på is.
- Centrifuger rørene ved 4560 xg i 10 minutter i 4 ° C. Overfør blodplasma til nye mikrocentrifugerør og opbevares i -70 ° C indtil yderligere analyse.
4. Analyse af Blood Endothelial interaktioner
- Udføre immunfluorescensfarvning med muse-anti-humant CD16, efterfulgt af sekundær gede-anti-muse-Alexa 488 og phalloidin-TexasRed. Udføre hver farvning trin i 1 time ved stuetemperatur og vaskes objektglassene i PBS pH 7,4 mellem hvert trin. Kontrastfarve kernerne med DAPI i 10 minutter ved stuetemperatur. Analysere blodkomponenter bundet til endotelceller ved hjælp af fluorescens mikroskopi kombineret med billedanalyse under anvendelse af passende billede analyse software som CellProfiler.
- Quantify reaktionerne i blodrummet med thrombin-antithrombin (TAT) ELISA ifølge producentens anvisninger for plasmaprøver.
- Anvende passende statistiske værktøjer, fx., En uparret t-test, for at analysere dataene.
Representative Results
Nødvendigheden af CHS Coating
For at måle reaktioner i fuldblod specifikke dem fremkaldt af endotelcellerne skal alle anvendes til blodet endotelcelle kammer materialer indrettet med en CHS coating før brug. Figur 2A (til venstre) viser en ubelagt kammer efter 30 min af blod kontakt med en klart synlig blodprop stede. Behandling kammeret med CHS (figur 2A, højre) på den anden side beskytter blod fra ukontrolleret aktivering, sikre, at resultaterne skyldes endoteliale celle-blod interaktioner.
Effekten af blodvolumen i mødesalen
Aktivering af koagulation er mere sandsynlig i stillestående blod som sandsynligheden for samspil mellem aktiverede koagulationsfaktorer øges. I blodet endotelcellen kammer model er blod holdes i bevægelse på grund af cirkulationen af en luftboble inde i kammeret. I order at bestemme virkningen af ændringer i blodvolumen og dermed også luftboble størrelse, blev en CHS belagt kammer forbundet til en CHS belagt objektglas, der blev testet med 1,5 ml eller 1,75 ml fuldblod i 30 minutter. Den mængde blod uden nogen bevægelse af luftboblen er 2,5 gange større, når 1,75 ml blod tilsættes til kammeret i forhold til, når 1,5 ml blod anvendes (figur 2B). De målte TAT-værdier foreslog øget TAT-formation med øget blodvolumen (figur 2D). Når HUVEC (figur 2C) blev inkuberet med enten 1,5 eller 1,75 ml fuldblod, var der ingen forskel bemærket mellem de to grupper, hvilket tyder på, at endotelceller kan modulere aktiveringen af koagulation (figur 2D).
Effekten af TNF på Blood Cell rekruttering og aktivering af koagulation
For at undersøge virkningen af TNFa på leukocytrekruttering, HUVEC var treated med 20 ng / ml TNFa 4 timer før kontakt blod. Blood kontakt - med enten 1,5 ml eller 1,75 ml blod - blev fortsat i 30 minutter, hvorefter de kultur objektglas blev farvet for CD16 (figur 2F), afbildet og antallet af CD16 + celler blev kvantificeret. Rekruttering af CD16 + -celler steg markant med TNFa behandling (figur 2E) 100-256 CD16 + celler / mm 2 (p <0,0001) med 1,5 ml blod og 172-378 (P <0,0001) med 1,75 ml blod. Dannelsen af TAT-komplekser blev målt i de tilsvarende plasmaprøver fra blod inkuberet med enten TNFa behandlede eller ubehandlede celler (Figur 2G). TNFa stimulerede celler inducerede en omtrentlig fordobling af TAT-komplekser sammenlignet med ubehandlede celler.
Figure 2: Funktionalitet af blodet endotelcelle kammer model. (A) Chambers med eller uden CHS blev inkuberet med helblod. Uden CHS, blev et koagel dannet efter 30 minutter. Måling af thrombin-antitrombin (TAT) komplekser, en indirekte markør for koagulation, i blod inkuberet uden CHS var> 6.000 pg / ml. (B) Mængden af blodet ikke holdes bevæger den roterende luftboble vil variere med forskellige blodvolumener. Med tilsætning af 1,5 ml blod, vil denne mængde være 0,3 ml, det vil stige til 0,74 ml med tilsætningen af 1,75 ml. (C) HUVEC afbildet med fasekontrastmikroskopi viser typiske endotelcelle morfologi af et konfluent monolag før blod kontakt. (D) TAT værdier for helt CHS overtrukne kamre viser en lille forskel, når forskellige blodvolumener tilføjes. Tilsætning af 1,5 ml blod resulterede i 35 ± 11 pg / ml (n = 7) i forhold til 1,75 ml, hvilket resulterede i 8577; 70 ug / ml TAT (n = 8). Denne forskel er ikke længere til stede, når HUVEC inkuberes med samme blodvolumener; 66 ± 55 pg / ml til 1,5 ml (n = 5) og 66 ± 29 pg / ml til 1,75 ml (n = 7). (E) Kvantificering af antallet af CD16 + -celler til stede på enten ustimuleret eller TNFa stimulerede HUVEC'er efter blod kontakt. Antallet af CD16 + -celler er signifikant forøget med TNFa stimulerede celler inkuberet med enten 1,5 ml (basale: 100 ± 40 celler / mm; TNFa: 256 ± 121 celler / mm) eller 1,75 ml (basale: 172 ± 67 celler / mm; TNFa: 378 ± 185 celler / mm) af fuldblod (F) Repræsentative billeder af ustimulerede og TNF-stimulerede HUVEC farvet for phalloidin (rød), CD16 (grøn) og DAPI (blå).. Scale bar = 250 um (G) Dannelsen af TAT komplekser groft fordobles TNFa stimulerede celler sammenlignet med ubehandlede celler inkuberet med blod (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 gange mere TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 gange mere TAT, n = 4). Alle værdier er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse p-værdier blev beregnet ved uparrede t-tests. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Flere interaktioner mellem blodet og karvæggen normalt holdes i en hvilende tilstand på grund af ikke-klæbende og anti-thrombotisk karakter endotel. 7 Under patologiske tilstande, der involverer inflammation, er endotel aktiveret med en deraf følgende stigning i adhæsion-receptor-ekspression 8 og en nedsat evne til at hæmme hæmostase. 9 Aktivering af kaskadeanlæggene i blodet igen forstærker thrombogenicitet endoteliet forårsager yderligere trombose og leukocytrekruttering. 10. For at få en bedre forståelse af denne delikate interaktioner mellem endotelceller og fuldblod, vi har udviklet en hidtil ukendt in vitro-metode, hvor dyrkede endotelceller er placeret i kontakt med fuldblod. Til vores viden, vores setup er den første til at vise endotelceller inkuberet med humant fuldblod med ingen eller meget lidt antikoagulant i længere perioder.
nt "> Følsomheden af dette system er aktiveret som åbent system venepunktur i kombination med et beskyttende lag af immobiliseret heparin på alle overflader i kontakt med blod. Brugen af et åbent system under indkøb blod reducerer aktivering af kaskadeanlæggene under venepunktur mens tillader anvendelse af en selvbestemt mængde antikoagulans. Kommercielt tilgængelige evakueret blodprøverør kan dog anvendes afhængigt af den tilsigtede slutpunkter af undersøgelsen. Den endelige koncentration af antikoagulerende føjet til de fleste kommercielt tilgængelige lukket system rør kan hæmme følsomme og ellers er svært at studere, interaktioner i opsætningen. 6 A beskyttende heparin overflade yderligere eliminerer aktivering af blod gennem kontaktflade med andre midler end de endotelceller overflader. 5 Faktisk inkubation af fuldblod suppleret med en lille mængde af ufraktioneret heparin i kammer uden beskyttelse af CHS resulterede i koageldannelse.Desuden var der en 2-fold stigning i rekruttering af blodceller mod TNFa aktiverede HUVEC i kombination med en fordoblet dannelse af TAT uafhængigt af blodvolumen. Dette bekræfter stabiliteten af modellen, og viser også muligheden for at anvende en aktiveret endotel i kombination med fuldblod. Fremtid på, kan blodet endotelcelle kammer anvendes til at undersøge blod celletilgang mod aktiverede endotelceller ved en række af markører udtrykt på celler under forskellige betingelser og stadier af aktivering. Endvidere kan modellen anvendes i kombination med farmakologiske midler for at evaluere virkninger på inflammatoriske tilstande.
Sammenfattende viser vi stor gavn af at kombinere et kammer model med humant blod og vaskulære celler for at skabe et helt menneske in vitro system til at udføre de relevante undersøgelser af karsygdom.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra forskningsrådet svensk (90293501, A0290401, A0290402), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram under tilskudsaftale n ° 602699 (Direkt) Den NovoNordisk Fonden, Gurli og Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapy, Vleugel Foundation og Åke Wiberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
