Abstract
Majoriteten av alla kända sjukdomar åtföljs av sjukdomar i det kardiovaskulära systemet. Studier komplexiteten hos de samverkande vägar aktiveras under kardiovaskulära sjukdomar är dock begränsad av bristen på robusta och fysiologiskt relevanta metoder. För att modellera patologiska vaskulära händelser har vi utvecklat en in vitro-analys för att studera interaktionen mellan endotelet och helblod. Analysen består av primära humana endotelceller, som är placerade i kontakt med humant helblod. Metoden utnyttjar nativt blod med ingen eller mycket lite antikoagulans, vilket möjliggör studier av ömtåliga interaktioner mellan molekylära och cellulära komponenter som är närvarande i ett blodkärl.
Vi undersökte funktionalitet hos analysen genom att jämföra aktiveringen av koagulering genom olika blodvolymer inkuberade med eller utan humana umbilikalvensendotelceller (HUVEC). Medan en större blodvolym bidragit tillen ökning i bildningen av trombin antitrombin (TAT) -komplex, närvaro av HUVEC resulterade i minskad aktivering av koagulation. Dessutom ansökte vi bildanalys av leukocyt anknytning till HUVEC stimulerade med tumörnekrosfaktor (TNF) och fann närvaron av CD16 + celler vara betydligt högre på TNF stimulerade celler jämfört med ostimulerade celler efter blodkontakt. Sammanfattningsvis kan analysen användas för att studera vaskulära patologier, där interaktioner mellan endotelet och blodfacket störs.
Introduction
Metoder för att analysera blod vaskulära interaktioner i hjärt-kärlsjukdom omfattar i allmänhet djur forskningsexperiment. Resultat som skapas i experimentella forskningen djurmodeller kan dock ha liten eller inga konsekvenser för mänskliga sjukdomar. 1,2 Som sådan, finns det ett behov av god och pålitlig in vitro-modeller för att undersöka cellulära interaktioner mellan blodutrymmet och vaskulära endotelceller i en human-liknande system. Vi har därför etablerat en blod endotelceller kammarmodell. Detta bygger på en tidigare beskriven modell som används för att undersöka samspelet mellan biomaterial och humant helblod. 3 I motsats till andra in vitro-konfigurationer där vanligtvis begränsat antal renade komponenter, dvs, trombocyter, leukocyter eller endotelceller är tillgängliga, innehåller den nuvarande modellen alla komponenterna i ett blodkärl.
Installationen av blod endothelial cell kammarmodell är utformad så att användning av nytaget humant blod med lite eller inget tillsatt antikoagulant. Blod som lagras under längre tidsperioder förvärva så kallade lagrings lesioner där nedbrytning av erytrocyter kan störa känsliga samspelet mellan blod och endotelceller. 4
För att undvika koagelbildning under hantering av helblod ex vivo kräver antingen höga doser av antikoagulant eller att allt material i kontakt med blod måste vara icke-aktiverande. Som icke-aktiverande ytorna är sällsynta i laboratoriemiljö, kan också material alternativt vara försedd med ett skyddande lager av immobiliserat heparin. Ett skyddande lager av immobiliserade heparin (nedan kallat Corline heparinyta (CHS)) som kan appliceras på de flesta material som skapar en yta där blodkontakt kan ske utan att orsaka en aktivering av koagulationskaskaden. 5 Således, genom att förse kamrarna med CHS, blodet endotelial cell kammarmodell möjliggör användning av mycket låga koncentrationer av antikoagulant i blodet. Undvika tillsättningen av höga koncentrationer av antikoagulans i blod endothelial kammarmodellen gör det möjligt att studera känsliga interaktioner inom ett blodkärl som annars kan maskeras. 6
Blod endotelceller kammarmodell består av två kamrar som bildas genom att fästa plastcylindrar (höjd: 8 mm, radie: 9 mm) och en plastobjektglas. Kanterna som vetter uppåt på cylindrarna är försedda med spår som är utrustade med gummi O-ringar som används för tätning av kamrarna mot cellodlings sliden. Kamrarna är endast delvis fylld med blod som luft kvar i kammaren håller blodet i rörelse när kamrarna därefter roteras i vertikalt läge (figur 1).
För att bedöma funktionaliteten hos modellen, utförde vi experiment med antingen ett helt CHS belagdkammare eller Humant navelvenendotelceller (HUVEC). Två separata blodvolymer analyserades och bildningen av trombin antitrombin (TAT) -komplex (en indirekt markör för koagulation) mättes med enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Vi sedan bedömde effekten av volymer blod och tumörnekrosfaktor (TNF) stimulerade endotelceller på leukocytrekrytering genom bildanalys.
Figur 1. Inställning av blod endotelceller kammarmodell. (A) uppifrån schematisk ritning av blodkammaren gjord i PMMA. (B) Primära humana endotelceller odlas på en-brunnars kammarobjektglas. Färskt humant helblod sättes till två kamrar på ett objektglas. Kamrarna och allt material som används för hantering av blod behandlas med en skyddande HS beläggning. Efter avlägsnande av väggarna i cell kultur slide cellerna placeras vänd mot blodet och systemet är fastklämd stängd. (C) Den blod endotelial cellkamrarna inkuberas sedan under rotation i 37 ° C. Efteråt kan reaktionerna i blodutrymmet analyseras med ELISA och endotelcellerna kan analyseras genom mikroskopi.
Protocol
OBS: Blod togs från friska individer med öppet system venpunktion i godkännande hos etikprövningsnämnden i Uppsala (Permit nr 2008/264).
1. Sådd Celler
- Kultur primära humana navelsträngsvenendotelceller (HUVEC) vid 37 ° C i 5% CO2 i T75-kolvar belagda med 1% gelatin i PBS pH 7,4.
- Avlägsna odlingsmediet från en T75-kolv innehållande HUVEC (eller annan typ av primära humana endotelceller) och tvätta cellerna med 2,1 mM EDTA i PBS, pH 7,4. Drag av celler genom att tillsätta 1 ml 0,25% trypsin-EDTA och inkubering under 2-3 min i 37 ° C.
- Samla cellerna genom att skölja kolven med 9 ml 10% FBS i PBS pH 7,4 och överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör. Centrifugera ner cellerna vid 735 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten försiktigt i endotelcelltillväxt medel mikrovaskulära (EG GMMV) och räkna cellerna i en Burker kammare. Seed 21.000 calnar / cm 2 i 1-brunnars cellodlings diabilder och inkubera vid 37 ° C. HUVEC kommer att sammanflytande efter 1 - 2 dagars odling. Övervaka cellmorfologin och sammanflyt dagligen under ett ljusmikroskop.
2. Beredning av helblod
- Förbered alla konstgjorda ytor som kommer i kontakt med blod med ett dubbelt skikt av immobiliserade heparin (CHS) enligt tillverkarens instruktioner. CHS belagda material som skyddas från damm kan förvaras i rumstemperatur upp till 6 månader utan förlust av funktion.
- Använd öppet system venpunktion att dra blod från en frisk donator inom kort (<30 min) innan blod endothelial kammarförsök. Par injektionsnål (18 G x 50 mm) till CHS belagd silikon slang (innerdiameter: 2 mm) innan noggrant samla blod i en CHS belagd 50 ml tub. Tillägg blod med ofraktionerat heparin för att nå en slutlig koncentration av 0,75 IE / ml. Blanda blodet försiktigt genom inverting röret 2-3 gånger.
3. Blod Endothelial Chamber Model
- Tillverka blod kammare (Figur 1A, sett uppifrån) i akryl polymetylmetakrylat (PMMA) som består av två cylindrar (höjd 8 mm och radien 9 mm) som är limmade på en PMMA slide (25 x 75 mm). Passa kanterna hos cylindrarna vända uppåt med gummi O-ringar för att täta blodkammaren mot de glasskivor med odlade endotelceller (Figur 1B). Rotera blodkamrar anslutna till odlingsobjektsglas med endotelceller därefter i en vertikal position (figur 1C).
- Använd en CHS belagd pipettspets att överföra 1,5 ml blod i varje CHS belagda kammar ta hand inte för att aktivera blodet.
- Överför 1 ml blod i mikrocentrifugrör innehållande 30 pl 0,34 MK 3 EDTA för att nå en slutlig koncentration av 10 mM K3EDTA för bestämning av initial plasmaproteinkoncentrationer med hjälp aven enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Blanda försiktigt blodet och hålla rören på is.
- Ta bort plastväggarna hos cellodlingsglas enligt tillverkarens instruktioner och noggrant tvätta cellerna i PBS pH 7,4. Se till att i efterhand ta bort så mycket vätska som möjligt från bilderna. Låt inte cellerna torka ut.
- Placera objektglaset ovanpå blodkamrar, med celler som vetter mot blod. Säkra bilden genom att placera en klämma runt blod endotelceller kammare. Använd en plastglas för ytterligare stöd för att undvika brott av cellodlings glasskiva när du placerar klämman.
- Rätta blod endotelcell kammaren på ett roterande hjul (40 cm i diameter) plats i ett 37 ° C vattenbad. Rotera varje kammare på hjulet vid 0,5 x g under 30 min.
- Efter inkubation, demontera blod endotelceller kammare. Tvätta cellodlingsglasen i PBS pH 7,4 och fixera cellerna i iskall 1% paraformaldehyd (PFA) feller 10 min. Överför 1 ml blod från varje kammare till mikrocentrifugrör innehållande 30 pl 0,34 MK 3 EDTA för att nå en slutlig koncentration av 10 mM K3EDTA och blanda rören försiktigt. Håll rören på is.
- Centrifugera rören vid 4560 xg under 10 min i 4 ° C. Överföra blodplasma till nya mikrocentrifugrör och förvara i -70 ° C fram till vidare analys.
4. Analys av blod Endothelial Interaktioner
- Utför immunofluorescens färgning med mus-anti-human CD16 följt av sekundär getantimus Alexa 488 och phalloidin-TexasRed. Utför varje färgningssteg för en timme vid rumstemperatur och tvätta objektglasen i PBS pH 7,4 mellan varje steg. Motfärga kärnor med DAPI för 10 min vid rumstemperatur. Analysera blodkomponenter bundna till endotelcellerna genom fluorescensmikroskopi i kombination med bildanalys med hjälp av lämpliga bildanalys program som CellProfiler.
- Quantify reaktionerna i blodet fack med trombin-antitrombin (TAT) ELISA enligt tillverkarens anvisningar plasmaprover.
- Använd lämpliga statistiska verktyg, t ex., En oparade t-test, för att analysera data.
Representative Results
Nödvändigheten av CHS Coating
För att mäta reaktioner i helblod är specifika för dem som framkallas av endotelcellerna måste alla material som används för blod endotelceller kammare förses med en CHS beläggning före användning. Figur 2A (vänster) visar en obelagd kammaren efter 30 min av blodkontakt med en väl synlig koagel närvarande. Behandling i kammaren med CHS (Figur 2A, höger), å andra sidan skyddar blodet från okontrollerad aktivering, se till att resultaten beror på endotel cellblod interaktioner.
Effekten av blodvolymen i kammaren
Aktivering av koagulation är mer sannolikt i stillastående blod som sannolikheten för interaktion mellan aktiverade koagulationsfaktorer ökas. I blodet endotelcell kammare modell är blod hålls i rörelse på grund av spridningen av en luftbubbla inuti kammaren. I order för att bestämma effekten av förändringar i blodvolymen och därmed även luftbubbla storlek, var en CHS belagd kammare ansluten till en CHS belagd glasskiva som testades med 1,5 ml eller 1,75 ml helblod i 30 minuter. Volymen av blod utan någon rörelse av luftbubblan är 2,5 gånger större när 1,75 ml blod tillsätts till kammaren jämfört med när 1,5 ml av blodet används (figur 2B). De uppmätta TAT-värden föreslog ökade TAT-formation med ökad blodvolym (figur 2D). När HUVEC (figur 2C) inkuberades med antingen 1,5 eller 1,75 ml helblod, ingen skillnad noterades mellan de två grupperna, vilket tyder på att endotelceller kan modulera aktivering av koagulation (figur 2D).
Effekten av TNF på blodkropp Rekrytering och aktivering av koagulation
För att studera effekten av TNF på leukocytrekrytering, HUVEC var behandlaed med 20 ng / ml TNFa 4 h före blodkontakt. Blod kontakt - med antingen 1,5 ml eller 1,75 ml blod - fortsatte i 30 minuter varefter kulturglasen färgades för CD16 (Figur 2F), avbildas och antalet CD16 + celler kvantifierades. Rekryteringen av CD16 + celler ökade signifikant med TNFa-behandling (figur 2E) 100-256 CD16 + celler / mm 2 (p <0,0001) med 1,5 ml blod och 172-378 (P <0,0001) med 1,75 ml blod. Bildningen av TAT-komplex mättes i de motsvarande plasmaprover hos blodet inkuberade med antingen TNFa behandlade eller obehandlade celler (fig 2G). TNFa stimulerade celler inducerade en ungefärlig fördubbling av TAT-komplex jämfört med obehandlade celler.
Figure 2: Funktionalitet av blod endotelceller kammarmodell. (A) Chambers med eller utan CHS inkuberades med helblod. Utan CHS, var ett koagel bildades efter 30 min. Mätning av trombin-antitrombin (TAT) komplex, en indirekt markör för koagulation, i blod inkuberade utan CHS var> 6000 pg / ml. (B) Volymen av blod som inte hålls i rörelse genom den roterande luftbubblan kommer att variera med olika blodvolymer. Med tillsats av 1,5 ml blod, kommer denna volym vara 0,3 ml, medan den kommer att öka till 0,74 ml med tillsats av 1,75 ml. (C) HUVEC bildförsedda med faskontrastmikroskopi visar typiskt endotelcell morfologi av ett sammanflytande monoskikt före blodkontakt. (D) TAT värden för helt CHS belagda kammare visar en liten skillnad när olika blodvolymer läggs till. Tillsatsen av 1,5 ml blod gav 35 ± 11 | ig / ml (n = 7) i jämförelse med 1,75 ml, vilket resulterade i 8577; 70 | ig / ml TAT (n = 8). Denna skillnad är inte längre närvarande när HUVEC inkuberas med samma volymer blod; 66 ± 55 pg / ml för 1,5 ml (n = 5) och 66 ± 29 | ig / ml för 1,75 ml (n = 7). (E) Kvantifiering av antalet CD16 + -celler närvarande på endera ostimulerad eller TNFa stimulerade HUVEC efter blodkontakt. Antalet CD16 + celler ökar väsentligt med TNF stimulerade celler inkuberade med antingen 1,5 ml (basala: 100 ± 40 celler / mm, TNF: 256 ± 121 celler / mm) eller 1,75 ml (basala: 172 ± 67 celler / mm; TNF: 378 ± 185 celler / mm) i helblod (F) Representativa bilder av ostimulerad och TNF stimulerade HUVEC färgade för phalloidin (röd), CD16 (grön) och DAPI (blå).. Skala bar = 250 m (G) Bildandet av TAT-komplex är ungefär fördubblats av TNF-a stimulerade celler jämfört med obehandlade celler inkuberade med blod (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 gånger mer TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 gånger mer TAT, n = 4). Alla värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelse; p-värden beräknades genom oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Flera interaktioner mellan blodet och kärlväggen normalt hålls i ett vilotillstånd på grund av icke-vidhäftande och anti-trombotisk naturen av endotel. 7 Under patologiska tillstånd som involverar inflammation, är endotelet aktiveras med en resulterande ökning av vidhäftningsreceptoruttryck 8 och en minskad förmåga att hämma hemostas. 9 Aktivering av kaskadsystem i blodet i sin tur förstärker trombogenicitet endotelet orsakar ytterligare trombos och leukocytrekrytering. 10 För att få en bättre förståelse för denna känsliga samspelet mellan endotelceller och helblod, vi har utvecklat en ny in vitro-metod där odlade endotelceller är placerade i kontakt med helblod. Så vitt vi vet, är vår inställnings de första att visa endotelceller som inkuberats med humant helblod med ingen eller mycket liten antikoagulerande för längre tidsperioder.
nt "> Känsligheten för detta system är aktiverat som öppet system venpunktion i kombination med ett skyddande lager av immobiliserade heparin på alla ytor i kontakt med blod. Att använda ett öppet system under blod upphandling minskar aktivering av kaskadsystem under venpunktion samtidigt tillåter användning av ett självvalt mängd antikoagulant. Kommersiellt tillgängliga evakuerade blodrören kan dock användas beroende på den avsedda slutpunkterna för studien. Den slutliga koncentrationen av antikoagulantia läggs till de flesta kommersiellt tillgängliga systemrören stängda kan hämma känslig , och i övrigt svårt att studera, interaktioner i setup. 6 Skydds heparinyta eliminerar ytterligare aktivering av blod genom ytan kontakt på något annat än endotelcellerna ytor. 5 Ja, inkubation av helblod med tillsats av en liten mängd av ofraktionerat heparin i kammare utan skydd av CHS gav koagelbildning.Dessutom fanns det en 2-faldig ökning av rekryteringen av blodceller mot TNFa aktiverad HUVEC i kombination med en fördubblad bildning av TAT oberoende av den blodvolym. Detta verifierar stabiliteten av modellsystemet och visar också möjligheten att använda ett aktiverat endotel i kombination med helblod. Framtid på kan blodet endotelcell kammare användas för att undersöka blodcellrekrytering mot aktiverade endotelceller genom en mängd olika markörer uttryckta på celler under olika betingelser och stadier av aktivering. Vidare kan modellen användas i kombination med farmakologiska medel i syfte att utvärdera effekter på inflammatoriska tillstånd.
Sammanfattningsvis visar vi den stora fördelen med att kombinera en kammarmodell med humanblod och vaskulära celler för att skapa en komplett människa i systemet vitro att utföra relevanta undersökningar av kärlsjukdom.
Acknowledgments
Studien har finansierats med bidrag från den svenska Vetenskapsrådet (90293501, A0290401, A0290402), Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram enligt bidragsavtal n ° 602699 (DIREKT), i Novonordisk Foundation, Gurli och Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapy, Vleugel Foundation och Åke Wiberg stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
