Abstract
תאים מגיבים לגירוי chemokine ידי לאבד הצורה העגולה שלהם בתהליך הנקרא קיטוב, ועל ידי שינוי לוקליזציה subcellular של חלבונים רבים. טכניקות הדמיה קלאסית שימשו לחקר תופעות אלה. עם זאת, הם נדרשים הרכישה הידנית של תאים רבים ואחריו כימות של המורפולוגיה ושיתוף הלוקליזציה של ההכתמה של עשרות תאים זמן רב. כאן, שיטה מהירה וחזקה מתוארת ללמוד תופעות אלה על דגימות מורכבות מכמה אלפי תאים באמצעות זרימת הדמיה cytometry טכנולוגיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ עם אלה של cytometer. באמצעות לימפוציטים מסוג T מגורה עם CCL19 וצביעה למולקולות MHC Class I ויקטין פילמנטיות, אסטרטגית gating מוצגת למדוד בו זמנית מידת שינויי צורה והמידה של שיתוף לוקליזציה של סמנים שמושפעים מאיתות CCL19. יתר על כן, אסטרטגית gating זה אפשרה לנו observדואר ההפרדה אקטין פילמנטיות (בחזית) וEzrin-Radixin-Moesin פוספורילציה (phospho-ERM) החלבונים (בחלק האחורי) בתאי T מקוטבים לאחר גירוי CXCL12. טכניקה זו הייתה שימושית גם כדי לבחון את השפעת החסימה על קיטוב של שני אלמנטים שונים: עיכוב של פילמור אקטין ידי מעכב וביטוי תרופתי של מוטציות של / מסלול PKC איתות לא טיפוסי Par6. לפיכך, ראיות הראו כי טכניקה זו שימושית כדי לנתח את שני שינויים מורפולוגיים והפצה מחדש חלבון.
Introduction
כמוקינים הם חלבונים מסיסים קטנים שמושכים תאים למקומות מיוחדים 1. לכן, הם משתתפים במיקום הנכון של תאים ברקמות, תפקיד מכריע בפיתוח ופיזיולוגיה. המערכת החיסונית היא לא יוצאת מכלל זה כפי שהוא מסתמך על הפעולה של סוגי תאים שונים הפועלים בתיאום לעלות תגובה חיסונית יעילה. על ידי שליטה על המיקום הספציפי של סוג תא חיסון אחד במצב נתון, כמוקינים הם-נדרש מראש לפני שניתן להבחין אנטיגנים זרים ונטרלו.
בלימפוציטים מסוג T בפרט, כמוקינים להיקשר לקולטנים ספציפיים משטח ש, על אירוסין, לעורר רבים אותות תאיים (עליית סידן, זירחון ERK, הפעלת GTPases Rho, עלייה בשינויי זיקת integrins וcytoskeletal) שמעדיפים תנועתיות תאי T 2,3. ברמה התאית, ניתן לראות שינויים מורפולוגיים שהושרו על גירוי chemokine.שינויים אלה בצורות תא הם דרמטיים במיוחד בתאי T: יש לי תאי T נחים מורפולוגיה עגולה כמו חרוז-בעת נסיעה בזרם הדם. עם זאת, החישה של הנוכחות של כמוקינים באתרים דלקתיים או בקרבתו של איברי הלימפה הולכת לשנות את הצורה של תאי T אשר כעת לאמץ מורפולוגיה טיפוסית "יד-ראי" בהיקף של צורה דו-קוטבית: קצה מוביל בחזית ונגרר לקצה, או uropod, בחלק האחורי 4. בנוסף, רכיבים תאיים יכולים להפריד לשני אזורים מנוגדים אלו של תאי T מקוטבים כדי לקיים הגירה. לדוגמא, עליית פילמור הסיבי אקטין על גירוי chemokine 5 ויקטין polymerized מצטברת בחלק הקדמי של תא T מקוטב 2. מצד השני, כמה חלבונים, כגון חלבוני phosphorylated של משפחת Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) המקשרת את קרום הפלזמה לשלד תא F- אקטין קליפת המוח, מחדש בתרגום בuropod של מקוטבתאי T 6. מעניין, אנחנו ואחרים הראינו שנדרש תהליך קיטוב זה לנדידת תאי T. ואכן, כל טיפול שמפריע לקיטוב ימנע תנועתיות סלולרית. לדוגמא, עיכוב של הפעילות של החברים של החלבון טיפוסי קינאז C (PKC) משפחה, קיטוב תא לוקי PKCζ וPKCι T ותהליך סריקת הנדידה שלהם של תאים דנדריטים 7. קיטוב תא T גם מוסדר על ידי Rho GTPases. הראינו כי האפנון של פעילות RhoA על ידי חלבון Fam65b תאר לאחרונה מפריע T שינויי תא במורפולוגיה והיכולת שלהם להעביר בassay Transwell 6. כקיטוב הוא צעד תנאי מוקדם לתנועתיות סלולרית, זה קריטי ובכך להיות מסוגל לכמת את זה כקריאה העיקרית של תגובות chemokine. שינויי צורת תא נמדדו בעבר באופן ידני 8. עם זאת, בכימות סוג זה הוא זמן רב מאוד, כך שבדרך כלל רק כמהעשרות תאים נלקחים בחשבון.
כאן, שיטה חדשה מוצגת לכמת את מידת שינויי צורה של לימפוציטים מסוג T נחשף לchemokine גירוי במהירות. זרימת הדמיה cytometry הטכנולוגיה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) משמש, המשלב את היתרונות של cytometer זרימה ומיקרוסקופ 9 לכמת ביעילות את כמות תאים מקוטבים בתנאים שונים של גירוי chemokine. בנוסף לכימות של השינויים מורפולוגיים שאפשר למדוד וחסונה עם הטכנולוגיה הזו, אפשר גם להעריך שינויים בלוקליזציה subcellular של חלבונים מסוימים על איתות chemokine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת T לימפוציטים
- הכן עכבר ראשוני או תאי T אנושיים כפי שתואר 10,11.
- לטפח תאי T אנושיים במדיום RPMI להשלים עם 10% בסרום אנושי AB בצפיפות של 2 - 3 x 10 6 תאים / מיליליטר.
הערה: השימוש בסרום עוברי עגל (FCS) במקום סרום אנושי יכול לעורר קיטוב ספונטני של חלק גדול של תאי T אנושיים בתרבות. שמור את התאים הללו בתרבות ל4-5 ימים ועוד תהליך אותם בכל עת במהלך תקופה זו. - שמור על תאי T העכבר במדיום RPMI מלא בתוספת 10% FCS בצפיפות תאים דומה. להשתמש מייד או ביום שלמחרת, לאחר O / תרבות N על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 10 ng / ml IL7.
- לטפח את קו התא האנושי CEM T בRPMI המלא בתוספת 10% FCS.
2. chemokine גירוי
- לשטוף 5 x 10 5 תאים לכל תנאי ניסוי במדיום HBSS חם בתוספת 10 מ"מ Hepes. עבור חלק מניסויים, שיתוף transfect התאים T אנושי ראשוני היום קודם לכן עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP ו8 מיקרוגרם pcDNA3.1 + (וקטור ריק, שליטה), kinase PKCζ המת, או פלסמידים Par6 N-terminal.
- Resuspend התא גלולה במדיום HBSS-Hepes חם (0.3 להשתמש מספר x מיליליטר של תנאי ניסוי).
- להפיץ את התאים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
הערה: לכן, צינור אחד המתאים לתנאי ניסוי יחידים יכיל 5 x 10 5 תאים ב0.3 מיליליטר בינוני HBSS-Hepes. עבור חלק מניסויים, להוסיף 500 ננומטר Latrunculin או רכב (DMSO) ודגירת התאים למשך 30 דקות לפני גירוי chemokine. - להוסיף 10 עד 500 ng / ml CCL19 או chemokine CXCL12 בצינור אחד.
הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 10-200 מיליליטר chemokine / ng לתאי T אנושיים. תאי CEM אינם מבטאים את הקולטן CCR7 שנקשר CCL19. לכן, תאי CEM רק להיות מסוגלים להגיב לגירוי CXCL12. יתר על כן, שימוש בריכוזים גבוהים יותר chemokine (300-500 ng / ml) לקטב תאי T העכבר. - הפוך את הצינורות כמה פעמים דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 8 או 10 דקות לתאי T ראשוניים או CEM, בהתאמה.
- לעצור את תהליך הקיטוב על ידי הוספה על צינור אחד 0.3 מיליליטר של פתרון חם המכיל paraformaldehyde 2% (PFA) ו -10 מ"מ Hepes בPBS. הפוך את צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. Stainings
- להעביר את התאים מצינורות microcentrifuge לזרום cytometry צינורות.
- ממלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון RT המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ Hepes בPBS.
- בצנטריפוגה הצינורות ב 460 XG למשך 4 דקות.
- בטל supernatant וresuspend התאים של פתרון RT המכיל 5% FCS בPBS 100 μl.
- הוסף 5 μl של FITC-אנטי-HLA-ABC בצינור אחד, מערבולתם, דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT, הרחק מאור.
- שטוף תאים פעם עם PBS המכיל 5% FCS,פעם אחת עם PBS רק ND.
- ב RT: להוסיף 500 μl 1% PFA, דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף תאים עם תמיסה המכילה 1% BSA, 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ HEPES בPBS.
- בטל supernatant, למלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון של PBS המכיל BSA 0.2%, saponin 0.1%, 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ Hepes (חיץ permeabilization).
- לשטוף תאים פעמיים במדיום זה.
- הפוך את הצינורות כדי להסיר בינוני ומערבולתם לנתק את התא גלולה.
- להוסיף 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר TRITC-Phalloidin ו / או 1: של נוגדן אנטי-P-100 ERM דילול על צינור אחד, מערבולתם דגירה במשך 30 דקות ב RT.
- לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization. דגירה עם נוגדנים משני ניאון במידת צורך.
- Resuspend תאי 200 μl PBS ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge.
הערה: תאים מוכנים לרכישה. לחלופין, תוך שמירה על נפח כולל מרבי של 200 μl לכל צינור, להוסיף PFA המרוכז ל% 1 סופייםריכוז על מנת לשמר את stainings אם לא כדי לשמש התאים באותו היום לעיבוד נוסף.
4. תמונות רכישה וניתוח
- הפעל את המכשיר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) ולתת לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן.
הערה: תוכנת INSPIRE שימשה עם מטרת 40X (0.75 NA). תוכנת 3.0 הרעיונות שימשה לכל quantifications דיווח. - הכן סדרה של חלונות רכישתו ניתן לשמור בתבנית לניסויים עתידיים. לצייר היסטוגרמות שלכמת את ערכי שיפוע RMS. מאוכלוסיית "בפוקוס", שנבחרה על RMS היסטוגרמה שיפוע, delimitate האוכלוסייה "תא יחיד" על היסטוגרמה של האזור. ברגע שצינור microcentrifuge הוכנס במכונה, להתאים את כוח הלייזר, שער על תאים בודדים ולרכוש 5,000 T לימפוציטים.
- ברעיונות רכיםכלי, לפתוח את קובץ הרכישה וליצור היסטוגרמה שתציג את הערך של ערך RMS שיפוע לתמונות בשדה בהיר (ערוץ 1) התקבלה לכל תא בודד. צייר שער על ההיסטוגרמה שיפוע RMS שרואה תאים מציגים RMS ערך שיפוע מעל 57.
הערה: צבע RMS מאפשר לקחת בחשבון בניתוח רק לימפוציטים מסוג T הנמצאים במישור המוקד. יש לנו לקבוע באופן אמפירי שתאים בודדים המציגים ערך שיפוע RMS עדיף על 57 הם במישור המוקד, ויכולים להיחשב באופן מדויק. - בניתוח / תפריט מסכות, ליצור מסכה חדשה, שנקרא Erode (M01,2) ממסכת המורפולוגיה על תמונות brightfield M01, נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה של האזור, המחושב על מסכת Erode (M01,2). מהתאים שנבחרו בשער הקודם, לפתוח ההיסטוגרמה מראה את השטח של תאים באמצעות מסכה חדשה שנוצרה זה.
מסכות המורפולוגיה זמינות על ידי: הערהברירת מחדל הוא הרבה יותר גדולה מהגודל האמיתי של התא. לכן, זה יותר מדויק לשחוק אותו עד 2 פיקסלים. - צייר שער על תאי T הבודדים, לא כולל את חרוזי הכיול ופסולת (פינת קטנה) והכפילויות (שטח גדול). התאם את השער הזה בכל רכישה.
הערה: וריאציות בגודל תא תשפיע על מעמדו של השער. ככל שתאי T העכבר קטנים יותר תאי T אנושיים שהם עצמם קטנים יותר מאשר תאי CEM, השטח של כל אחד מסוגי תאים יהיה יחסית לגודלו. - בהתחשב בתאים בודדים, בפוקוס שהיו סגור בשלבים הקודמים, לפתוח עלילת נקודה בהיקף של Raw מקס Pixel על הכתמת HLA-ABC (ערוץ 2, ציר x) כפונקציה של Raw מקס Pixel על phalloidin הכתמה (ערוץ 4, ציר y). צור שער שלא לכלול את אירועי ניאון בלא כתם או רוויים. שתי היסטוגרמות פתוחות המציגות את Raw מקס Pixel לHLA-ABC (ערוץ 2) וphalloidin (ערוץ 4) stainings.
- בניתוח / תפריט מסכות, creatמסכת ea חדשה, הנקראת Erode (M02,2) ממסכת המורפולוגיה של התאים HLA-ABC המוכתם (ערוץ 2), נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה הכוללת את הפרמטר המעגלי, המחושבת על Erode (M02,2).
הערה: פרמטר זה מודד את הסטייה של צורת התא ממעגל. לכן, תא T עגול ומושלם יהיה ערך מעגלי גבוה ואילו תאים מקוטבים מוארכים יציג מדד מעגלי נמוך. - כתוצאה מכך, ליצור היסטוגרמה אחרת שתדווח על הערכים של התכונה המעגליות מהתאים מגודר בעבר. השתמש היסטוגרמה זו עלילה ישירות ההפצה של פרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי השווי של המעגליות לכל תא בודד.
- כאשר מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור תאים-מגורה עישון, לצייר שער לתאים מקוטבים, החל משעת הערך המעגלי הנמוך ביותר עד לגובה שווי הגבול המעגלי שבו רוב תאי מגורה שאינוהם זממו. תראו את תצוגת הנתונים הסטטיסטיים עבור אחוז התאים מקוטבים בקרב האוכלוסייה הנשלטת (% מגודרים).
הערה: יש לנו קבוצת השער הזה לערכי מדד מעגליים להלן 13. - כדי להסתכל על הקיטוב של ההכתמה אקטין בתאים, העלילה היסטוגרמה לערך הדמיון R3 פרט מואר, השוואת צביעת HLA-ABC (ערוץ 2) ומכתים phalloidin (ערוץ 4).
הערה: גדולה יותר את הערך של תכונה זו, יותר גבי שני stainings הן. - שימוש באותה האסטרטגיה gating כמו קודם, עלילה שער על תאי מגורה שאינו לצביעה הנפרדת המציגה את אחוז התאים עם כתמים אקטין מקוטבים.
- כאשר יושלם, אחוז התאים מציג הפרדה בחלוקת MHC Class I וstainings phalloidin, אחוז התאים מקוטבים יחד עם הערכים הממוצעים של המדדים מעגליים ודמיון של כל התאים ± SD מוצג בcorrespלוחות סטטיסטיקת onding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדוגמא הראשונה שנבחרה כאן נוגעת לשימוש בלימפוציטים מסוג T האנושי העיקרי מגורה עם CCL19. עם זאת, באותה האסטרטגיה ניתן להשתמש בתאי עכבר העיקרי T, שורות תאי T או כל סוג תא אחר מגיב לגירוי chemokine. אסטרטגית gating מוצגת כאן כוללת סדרה של חלונות שבחר את האירועים ממוקדים, אז תאים בודדים. לבסוף הטווח של עוצמת הקרינה ואחריו כאן כדוגמא על שני סמנים: MHC Class I HLA-ABC ויקטינו פילמנטיות למנוחה (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T.
ראשון, המדד המעגלי נמדד במטופל (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T. העובדה שיש לי תאי מנוחה שיא יחיד גדול עם ערך מדד מעגלי גבוה מצביעה על כך שרוב התאים קרובים לסיבוב. עם זאת, ברור כי גירוי CCL19 מעורר את המראה oתת-אוכלוסיית fa השנייה של תאים עם מדד מעגלי נמוך. תת-אוכלוסייה זו כוללת תאים שאימצו מורפולוגיה מקוטבת. כמו כן, כאשר מייצגים את פרט מואר מדד הדמיון בין HLA-ABC וצביעת F- אקטין, ניתן לראות כי חלק מהתאים להציג ירידה בערכו של מדד זה על טיפול CCL19, צוין כי שני הסמנים להראות דרגה נמוכה יותר של שיתוף לוקליזציה . מעניין, מהנקודה-החלקות שהוצגו בעבר, ניתן למקם בסמן על כל נקודה מסוימת כדי לקבל תמונה של התא המורכב מתמונת brightfield ותמונה לכל אחד מstainings ביצע. איור 3 ובכך מציג דוגמאות של CCL19 מגורה T לימפוציטים שנופלים בשער של מקוטב שאינו (איור 3 א) או תאים מקוטבים (איור 3). אחד יכול לדמיין בבירור את ההבדלים במורפולוגיה בין שני האוכלוסיות. מטבלאות הנתונים הסטטיסטיים מתחת להיסטוגרמות המעגלי מאיורים 1 2, אחד יכול לתכנן את אחוז התאים שנופלים בשער המקוטב בהעדר או הנוכחות של CCL19 (איור 3 ג). כצפוי, זה ברור שגירוי chemokine מגדיל את אחוז תאי T המקוטב (11.2% ל50.6%). אפשר גם לתכנן את המדד המעגלי הממוצע של האוכלוסייה כל התא שהושגה בשני התנאים (איור 3D). גירוי CCL19 מעורר ירידה במדד זה. עם זאת, כפי שרק חצי מהתאים מקוטבים, השינוי במדד המעגלי הממוצע שנצפה על גירוי CCL19 הוא קטן.
באופן דומה, איור 4 מייצג דוגמאות של תאי מגורה CCL19, שבי stainings שני HLA-ABC ו- F- אקטין לעשות (איור 4 א) או לא colocalize (איור 4). מטבלאות הנתונים הסטטיסטיים מתחת להיסטוגרמות דמיון פרט מוארת מוצגים איורים 1 ו -2, ניתן לקבל הפרופורציהשל תאים שמציגים ערך מדד מתחת 1.5, המייצג את התאים שמפגינים מידה נמוכה מאוד של שיתוף לוקליזציה בין HLA-ABC ו- F-אקטין. איור 4C מראה כי החלק היחסי של תאים שנופל בעליות השער הזה על גירוי CCL19 ( מ -3.4% ל -13.9%). איסוף ערכי המדד עבור כל תא בודד, אפשר גם לתכנן את מדד הדמיון הממוצע פרט מואר של האוכלוסייה כל התא שהושגה בשני התנאים (איור 4D). CCL19 מעורר ירידה במדד, לעומת זאת, מאותן סיבות כמו בעבר, שינויים קטנים. על ידי הסתכלות על התמונות של התאים המתאימים, נראה כי ירידה זו בHLA-ABC - F-אקטין שיתוף לוקליזציה היא בעיקר בשל האשכולות של F-אקטין בקוטב אחד של התא. לעומת זאת, חלוקת subcellular של מולקולות HLA-ABC MHC Class I לא נראית להיות מושפעת באופן בוטה על ידי גירוי CCL19.
זו הסיבה מדוע החלטנו הבא כדי לבדוק נוסףהמתודולוגיה על ידי ניתוח שני סמנים (F- אקטין וphospho-ERM) ידועים להפריד בהתנגדות קטבים של תאי T-מגורה chemokine. תאי T האנושי מגורה עם CXCL12 מקוטבים מאוד, כלכמת באיור 5 א 'עם אותה אסטרטגית gating מאשר לפני (מ5.95% לתאים מקוטבים 79.10% לאחר 8 דקות של גירוי עם 50 ng / mL CXCL12). בתנאים אלה, יש ירידה חזקה במדד דמיון פרט מואר הממוצע כפי שמוצג באיורי 5 ו5D, כלומר F- אקטין וphospho-ERM colocalize פחות לאחר גירוי CXCL12. כצפוי, אחוז התאים מציגים הפרדה של הסמנים שנבחרו כאן הוא גבוה יותר (48%, איור 5 ג), בהשוואה לאלה שלמדו בעבר (14%, איור 4C). בהתאם לכך, הירידה במדד הדמיון הממוצע של כל מצב היא גם יותר ברורה (איור 5D). לכן, טכניקת cytometry זרימת הדמיה שהוצגה כאן הוא suitable לכמת את מידת שיתוף הלוקליזציה של שני stainings במסגרות שונות.
לבסוף, החלטנו להמחיש עד כמה ההפרעות של כמה אלמנט cytoskeletal או מסלול איתות הידוע להשפיע שינויים במורפולוגיה של תאי T על גירוי chemokine, ניתן היה למדוד על ידי ההדמיה cytometry זרימה. תאי הבקרה T הושוו ראשון עם כמה קודם לכן בתרופה משבש אקטין latrunculin (איור 6 א). תאים היו מגורה עם CXCL12, מוכתמים בphalloidin הניאון ונותח על ידי ההדמיה cytometry זרימה. היסטוגרמות מראה את עוצמת הגלם מקס Pixel של הכתמת F- אקטין מוצגת עבור שני אוכלוסיות התאים (איור 6 א, למעלה). כצפוי מפעילות ניתוק latrunculin כלפי סיבי אקטין, את עוצמת מכתים phalloidin נמוכה בתאים אלה (פנל מימין) לעומת שליטת לימפוציטים מסוג T שטופל ברכב DMSO (פנל משמאל). יתר על כן, latrunculin-TRתאי T eated תערוכת מדד מעגלי גדול מצביע על כך שהם נשארים עגולים יותר תאי ביקורת (איור 6 א, למטה). זה ניתן לכמת בשער שנקבע בהיסטוגרמות כדי למדוד את אחוז התאים כי תערוכת שינויים מורפולוגיים. למרות 32% מתאי שליטה לקבל מקוטבים במצב זה, רק 10% מlatrunculin T -treated ימפוציטים תערוכה כל שינויי צורה (איור 6). לכן, הוא מוצג כאן, כי תזרים ההדמיה cytometry הטכנולוגיה מתאים כדי למדוד הבדלים בשינויים מורפולוגיים כאשר אחד לומד את ההשפעה הפוטנציאלית של כמה אלמנטי cytoskeletal בתופעה זו.
שנית, רכישת מספר גדול של תאים בשיטה זו גם פותחת את האפשרות לנתח במהירות תת קטן של תאים הנוכחיים כמיעוט. באיור 7, דוגמא מוצגת בי הניתוח שלנו הוא מוגבל באופן ספציפי להתנהגותם של תאי T שיתוף transfected עם GFP יחד עם פלסמידים קידוד למוטציות שליליות דומיננטיות של מתחם קוטביות Par6 / PKCζ. היסטוגרמה המתאימה לתאים-transfected לא אפשרה לנו השער באופן ספציפי על GFP הרלוונטי + תאי T (איור 7 א, משמאל). העצמה של ה- GFP נמדדת כהיסטוגרמות שלכמת את ההפצה של עוצמת הקרינה של הערוץ 2 אכן מראה כי רק חלק קטן של האוכלוסייה כל התא כבר transfected (איור 7 א). מידת הקיטוב מורפולוגי של תאי transfected אלה הייתה אז לכמת על ידי המדידה רק מדד המעגליות של GFP התאים + (איור 7). שער נוסף לתאי T המציגים ערכים נמוכים של המעגליות אפשר הערכה של אחוז התאים מקוטבים בכל מצב (איור 7 ג). התוצאות מראות כי הפרעה של הפונקציה של מסלול Par6 / PKCζ האיתות בלמה polarizati תא Tעל הנגרם על ידי שני כמוקינים CCL19 וCXCL12, בקנה אחד עם הממצאים הקודמים שלנו 7.
איור 1. תוצאות מכתים מגורה שאינו נציג בתאי T האנושי ראשוניים. הפנל העליון השמאלי מציג את לחלק מחדש היסטוגרמה של צבע RMS מחושב עם מסכת M01 על תמונות שדה בהירות (ערוץ 1). הפנל הימני העליון מציג את האזור של מסכת M01 נשחקה של 2 פיקסלים, המבוססת על תמונות brightfield (ערוץ 1) של התאים בפוקוס מגודר מהעלילה הקודמת. לוחות האמצע להראות ערכי הגלם מקס Pixel של שני stainings HLA-ABC וPhalloidin (ערוצי 2 ו -4, בהתאמה) או כ( פנל משמאל) עלילת נקודה או כהיסטוגרמות (באמצע ולוחות מימין) עבור הפרט, ב- להתמקד תאים שנבחרו בשלב הקודם. מאוכלוסייה זו של תאים בודדים, בפוקוס עם כתמים נכונים, מחושב התכונה המעגליות על מסכת M02 נשחקה של 2 פיקסלים של הכתמת HLA-ABC (פנל שמאלי תחתון) ותכונת הדמיון R3 פרט מואר (פנל ימני תחתון) מראה את מידת הדמיון בין HLA-ABC וstainings Phalloidin . לשתי חלקות אלה האחרונים, סטטיסטיקה מצביעה על לחלק מחדש של האוכלוסייה (% מגודרות, אומרת של התכונה, SD) מצוינים בטבלה שלהלן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תוצאות מכתים נציג בתאי T האנושי ראשוני מגורה עם 200 מיליליטר CCL19 / ng במשך 8 דקות אסטרטגית פריסת הלוח וgating זהה לאיור 1.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות המעמד המורפולוגי של לימפוציטים מסוג T מגורה על ידי CCL19. (A, B) דוגמאות של תאים מהאיור 2 בחוץ או בשער "המקוטב", בהתאמה (C) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T המקוטב המתקבלים בהעדר CCL19. (איור 1, -) או עם 200 ng / מיליליטר CCL19 (איור 2, +) היסטוגרמה (D) המייצגת את הערכים הממוצעים של המדד המעגלי ± SE באדם, אוכלוסיית תאים בפוקוס בהעדר. (-) או הנוכחות (+) של CCL19. *** P <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. כימות מידת שיתוף הלוקליזציה בין HLA-ABC וstainings phalloidin. (A, B) דוגמאות של תאים מהאיור 2 בחוץ או בשער "לא colocalized" מהפרט מואר היסטוגרמה דמיון, בהתאמה. (ג) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T שאינה מראים שום שיתוף לוקליזציה בין שני הסמנים בבלתי מגורה (-). או (+) תנאי מגורה CCL19 היסטוגרמה (D) המייצגת את הערכים הממוצעים של מדד דמיון ± SE באדם, אוכלוסיית תאים בפוקוס בהעדר (-) או הנוכחות (+) של CCL19. *** P <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
p-together.within-page = "תמיד"> 
איור 5. ניתוח של F-אקטין - הדרת phospho-ERM על גירוי CXCL12 של תאי T עיקריים אנושיים. אחוז () של תאי T מקוטבים בהעדר או הנוכחות של CXCL12 (10 או 50 ng / mL). (ב) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות מראה לחלק מחדש של הפרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי מדד דמיון פרט מואר כימות שמשווה את היקף שיתוף הלוקליזציה בין stainings phospho-ERM וphalloidin, בהעדר CXCL12 או עם 10 ng / ml או 50 ng / ml CXCL12. (C) של חלקם של תאים שאינה מראים שום שיתוף לוקליזציה של פרם וstainings phalloidin בתאי T מגורה או לא עם CXCL12. כימות (D) של הערכים הממוצעים של מדד דמיון ± SE בכל מצב. *** P <0.001.להעלות / 52,140 52140fig5large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפקט איור 6. של פילמור אקטין על קיטוב תא T. () F-אקטין עוצמת מכתים (לוחות העליונים) ומעגלי (לוחות נמוכים יותר) של תאי T אנושיים הראשוניים שטופלו בLatrunculin (500 ננומטר, 30 דקות) או DMSO ולאחר מכן מגורה עם 100 ng / ml CXCL12 במשך 8 דקות. ( B) היסטוגרמה המציגה את אחוז תאי T המקוטב שטופלו בDMSO או Latrunculin לאחר 8 דקות של גירוי עם CXCL12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. ביטוי של המוטציה kinase-מת PKCζ או המוטציה N-terminal של בלוקים Par6 קיטוב תא T לאחר טיפול CCL19 או CXCL12. (א) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות מראה את עוצמת הביטוי של ה- GFP, בתאי T העיקרי-transfected הלא או תאי T העיקרי שיתוף transfected עם GFP ווקטור ריק (בקרה) או המוטציה kinase-המת של PKCζ או N-terminal חלק מPar6 (B) זרימת הדמיה cytometry היסטוגרמות המייצגת את מדד המעגליות של אוכלוסיית תאי GFP החיובי מבטא את המבנים השונים ברמה הבסיסית (NS: לא גירוי). או לאחר CCL19 או גירוי CXCL12 (100 / מיליליטר ng במשך 8 דקות ). (ג) כימות של אחוז תאי מורפולוגית המקוטב T מבטאים את המבנים השונים ברמה הבסיסית או לאחר גירוי CCL19 או CXCL12. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר Verשיאון של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות טכנולוגיה האחרונה של זרימת ההדמיה cytometry, אסטרטגית gating מהירה ואינפורמטיבי לנתח אירועים תאיים ומולקולריים הנגרמים על ידי גירוי chemokine מוצג. מניסוי בודד, ניתן לקבל שני סוגים עיקריים של מידע: השינויים במורפולוגיה של תאים הנגרמים על ידי גירוי chemokine והפצת subcellular של חלבונים שונים בתהליך הקיטוב. מעניין, ראיות היא גם סיפקו לאפשרות לנתח מספר גדול של תאים, המאפשר חוסן סטטיסטי וניתוח רלוונטי של חלק קטן של האוכלוסייה כל התא. כפי שדווח, טכניקה זו יכולה לשמש גם לניתוח אירועים חלוקה מחדש מולקולריים בהקשר של סינפסה החיסונית 12. בנוסף, להגדיר דומה כבר נעשה שימוש בתאי T-מגורה SDF1 אבל אין ניתוח של מידת שיתוף לוקליזציה בין שני סמנים כבר סיפק 13.
למרות שכך טכניקה זו יכולה להיות מתאימה לסוגים רבים של תאים, תאים חסיד לא ניתן לנתח באופן ישיר ותאים בתרחיף צריכים להיות קבועים לפני הרכישה. בנוסף למגבלות הפנימיות אלה של המכונה, זה קריטי כדי לשמור על התאים על 37 מעלות צלזיוס, כאשר גירוים. הטמפרטורה היא אכן מפתח להשגת קיטוב תא T הראוי שכן שינויי cytoskeletal, כגון פילמור אקטין שמניע שינויי צורה, הם מאוד תלויים בטמפרטורה. הניסויים שלנו עם latrunculin תאים שטופלו לאשר כי שיפוץ אקטין נאות הנגרם על ידי גירוי chemokine הוא אכן חיוני לתא על מנת להשיג המדינה המקוטבת באופן מלא שלה. בנוסף לנתונים המסופקים כאן עם התרופה הזו, אנחנו גם בדקנו את טכנולוגית cytometry זרימת הדמיה עם לימפוציטים מסוג T אנושי העיקרי transfected עם חלבוני מוטציה המעכבים את מסלול איתות Par6 / PKCζ. באופן עקבי עם התוצאות שפורסמו בעבר שלנו 7, שהוא מופיע כאן כי f המורכבת קוטביות זוavors קיטוב תא T.
על גירוי chemokine, תאי T לאבד מורפולוגיה העגולה לאמץ צורה מקוטבת. מצאנו את הפרמטר המעגלי להיות מדויק ביותר לכמת שינויים מורפולוגיים אלה. עם זאת, פרמטרים אחרים המתארים שינויי צורה מוצעים על-ידי תוכנת הניתוח, כגון יחס הגובה-רוחב או Elongatedness. לכן, אפשר בקלות לבדוק את תרומתו של מסלול איתות מסוים או חלבון מסוים בתהליך זה.
במחקר זה, יש לנו תמיד ציין כי אחוז התאים מציגים קיטוב מורפולוגיים גבוה מהאחד לקיטוב מולקולרי. זה מצביע על כך שחלק יחסי של תאים לאמץ שינוי במורפולוגיה אינו מציגה הפצות חוזרות מולקולריות גדולות של הסמנים למד. זה יכול לנבוע מכך שחלק מהתאים מאבדים את הצורה העגולה שלהם, כך הם מפגינים מדד מעגלי נמוך אם כי הם לא מראים בבירור leadinקצה g וuropod. תאי T מקוטבים חלקית אלה עדיין יכולים ליפול בשער של תאי T מורפולוגית מקוטבים ללא הצגת הפצות חוזרות מולקולריות ברורות של סמנים אופייניים. יתר על כן, הבדלים בסף איתות chemokine שיכולים להיות גבוהים יותר עבור סמנים חלוקים מחדש מאשר לשינויי צורה גם יכול להסביר את ההבדלים האלה.
כמו כן מוצג כאן שסמן HLA-ABC לא relocalized בתאי T מקוטבים ואין כל שינוי בעוצמת צביעה זו על גירוי CCL19. לעומת זאת, אישור הניתן כאן כי עליית צביעת F- אקטין על טיפול CCL19 (איורים 1 ו -2) כידוע כבר, מאז גירוי chemokine מפעיל פילמור אקטין 5. יתר על כן, הוא הראה כי סיבי אקטין לקבל relocalized בחלק הקדמי של תאים מקוטבים. כתוצאה מכך, מדד דמיון פרט מואר המודד את מידת שיתוף הלוקליזציה בין שני markers נוטה לרדת על גירוי CCL19. לשם השוואה, ניתוח כזה מסופק כאן לקבלת תואר F- אקטין שיתוף לוקליזציה עם חלבוני phospho-ERM כי לקבל נכלל בחזית התא. אחוז תאי T-מגורה chemokine מציגים F- אקטין - MHC Class I הפרדה הוא נמוך בהרבה מהאחד לF- אקטין - phospho-ERM (לעומת 14% -48%, בהתאמה) מאז relocalizes F- אקטין בחזית ו חלבוני phospho-ERM בחלקו האחורי של תאי T מקוטבים, ואילו לחלק מחדש של מולקולות MHC Class I אינו מושפע מגירוי chemokine. מדד דמיון פרט מואר זה יכול לשמש באופן שיטתי ובכך להשוות את החלוקה של שני סמנים בתאי T מקוטבים. לכן, טכניקה זו היא מתאימה מאוד לכמת את מידת שיתוף הלוקליזציה או עמיתים להרחקה של שני סמנים שונים על מספר גדול של תאים או, באופן פוטנציאלי, באירועים נדירים קיימים באוכלוסיית תא רחבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים מאוד פייר Bourdoncle, תומאס גילבר ולואיז Rimbault של מתקן קוצ'ין ההדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, CNRS וליגת העל לאומי contre le הסרטן (labellisée Equipe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
