Abstract
Celler reagerer på kjemokin stimulering ved å miste sin runde form i en prosess som kalles polarisering, og ved å forandre subcellulære lokalisering av mange proteiner. Klassiske avbildningsteknikker er blitt brukt til å studere disse fenomenene. Imidlertid kreves de manuell anskaffelse av mange celler, etterfulgt av tidkrevende kvantifisering av morfologien og ko-lokalisering av flekker på flere titalls celler. Her blir en hurtig og kraftig metode som er beskrevet for å studere disse fenomenene på prøver bestående av flere tusen celler ved hjelp av en avbildnings flowcytometri teknologi som kombinerer fordelene med et mikroskop med de av en cytometer. Ved hjelp av T-lymfocytter stimulert med CCL19 og farging for MHC klasse I molekyler og trådformede aktin, er en gating strategi presenteres for å måle samtidig graden av form endringer og omfanget av samlokalisering av markører som er berørt av CCL19 signalering. Dessuten, denne gating strategien tillatt oss å Observe segregering av trådformede aktin (foran) og fosforylert ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteiner (bak) i polariserte T-celler etter CXCL12 stimulering. Denne teknikk ble også nyttig for å observere den blokkerende virkning på polarisasjonen av to forskjellige elementer: inhibering av aktin polymerisasjon av en farmakologisk inhibitor og ekspresjon av mutanter av Par6 / atypisk PKC signalveien. Således er bevis vist at denne teknikken er nyttig for å analysere både morfologiske endringer og protein Videredistribueringer.
Introduction
Kjemokiner er små løselige proteiner som tiltrekker cellene til spesialiserte steder en. Derfor, deltar de i riktig posisjonering av celler i vev, en viktig funksjon i utvikling og fysiologi. Immunsystemet er ikke noe unntak fra denne regelen som det er avhengig av handlingen av mange forskjellige celletyper som fungerer sammen for å montere en effektiv immunrespons. Ved å kontrollere den bestemte plasseringen av en immuncelletype i en gitt tilstand, kjemokiner er forhånds nødvendig før fremmede antigener kan oppdages og nøytraliseres.
I T-lymfocytter i særdeleshet, kjemokiner binde seg til spesifikke overflatereseptorer som ved engasjement, lokke fram mange intracellulære signaler (kalsium stige, ERK fosforylering, Rho GTPases aktiverings, økning i inte affinitet og cytoskeletal endringer) som favoriserer T cellemotilitet 2,3. På cellenivå, kan man observere morfologiske forandringer fremkalt på chemokine stimulering.Disse endringene i celleformer er spesielt dramatisk i T-celler: hvilende T-celler har en perle-lignende runde morfologi når du reiser i blodet. Imidlertid er avføling av tilstedeværelsen av kjemokiner i inflammatoriske seter eller i nærhet av lymfoide organer kommer til å endre formen av T-celler som nå innta en typisk "hand-speil" morfologi bestående av en bipolar form: en ledende kant på forsiden og en bakkant, eller uropod, på baksiden 4. I tillegg kan intracellulære komponenter skiller seg i de to motstående områder av en polarisert T-celle for å opprettholde migrasjon. For eksempel actinfilamenter polymerisasjons- øker ved kjemokin stimulering 5 og polymerisert aktin akkumuleres på forsiden av en polarisert T-celle-2. På den annen side er flere proteiner, slik som fosforylerte proteiner av ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie som knytter plasmamembranen til det kortikale F-aktin cytoskjelettet, re-lokalisere ved uropod av polarisertT-celler 6. Interessant nok har vi og andre vist at denne polariseringsprosess er nødvendig for T-cellemigrering. Faktisk vil noen behandling som forstyrrer polarisering hemme cellulær motilitet. For eksempel, hemming av aktiviteten av medlemmene av den atypiske proteinkinaser C (PKC) familien, PKCζ og PKCι blokkerer T-celle-polarisasjon og deres vandrings skanningen av dendrittiske celler 7. T-celle polarisering er også regulert av Rho GTPases. Vi har vist at moduleringen av RhoA aktivitet ved den nylig beskrevne Fam65b protein griper med T-celle-forandringer i morfologi og deres evne til å migrere i en Transwell assay 6. Som polarisasjonen er en forutsetning trinn for cellulær motilitet, er det således viktig å være i stand til å kvantifisere det en hoved utlesning av chemokin-responser. Celle form endringer ble tidligere målt manuelt 8. Imidlertid, denne type kvantifisering er svært tidkrevende, slik at det vanligvis bare noentitalls celler blir tatt hensyn til.
Her blir en ny fremgangsmåte presentert for raskt å kvantifisere graden av form forandringer av T-lymfocytter som er utsatt for kjemokin stimulering. En bilde flowcytometri-teknologi (se tabell av spesifikke reagenser / Utstyr) brukes, som kombinerer fordelene med et strømningscytometer og et mikroskop 9 for å kvantifisere effektivt mengden av polariserte celler i forskjellige tilstander av kjemokin stimulering. I tillegg til kvantifisering av de morfologiske forandringer som man kan måle robust med denne teknologien er det også mulig å evaluere endringer i den subcellulære lokalisering av noen proteiner ved kjemokin signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av T-lymfocytter
- Forberede primære mus eller humane T-celler som beskrevet 10,11.
- Dyrke humane T-celler i komplett RPMI-medium med 10% humant serum AB med en tetthet på 2-3 x 10 6 celler / ml.
MERK: Bruken av føtalt kalveserum (FCS) i stedet for humant serum kan fremkalle spontan polarisering av en stor fraksjon av humane T-celler i kultur. Oppbevar disse cellene i kultur for 4-5 dager og videre prosess dem når som helst i løpet av denne perioden. - Oppretthold mus T-celler i komplett RPMI-medium supplert med 10% FCS ved en tilsvarende celletetthet. Bruk med en gang, eller den neste dagen, etter et O / N kultur ved 37 ° C i nærvær av 10 ng / ml IL7.
- Dyrke CEM human T-cellelinje i fullstendig RPMI supplert med 10% FCS.
2. kjemokinet Stimulering
- Vask 5 x 10 5 celler pr eksperimentell tilstand i varmt HBSS medium supplert med 10 mM Hepes. For noen eksperimenter, ko-transfektere primære humane T-celler dagen før med 2 ug pmaxGFP og 8 ug pcDNA3.1 (+ tom vektor, kontroll), PKCζ kinase død, eller N-terminale Par6 plasmider.
- Resuspender cellepelleten i varm HBSS-Hepes-medium (bruke 0,3 ml x antall eksperimentelle betingelser).
- Distribuere cellene i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Derfor vil et rør som tilsvarer en enkelt eksperimentell tilstand inneholder 5 x 10 5 celler i 0,3 ml HBSS-Hepes-medium. For noen eksperimenter, tilsett 500 nM Latrunculin A eller vehikkel (DMSO) og inkuberes cellene i 30 minutter før kjemokin stimulering. - Legg 10 til 500 ng / ml CCL19 eller CXCL12 kjemokin i hvert rør.
MERK: Vi bruker vanligvis 10-200 ng / ml chemokine for humane T-celler. CEM-celler uttrykker ikke CCR7 reseptoren som binder CCL19. Derfor vil CEM-celler bare være i stand til å svare på en CXCL12 stimulering. Videre bruke høyere chemokin konsentrasjoner (300-500 ng / ml) for å polarisere mus-T-celler. - Flip rørene flere ganger og inkuber dem i et 37 ° C vannbad i 8 eller 10 min for primære T-celler eller CEM, respektivt.
- Stopp polarisasjon prosessen ved at det til hvert rør 0,3 ml av en varm oppløsning inneholdende 2% paraformaldehyd (PFA) og 10 mM HEPES i PBS. Flip rørene og inkuber dem ved 37 ° C i 5 min.
3. stainings
- Overfør cellene fra mikrosentrifugerør å flowcytometri rør.
- Fylle rørene helt med en RT-løsning inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA), 0,5 mM EDTA og 10 mM Hepes, i PBS.
- Sentrifugere rørene ved 460 xg i 4 min.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 100 pl av en RT-løsning inneholdende 5% FCS i PBS.
- Tilsett 5 ul av FITC-anti-HLA-ABC i hvert rør, vortex dem, og inkubere dem i 30 minutter ved RT, borte fra lys.
- Vask celler en gang med PBS inneholdende 5% FCS, ennd en gang med kun PBS.
- Ved RT: tilsett 500 ul 1% PFA, inkuber i 10 min, deretter vaske cellene med en oppløsning inneholdende 1% BSA, 0.5 mM EDTA og 10 mM HEPES i PBS.
- Kast supernatanten, fyll rørene helt med en oppløsning av PBS inneholdende 0,2% BSA, 0,1% saponin, 0,5 mM EDTA og 10 mM Hepes (permeabilization buffer).
- Vask cellene to ganger i dette medium.
- Flip rørene for å fjerne mediet og virvle dem til å dissosiere cellepelleten.
- Legg til 0,25 ug / ml TRITC-Phalloidin og / eller en 1: 100 fortynning av anti-P-ERM antistoff til hvert rør, vortex dem og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene med permeabilization buffer. Inkuber med et fluorescerende sekundært antistoff dersom det er nødvendig.
- Suspender cellene i 200 mL PBS og overføre dem til mikrosentrifugerør.
MERK: Cellene er klar for overtakelse. Alternativt, samtidig som en maksimal totalvolum på 200 ul per rør, tilsett konsentrert PFA til en slutt 1%konsentrasjon for å bevare stainings hvis cellene ikke skal brukes samme dag for videre behandling.
4. Bilder Oppkjøp og analyse
- Slå på apparatet (se tabell over spesifikke reagenser / utstyr) og la den kalibrerer seg selv i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: INSPIRE programmet ble brukt med en 40X objektiv (0.75 NA). Ideene 3.0-programvare ble brukt for alle de rapporterte quantifications. - Forberede en serie av oppkjøps vinduer som kan lagres i en mal for fremtidige eksperimenter. Tegne histogrammer som kvantifiserer RMS graderings verdier. Fra "I fokus" befolkning, valgt på RMS gradient histogram, delimitate "Single celle" befolkning på et histogram av området. Når mikrosentrifugerør er satt inn i maskinen, kan du justere laser makt, gate på individuelle celler og skaffe 5000 T-lymfocytter.
- I Ideer mykeware, åpner oppkjøpet filen og opprette et histogram som viser verdien av gradient RMS verdi for lyse feltet bilder (Kanal 1) oppnådd for hver enkelt celle. Tegn en gate på RMS gradient histogram som vurderer celler som viser RMS gradient verdi over 57.
MERK: RMS gradient tillater å ta hensyn til i analysen bare de T-lymfocytter som er i fokalplanet. Vi har bestemt empirisk at enkeltceller som oppviser en RMS-gradient verdi overlegen til 57 er i det sentrale plan, og kan bli nøyaktig betraktet. - I Analyse / Masker meny, lage en ny maske, kalt Erode (M01,2) fra morfologi maske på lysfelt bildene M01, erodert av to piksler. Deretter, i Analyse / Funksjoner meny, oppretter en ny funksjon i området, beregnet på Erode (M01,2) maske. Fra cellene som er valgt i forrige gate, åpne et histogram som viser området av celler ved hjelp av denne nyopprettede maske.
MERK: morfologi masker som er tilgjengelige vedStandard er mye større enn den faktiske størrelsen av cellen. Således er det mer nøyaktig å erodere det opp til 2 piksler. - Tegn en gate på de individuelle T-celler, unntatt perlene kalibrerings og rusk (liten Area) og dubletter (stort område). Justere denne gate ved hvert kjøp.
MERK: Variasjoner i cellestørrelse vil påvirke posisjonen til porten. Som mus T-celler er mindre enn humane T-celler som i seg selv er mindre enn CEM-celler, vil arealet av hver celletype være proporsjonal med dens størrelse. - Tatt i betraktning de single, i-fokus celler som ble gated på de forrige trinnene, åpne et prikkplott som består av Raw Max Pixel på HLA-ABC flekker (Kanal 2, x-aksen) som en funksjon av Raw Max Pixel på phalloidin farging (Kanal 4, y-aksen). Lag en gate for å utelukke de ufargede eller mettede fluorescerende hendelser. Åpne to histogrammer viser Raw Max Pixel for HLA-ABC (Kanal 2) og phalloidin (Channel 4) stainings.
- I Analyse / Masker meny, Createa ny maske, kalt Erode (M02,2) fra morfologi maske av HLA-ABC fargede celler (kanal 2), erodert av to piksler. Deretter, i Analyse / Funksjoner meny, oppretter en ny funksjon som består av sirkulariteten parameter, beregnet på Erode (M02,2).
MERK: Denne parameteren måler avviket av cellen form fra en sirkel. Derfor vil en perfekt runde T-celle har en høy sirkularitet verdi mens langstrakte polariserte celler vil vise en lav sirkularitet indeks. - Deretter oppretter et annet histogram som rapporterer verdiene av sirkularitet funksjonen fra de tidligere gated celler. Bruk av dette histogram for direkte å plotte fordelingen av en individuell, i-fokus-cellepopulasjonen i henhold til verdien av det sirkel for hver enkelt celle.
- Ser på formen på histogrammet for ikke-stimulerte celler, tegne en gate for polariserte celler, som starter på det laveste sirkularitet verdi opp til sirkularitet grenseverdien hvor de fleste av de ikke-stimulerte cellerplottes. Se på statistikken display for prosentandelen av polariserte celler blant gated befolkningen (% Gated).
MERK: Vi har satt denne porten for sirkularitet indeksverdier under 13 år. - For å se på polarisasjonen av aktin farging i cellene, plotte et histogram for Bright Detalj Likhets R3 verdi, å sammenlikne den HLA-ABC-farging (kanal 2) og phalloidin farging (kanal 4).
MERK: Jo større verdien av denne funksjonen, jo mer oppå de to stainings er. - Ved bruk av samme portstyringsstrategi som før, plotte en port på de ikke-stimulerte celler for segregerte farging som viser prosentandelen av celler med polarisert aktin farging.
- Når dette er gjort, er prosentandelen av celler som oppviser et segregering i fordelingen av MHC klasse I og phalloidin stainings, prosentandelen av polariserte cellene sammen med de midlere verdier av sirkularitet og Likhet indeksene til alle cellene ± SD er vist i corresponding statistikk paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første eksempelet valgt her dreier seg om bruk av humane primære T-lymfocytter stimulert med CCL19. Imidlertid kan den samme strategi anvendes med primær mouse T-celler, T-cellelinjer eller hvilken som helst annen celletype som reagerer på kjemokin stimulering. Gating strategi presenteres her inkluderer en rekke vinduer som velger de fokuserte hendelser, deretter enkeltceller. Endelig omfanget av fluorescensintensitet ble fulgt her som et eksempel på to markører: MHC klasse I HLA-ABC og filamentøs aktin for hvilende (figur 1) eller i CCL19-stimulert (figur 2) T-lymfocytter.
For det første er sirkulariteten indeksen målt i ubehandlet (figur 1) eller i CCL19-stimulert (figur 2) T-lymfocytter. Det faktum at hvilende celler har en stor enkel topp med en høy sirkularitet indeksverdi indikerer at de fleste cellene er nær å runde. Det er imidlertid klart at CCL19 stimulering utløser utseendet ofa andre subpopulasjon av celler med lav sirkularitet indeks. Denne undergruppe omfatter celler som har vedtatt en polarisert morfologi. Også, når som representerer Bright Detail Likhet indeksen mellom HLA-ABC og F-aktin flekker, kan man observere at noen celler vise et fall i verdien av denne indeksen på CCL19 behandling, noe som indikerer at begge merkene viser en lavere grad av samlokalisering . Interessant, fra dot-plot presentert tidligere, kan man plassere markøren for på en hvilken som helst bestemt punkt for å få et bilde av cellen består av et lysfelt bilde og et bilde for hver av de stainings utført. Figur 3 viser således eksempler på CCL19 stimulerte T lymfocytter som faller i porten av ikke polarisert (figur 3A) eller polarisert (Figur 3B) celler. Man kan tydelig se forskjeller i morfologi mellom begge undergruppene. Fra statistikk tabellene nedenfor sirkulariteten histogrammer fra figur 1 2, kan man plotte den prosentandel av celler som faller i det polariserte porten i fravær eller nærvær av CCL19 (figur 3C). Som forventet, er det klart at kjemokin stimulering øker prosentandelen av polariserte T-celler (fra 11,2% til 50,6%). Man kan også plotte den midlere sirkularitet indeks over hele cellepopulasjon oppnådd i begge forhold (Figur 3D). CCL19 stimulering utløser et fall i denne indeksen. Men da bare halvparten av cellene er polarisert, er endringen i gjennomsnittlig sirkularitet indeksen observert ved stimulering CCL19 liten.
Tilsvarende figur 4 representerer eksempler på CCL19-stimulerte celler, der både HLA-ABC og F-aktin stainings gjøre (figur 4A) eller ikke colocalize (figur 4B). Fra statistikk tabellene nedenfor de Bright Detalj Likhet histogrammer vist i figur 1 og 2, kan man få andelenav celler som viser en indeksverdi under 1,5, som representerer de cellene som viser en svært lav grad av samlokalisering mellom HLA-ABC og F-aktin. Figur 4C viser at brøkdel av celler som faller i denne porten øker ved CCL19 stimulering ( fra 3,4% til 13,9%). Oppsamling av de verdier av indeksen for hver enkelt celle, kan man også plotte den midlere Bright Detalj Likhets indeks over hele cellepopulasjon oppnådd i begge forhold (Figur 4D). CCL19 utløser et fall i indeksen, men av samme grunn som tidligere, endringene er små. Ved å se på bilder av de tilsvarende celler, ser det ut til at denne reduksjonen i HLA-ABC - F-aktin co-lokalisering er hovedsakelig på grunn av opphopning av F-aktin i en pol av cellen. Motsatt subcellulært distribusjon av HLA-ABC MHC klasse I molekyler synes ikke å være grovt påvirket av CCL19 stimulering.
Det er grunnen til at vi neste besluttet å teste videremetodikken ved å analysere to markører (F-aktin og fosfo-ERM) er kjent for å segregere i motsatte poler av kjemokin-stimulerte T-celler. Human-T-celler stimulert med CXCL12 polarisert sterkt, så kvantifisert i figur 5A med den samme portstyringsstrategi enn før (fra 5,95% til 79,10% polariserte cellene etter 8 min på stimulering med 50 ng / mL CXCL12). Under disse forhold, er det en sterk reduksjon i den midlere Bright Detalj Likhets indeks som vist i figurene 5B og 5D, noe som betyr at F-aktin og fosfo-ERM colocalize mindre etter CXCL12 stimulering. Som forventet, var prosentandelen av celler som oppviser en segregering av markører valgt her er høyere (48%, figur 5C) sammenlignet med de som tidligere er studert (14%, Figur 4C). Følgelig er det reduserte den midlere Likhets indeks av hver tilstand også mer åpenbar (figur 5D). Derfor bilde flowcytometri teknikk presenteres her er suomme å kvantifisere graden av samlokalisering av to stainings i ulike settinger.
Til slutt bestemte vi oss for å illustrere i hvilken grad endringen av noen cytoskeletal element eller signalveien kjent for å påvirke endringer i T cellemorfologi ved chemokine stimulering, kan måles ved bildebehandling flowcytometri. Kontroll T-celler ble først sammenlignet med noen forbehandlet med aktin-forstyrre medikament latrunculin A (figur 6A). Celler ble stimulert med CXCL12, farget med fluorescerende phalloidin og analysert med CCD flowcytometri. Histogrammer som viser Raw Max Pixel intensiteten av F-aktin farging er vist for begge cellepopulasjoner (figur 6A, øverst). Som forventet fra oppdelings aktivitet av latrunculin A mot aktin filamenter, intensiteten av phalloidin farging er lavere i disse celler (høyre panel) sammenlignet med kontroll-T-lymfocytter behandlet med kjøretøyet DMSO (venstre panel). Videre latrunculin A-trflere ganger for T-celler utviser en større sirkularitet indeksen indikerer at de forblir rundere enn kontrollceller (figur 6A, nederst). Dette kan kvantifiseres ved en port satt på histogrammene for å måle prosentandelen av celler som fremviser morfologiske endringer. Selv om 32% av kontrollceller få polarisert i denne tilstanden, bare 10% av latrunculin En behandlede T-lymfocytter utstillings noen form endringer (Figur 6b). Derfor er det her vist at avbildnings flowcytometri teknologi er egnet til å måle forskjeller i morfologiske modifikasjoner når man studerer den potensielle effekt av enkelte cytoskeletal elementer i dette fenomen.
For det andre åpner oppkjøp av et stort antall celler med denne metoden også muligheten til å analysere raskt små undergrupper av celler til stede som en minoritet. I figur 7 er et eksempel presenteres hvor analysen er spesielt begrenset til virkemåten av T-celler ko-transfeksjoned med GFP sammen med plasmider som koder for dominant negative mutanter av polariteten kompleks Par6 / PKCζ. Histogrammet som svarer til de ikke-transfekterte celler har gjort det mulig å separere spesifikt på den aktuelle GFP + T-celler (Figur 7A, til venstre). Intensiteten av GFP målt som histogrammer som kvantifisere fordelingen av fluorescensintensiteten av kanalen 2 faktisk viser at bare en liten brøkdel av hele cellepopulasjonen er blitt transfektert (figur 7A). Graden av morfologiske polarisering av disse transfekterte cellene ble deretter kvantifisert ved å måle bare den sirkularitet indeksen av GFP + celler (figur 7b). En ytterligere port for T-celler som oppviser lave verdier av sirkularitet tillot beregning av prosentandelen av polariserte celler i hver tilstand (figur 7C). Resultatene viser at avbrytelse av funksjonen av Par6 / PKCζ signalveien inhibert T-celle polarizatipå indusert av både CCL19 og CXCL12 chemokiner, i tråd med våre tidligere funn 7.
Figur 1. Representative ikke-stimulert flekker resultater på primære humane T-celler. Den øvre venstre panel viser histogram partisjonere av Gradient RMS beregnet med M01 maske på lyse feltet bilder (Kanal 1). Øvre høyre panel viser området av M01 maske erodert av to piksler, basert på lysfelt bilder (kanal 1) av In Focus celler gated fra forrige tomten. De midterste panelene viser Raw Max Pixel verdier av både HLA-ABC og phalloidin stainings (TV 2 og 4, henholdsvis), enten som et prikkplott (venstre panel) eller som histogrammer (midten og høyre panel) for den enkelte, in- fokusere celler valgt på forrige trinn. Fra denne populasjonen av individuelle, i-fokus celler med riktig flekker, beregnes sirkulariteten funksjonen på M02 maske erodert av to piksler av HLA-ABC flekker (nederst til venstre panel) og Bright Detail Likhet R3-funksjonen (nederst til høyre panel) som viser graden av likhet mellom HLA-ABC og phalloidin stainings . For disse to nyeste tomter, statistikk indikerer partisjonere av befolkningen (% inngjerdet, mener av den funksjonen, SD) er angitt i tabell nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Representative fargings resultatene på primære humane T-celler stimulert med 200 ng / ml CCL19 i 8 min Panelet layout og portstyringsstrategi er identisk med figur 1.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering av den morfologiske status av T-lymfocytter stimulert av CCL19. (A, B) Eksempler på celler fra figur 2 utenfor eller i "polarisert" port, henholdsvis (C) histogram som viser prosentandelen av polariserte T-celler oppnådd i fravær av CCL19. (Figur 1, -) eller med 200 ng / ml CCL19 (figur 2, +) (D) histogram som representerer de gjennomsnittlige verdier av indeksen sirkularitet ± SE i enkelte, i-fokus-cellepopulasjonen i fravær. (-) eller nærvær (+) av CCL19. *** P <0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av graden av samlokalisering mellom HLA-ABC og phalloidin stainings. (A, B) Eksempler på celler fra Figur 2 utenfor eller i "ikke colocalized" gate fra Bright Detail Likhet histogram, henholdsvis. (C) Histogram som viser prosentandelen av T-celler som viser ingen samlokalisering mellom begge merkene i un- stimulert (-)., eller CCL19-stimulert (+) betingelser (D) histogram representerer middelverdiene av likheten indeks ± SE i enkelte, i-fokus-cellepopulasjonen i fravær (-) eller nærvær (+) av CCL19. *** P <0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p-together.within-side = "always"> 
Figur 5. Analyse av F-aktin - fosfo-ERM utelukkelse ved CXCL12 stimulering av humane primære T-celler. (A) Prosent av polariserte T-celler i fravær eller nærvær av CXCL12 (10 eller 50 ng / ml). (B) Imaging flowcytometri histogrammer som viser partisjonere av enkelte, i-fokus-cellepopulasjonen i henhold til Bright Detalj Likhets indeks som sammenligner omfanget av ko-lokalisering mellom fosfo-ERM og phalloidin stainings, i fravær av CXCL12, eller med 10 ng / ml eller 50 ng / ml CXCL12. (C) Kvantifisering av andelen av celler som oppviser ingen ko-lokalisering av perm og phalloidin stainings i T-celler stimulert med eller uten CXCL12. (D) Kvantifisering av middelverdiene av likheten indeks ± SE i hver tilstand. *** P <0,001.laste opp / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Effekt av aktin polymerisasjon på T-celle polarisering. (A) F-aktin fargeintensitet (øvre panel) og sirkularitet (nedre paneler) av primære humane T-celler behandlet med Latrunculin A (500 nM, 30 min) eller DMSO og deretter stimulert med 100 ng / ml CXCL12 i 8 min. ( B) Histogram som viser prosentandelen av polariserte T-celler behandlet med DMSO eller Latrunculin A etter 8 min av stimulering med CXCL12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Ekspresjon av PKCζ kinase-død mutant eller den N-terminale mutanten av Par6 blokkerer T-celle-polarisering etter CCL19 eller CXCL12 behandling. (A) Imaging flowcytometri histogrammer som viser ekspresjonen intensiteten av GFP, i ikke-transfekterte primære T-celler eller primære T-celler ko-transfektert med GFP og en tom vektor (kontroll) eller den kinase-død mutant av PKCζ eller den N-terminale del av Par6 (B) Imaging flowcytometri histogrammer representerer sirkularitet indeks av GFP-positive cellepopulasjon som uttrykker de ulike konstruksjoner på basalnivå (NS: ingen stimulering). eller etter CCL19 eller CXCL12 stimulering (100 ng / ml til 8 min ). (C) Kvantifisering av prosentandelen av morfologisk polariserte T-celler som uttrykker de ulike konstruksjoner på basal nivå eller etter CCL19 eller CXCL12 stimulering. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av en ny teknologi for bildebehandling flowcytometri, til en rask og informativ gating strategi analysere cellulære og molekylære hendelser forårsaket av chemokine stimulering er presentert. Fra et enkelt eksperiment, kan man oppnå to hovedtyper av informasjon: endringer i cellemorfologi indusert av chemokin-stimulering og subcellulære fordeling av forskjellige proteiner i løpet av polarisasjonen prosessen. Interessant er også gitt bevis for muligheten for å analysere et stort antall celler, noe som gjør det mulig statistisk robusthet og relevante analyse av en liten brøkdel av hele celle-populasjonen. Som rapportert, kan denne teknikk også anvendes for å analysere molekylomfordelings hendelser i forbindelse med den immunologiske synapse 12. I tillegg er det et lignende sett opp allerede blitt brukt for SDF1-stimulerte T-celler, men ingen analyse av graden av co-lokalisering mellom to markører har blitt gitt 13.
Selv omdenne teknikken kan dermed være egnet for mange celletyper, heftende celler kan ikke direkte analysert og celler i suspensjon må fikses før oppkjøpet. I tillegg til disse iboende begrensninger av maskinen, er det avgjørende å holde cellene ved 37 ° C ved å stimulere dem. Temperaturen er faktisk nøkkelen til å oppnå riktig T-celle-polarisering siden cytoskeletal endringer, slik som aktin polymerisasjon som driver formforandringer, er meget avhengig av temperaturen. Våre eksperimenter med latrunculin A behandlede celler bekrefte at riktig aktin ombygging indusert av chemokine stimulering er faktisk avgjørende for en celle for å oppnå sin fullt polarisert tilstand. I tillegg til de data som er gitt her med dette stoffet, har vi også testet bilde flowcytometri teknologi med menneskelige primære T-lymfocytter transfektert med mutante proteiner som hemmer Par6 / PKCζ signalveien. Konsekvent med våre tidligere publiserte resultater 7 er det vist her at denne polariteten komplekse favors T-celle polarisering.
Ved chemokine stimulering, T-celler mister sin runde morfologi å vedta en polarisert form. Vi har funnet sirkularitet parameter for å være den mest nøyaktige til å kvantifisere de morfologiske forandringer. Men andre parametere som beskriver formen endringer foreslått av analyse programvare, for eksempel sideforholdet eller Elongatedness. Derfor kan en enkelt teste bidraget fra en bestemt signalveien, eller et spesifikt protein i denne prosessen.
I denne studien, har vi alltid observert at andelen av celler som oppviser et morfologisk polarisasjon er høyere enn den for molekyl polarisasjon. Dette indikerer at en brøkdel av celler som vedtar en endring i morfologi ikke presentere store molekylære Redistribusjon av markørene studert. Dette kan oppstå ved at en del cellene mister sin runde form, slik at de utviser en lavere sirkularitet indeksen, selv om de ikke viser klart en leading kant og en uropod. Disse delvis polariserte T-celler kan fortsatt falle i porten til morfologisk polariserte T-celler uten å presentere åpen molekylære Videredistribusjon av typiske markører. Videre forskjeller i kjemokinet signaliserer terskel som kan være høyere for markører omfordeling enn for shape endringer kan også forklare disse forskjellene.
Det er også her vist at HLA-ABC markeringen ikke er relocalized i polariserte T-celler, og det er ingen endring i intensiteten av fargingen på CCL19 stimulering. Motsatt, er en bekreftelse gis her at F-aktin fargings øker ved CCL19 behandling (figur 1 og 2) som allerede er kjent, siden kjemokin stimulering aktiverer polymerisasjon aktin 5. Videre er det vist at actinfilamenter bli relocalized på forsiden av polariserte celler. Følgelig Bright Detail Likhet indeks som måler graden av samlokalisering mellom begge markers tendens til å avta på CCL19 stimulering. Som en sammenligning, er en slik analyse gitt her for graden av F-aktin samlokalisering med fosfor-ERM proteiner som blir ekskludert fra cellen foran. Prosentandelen av kjemokin-stimulerte T-celler som utviser F-aktin - MHC klasse I segregering er mye lavere enn den for F-aktin - fosfo-ERM (14% vs. 48%, respektivt) siden F-aktin relocalizes foran og phospho-ERM proteiner på baksiden av polariserte T-celler, mens repartisjonere av MHC klasse I molekylene ikke er berørt av chemokine stimulering. Dette Bright Detalj Likhet indeksen kan dermed bli systematisk brukt for å sammenligne fordelingen av to markører i polariserte T-celler. Derfor er denne teknikk meget hensiktsmessig å kvantifisere graden av co-lokalisering eller ko-utelukkelse av to forskjellige markører på et stort antall celler eller i verste fall i sjeldne tilfeller er til stede i et bredt cellepopulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne sterkt erkjenner Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert og Louise Rimbault av Cochin Imaging Facility. Dette arbeidet ble støttet av Inserm, CNRS og Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
