Abstract
De studie van eiwit interacties in de context van levende cellen kritische informatie over lokalisatie, dynamiek en interactie partners genereren. Deze informatie is bijzonder waardevol in de context van gastheer-pathogeen interacties. Veel pathogenen eiwitten functioneren in gastheercellen verschillende wijze zoals mogelijk vermijden dat het gastheerimmuunsysteem en overleving binnen het intracellulaire omgeving. Om deze pathogeen-eiwit gastheer-cel interacties te bestuderen, zijn verschillende benaderingen vaak gebruikt, zoals: in vivo infectie met een stam die een getagde of mutant eiwit, of de introductie van pathogeen genen via transfectie of transductie. Elk van deze benaderingen heeft voordelen en nadelen. We zochten een middel om exogene eiwitten direct invoeren in cellen. Elektroporatie wordt vaak gebruikt om nucleïnezuren in cellen te introduceren, maar is minder vaak toegepast om proteïnen hoewel de biofysische basis is precies hetzelfde.Een standaard electroporator werd gebruikt om de affiniteit gelabelde bacteriële effectoren introduceren in zoogdiercellen. Human epitheliale en muis macrofaagcellen werden gekweekt door de traditionele methoden, vrijstaand, en geplaatst in 0,4 cm kloof elektroporatie cuvetten met een exogene bacterieel pathogeen eiwit van belang (bijvoorbeeld Salmonella Typhimurium GtgE). Na elektroporatie (0,3 kV) en een korte (4 uur) herstelperiode, werd intracellulaire eiwit geverifieerd door fluorescent labelen van het eiwit via zijn affiniteitsmerker en onderzoeken van ruimtelijke en temporele verdeling van confocale microscopie. De geëlektroporeerde eiwit werd ook aangetoond functioneel in de cel en in staat correcte subcellulaire handel en eiwit-eiwit interactie te zijn. Terwijl de exogene eiwitten neiging ophopen op het oppervlak van de cellen, de geëlektroporeerde monsters hadden sterk verhoogde intracellulaire effector concentratie ten opzichte van alleen incubatie. Het protocol is eenvoudig en snel genoeg om te worden gedaan in aparallel mode, waardoor voor high-throughput karakterisering van pathogeen eiwitten in gastheercellen waaronder subcellulaire targeting en functie van virulentie-eiwitten.
Introduction
Vele Gram-negatieve bacteriën gebruiken gespecialiseerde secretie systemen virulentie gerelateerde eiwitten (hierna effectoren) direct te injecteren in gastheercellen 1-5. Deze effectoren hebben een breed scala van biologische functies, waaronder: onderdrukking van de immuniteit van de gastheer, het cytoskelet veranderingen, wijziging van het intracellulair verkeer en signalering, transcriptionele veranderingen, en gastheer proteasoom veranderingen 6-9. De functies van bepaalde effectoren zijn bekend, maar de gastheer doelstellingen en biochemische werking (en) van vele anderen nog worden bepaald. Bij het vergelijken van wild-type en recombinante bacteriële infecties geldige benadering intracellulaire effector virulentiemechanismen bestuderen, is het vaak voordelig om een individuele effector introduceren in de gastheercel. Aldus eenvoudige werkwijzen voor het inbrengen en karakteriseren bacteriële effector eiwitten in het kader van gastheercellen is zeer gewenst.
Vereenvoudiging van de experimentele analyse wiste één effector is kritisch als andere effectoren kunnen tegengestelde of overbodige functies hebben. Om deze vereenvoudiging te bereiken, hebben de onderzoekers eerder geïntroduceerde macromoleculen in cellen door vele verschillende methoden, waaronder virale transductie 10, micro-injectie 11, schraap het laden van 12,13, celfusie met chemisch geïnduceerde micro-injectie 14, merkgebonden eiwit "transfectie" reagentia 15, calciumfosfaat neerslag 16 en elektroporatie 17-20. De ingevoerde moleculen variëren van nucleïnezuren zoals DNA, RNA, en RNAi soorten eiwitten, cellen ondoordringbare kleurstoffen en antilichamen voor intracellulaire doelwitten 21,22. Sommige methoden hebben beperkingen waaronder het type macromolecuul dat kan worden ingevoerd, en inzonderheid downstream analyses kunnen worden beperkt door hoge cellulaire toxiciteit, schadelijke werkingsmechanismen, lage werkzaamheid, of introductie efficiency. Transfectie, een often gebruikte methode voor het tot expressie brengen van bacteriële genen in zoogdiercellen, lijdt ook de beperking dat enkele relevante gastheercel soorten, zoals macrofagen en primaire cellen, bijzonder resistenter voor transfectie. Naast dit, is het moeilijk om de niveaus van bacteriële eiwit geproduceerd bij inbrengen van vreemd DNA controle.
Veel werk elektroporatie van nucleïnezuren in zowel bacteriële en zoogdiercellen als gemeenschappelijk laboratoriumtechniek vastgesteld; echter, er voortdurend onderzoek naar de beste methoden voor het leveren van eiwitten in cellen onder fysiologische omstandigheden. Rapporten over proteïne transfectie zijn veelbelovend, maar vereisen dure reagentia en optimalisatie. De wens mogelijk toxische bacteriële effectoren introduceren in diverse cel targets met minimale kosten leidde ons naar elektroporatie beschouwen als een methode voor het bestuderen van deze eiwitten in vivo.
Eiwit elektroporatie 23-25 is een ontmoetinghod om eiwitten te introduceren in levende cellen via electropermeabilization, ook wel elektro-transfectie of elektro-injectie 26. Deze techniek maakt gebruik van hoge intensiteit elektrische pulsen poriën in celmembranen te maken. Deze omkeerbare poriën laten macromoleculen die normaal gesproken worden uitgesloten van intracellulaire ruimte om de cel in te voeren. Na verwijdering van het externe elektrische veld, kan het membraan opnieuw verzegelt, waardoor de cel moleculen die doorheen de poriën 27,28 behouden.
Een standaard electroporator werd in dit onderzoek om bacteriële effectoren consequent voeren in zowel muizen macrofaag-achtige cellen en humane epitheelcellen. De werkwijze is snel, efficiënt en goedkoop, zonder noemenswaardige daling van cellulaire levensvatbaarheid. De geïntroduceerde eiwitten kunnen worden gevisualiseerd immunofluorescentie microscopie of voor functionele bepalingen. Dit is aangetoond met groen fluorescent proteïne (GFP) als een niet-toxische standaard, entwee Salmonella effector-eiwitten, SspH1 en GtgE. Wij stellen eiwit elektroporatie als een extra instrument in het repertoire voor de studie van bacteriële virulentie eiwitten en hun functies in eukaryote gastheercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid in Advance
- Warm steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 ° C.
- Warm Dulbecco's modificatie van Eagle's Medium (DMEM) en Minimaal Essentieel Medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C. Opmerking: Deze vertegenwoordigen een normale groei Media (NGM) voor RAW en HeLa-cellen respectievelijk.
2. Bereiding van Cellen
- Groeien RAW 264.7 cellen 70-90% confluentie in NGM.
- Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer.
- Groeien HeLa-cellen 70-90% confluentie in NGM.
- Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer.
- Voordat collectie, wassen celmonolaag keer met steriele PBS.
- Verzamel pre-confluente cellen in een steriele conische buis.
- Zachtjes schrapen RAW cellenmet een rubberen politieman in PBS, met herhaalde pipetteren naar cel aggregaties verspreiden.
- Los HeLa-cellen met 0,25% trypsine oplossing totdat visueel onderzoek toont dissociatie van cultuur oppervlak. Gebruik bijvoorbeeld 2 tot 3 ml van een T-75 kolf. Stel het volume daarom om ervoor te zorgen trypsine oplossing dekt gehele groei oppervlak.
- Schrik dissociatie met NGM dat 10% FBS.
- Gebruik ten minste tweemaal het volume van NGM trypsine, met herhaalde pipetteren naar cel aggregaten te dispergeren.
- Licht pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min.
- Resuspendeer in hetzelfde volume als trypsine / demping oplossing met behulp van steriele PBS.
- Tellen cellen met behulp van hemocytometer of deeltje teller.
- Licht pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min.
- Resuspendeer in voldoende volume PBS 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 cellen / ml. Opmerking: Zo zal één T-75 kolf approxim opleverenlijk 7,5 x 10 6 cellen 29.
- Houd celsuspensie op ijs tot elektroporatie.
3. Voorbereiding voor Elektroporatie
- Pre-chill elektroporatie cuvetten (0,4 cm gap) op ijs.
- Schakel elektroporatie apparaat en stel de spanning tot 0,3 kV.
OPMERKING: capaciteit en weerstand waren niet aanpasbare instellingen op onze electroporator (vastgesteld op 10 uF en 600 Ω door de fabrikant). - Vul herstel platen met NGM en equilibreren bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C
4. Electroporatie
- Plaats 400 pl celsuspensie in vooraf gekoelde cuvet en voeg 20 ug geselecteerde eiwit cuvette (50 ug / ml).
- Flick cuvet voorzichtig ~ 10 keer om te mixen zonder beschadiging van cellen. Opmerking: De cuvette kan ook meerdere keren worden omgekeerd om goed te mengen, maar niet pipet op en neer of vortex te voorkomen dat schade aan cellen.
- Electroporate monster bij 0,3 kV voor 1,5-1,7 msec. Opmerking: Dit was typisch voor deze studie.
- Onmiddellijk na elektroporatie flick cuvet voorzichtig ~ 10 keer om grondig te mengen.
5. Het plateren van Cellen
- Store cuvet met geëlectroporeerd cellen op ijs tot klaar om te plaatsen in herstel platen.
- Voor de meeste downstream-analyses, wassen cellen 1x met voorverwarmd NGM om vreemde effector eiwit te verwijderen.
- Verwijder cellen voor analyse en schorten in 3-5 ml van NGM.
- Pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min.
- Resuspendeer in voldoende volume van NGM voor de gewenste plaat grootte (bv 2 ml voor 35 mm schaal).
- Verwijder geschikte hoeveelheid cellen voor downstream analyse.
- Voorbeeld 1: de plaat in glazen bodem gerechten voor microscopie analyse.
- Voorbeeld 2: plaat into celcultuur plastic voor eiwit analyse zoals affiniteit zuiveringen.
- Laat cellen herstellen in evenwicht platen in bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur.
6. Microscopie Analyse
6.1) Fixatie / immunofluorescentiekleuring
- Was de cellen 1x met steriele PBS na 4 uur herstelperiode.
- Fix cellen in 100% methanol gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik voldoende methanol volledig bedekken cellen (bijvoorbeeld 2 ml van 35 mm schaal).
- Was 3x met steriele PBS.
- Permeabilize cellen met 0,4% Triton X-100 in PBS gedurende 15 min. Gebruik bijvoorbeeld 1 ml voor een diameter van 35 mm plaat.
- Pas lengte van permeabilisatie en sterkte van Triton X-100 volgens epitoop en locatie doelwiteiwit. Opmerking: De beste resultaten moet empirisch worden bepaald voor elk doel, maar de bovenstaande voorwaarden moet voldoende zijn voor de meeste c zijnytosolic doelen.
- Blokkeren met 5% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur bij KT. Gebruik bijvoorbeeld 1 ml voor een diameter van 35 mm plaat.
- Was 3x met PBS.
- Incubeer primair antilichaam in antilichaam binding oplossing (0,1% Triton X-100 en 1% BSA in PBS) overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen. Gebruik bijvoorbeeld 0,5 ml voor een diameter van 35 mm plaat.
- Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaamverdunning. Opmerking: Zo werd de streptavidine bindende peptide tag (SBP-tag) antilichaam dat 1: 1000 verdunning, terwijl de PKN1 antilichaam werd gebruikt bij 1: 200 verdunning.
- Was 4x met PBS.
- Incubeer passende fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam in antilichaam binding oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, beschermd tegen licht.
- Gebruik bijvoorbeeld Alexa 488 en Alexa 647 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor de mieribody verdunning. (Bijvoorbeeld ongeveer 1: 1000 van deze studie).
- Voeg andere vlekken indien nodig, bijvoorbeeld 5 uM Wheat germ agglutinnin (WGA) geconjugeerd met Alexa 647 of DAPI volgens de aanbevelingen van de fabrikant, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Gebruik bijvoorbeeld Alexa 488 en Alexa 647 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was 5x met PBS en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht tot klaar om de afbeelding.
6.2) confocale microscopie en beeldanalyse
- Afbeelding samples op een omgekeerde confocale microscoop met een 63x olie-immersie objectief.
- Afbeelding groene kanaal met behulp van de 488 nm lijn van een argon laser, met een bandbreedte emissie tussen 492-542 nm.
- Afbeelding rode kanaal met behulp van een 633 nm diodelaser, met bandbreedte emissie tussen 640-718 nm.
- Afbeelding blauwe kanaal met behulp van een 405 nm diodelaser, met bandbreedte emissie tussen 407-453 nm.
- Zorg ervoor dat de meerdere kanalen z-stacks dekken het geheel van de cellulaire volume.
- Proces beelden met de juiste software voor beeldverwerking.
7. Affiniteitszuivering
- Was geëlectroporeerd cellen tweemaal met 4 ° C PBS na 4 uur herstelperiode.
- Lyse met ~ 1,0 ml lysis buffer (1% Triton X-100 met protease inhibitor cocktail en fosfatase-inhibitor in PBS) op ijs. Gebruik remmers volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Bijvoorbeeld, zowel de fosfatase en protease inhibitoren die in deze studie werden toegevoerd met 100x, maar andere formuleringen even goed werken.
- Prompt schraap cellen met rubberen politieman en verzamelen in conische buizen.
- Lyse door krachtige vortexen en geluidsgolven. Opmerking: Andere lysis methoden kunnen net zo goed werken, maar de efficiëntie moet empirisch worden bepaald met betrekking tot de geschiktheid van de test eisen.
- Ultrasone trillingen 3 x 30 sec met intermitterende vortexen.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verzamelencelresten en onoplosbare aggregaten; sparen het supernatant.
- Combineer gelijke volumes (-1,0 ml) geëlektroporeerd cellysaat met 50 pi agarose Streptavidin resin suspensie bij 4 ° C geïncubeerd met end-over-end rotatie. Opmerking: Deze hars vangt de geëlectroporeerd eiwit (en bijbehorende complexen) via haar streptavidine bindend peptide affiniteitsmerker.
- Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.
- Twee keer wassen met 40 bed volumes (~ 1 ml) PBS.
- Voeg 30 ui 4x LDS laadbuffer (141 mM Tris base, 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G, 0,175 mM fenolrood, pH 8,5), 20 gl Dih 2 O en 1 pi 0,5 M tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP), die enige volume korrels blijven.
- Verhit bij 95 ° C gedurende 10 min en afkoelen op ijs.
- Spin> 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 min.
- Verzamel supernatant.
- Voer een western blot met behulp van geschikte antilichamen Opmerking: Hijre, is anti-PKN1 primair antilichaam gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als eerste proof of concept werd gezuiverd groen fluorescerend eiwit met succes in zoogdiercellen via elektroporatie. GFP, bij benadering 27 kD een molecuulgewicht eiwit wordt gewoonlijk ingebracht in zoogdiercellen (gewoonlijk uitgedrukt uit plasmide DNA) als moleculaire biologie hulpmiddel zonder significante cellulaire toxiciteit. HeLa-cellen werden geïncubeerd (Figuur 1A) of elektroporatie (Figuur 1B) met 25 ug / ml GFP, gevolgd door immunofluorescentie confocale microscopie te controleren fluorescent GFP signaal. Om aan te tonen dat het GFP in het cellulaire cytosol, werden de cellen ook gekleurd met tarwekiem agglutinine (WGA) naar de cytosolische grens (rood) afbakening en een nucleïnezuur kleurstof, DAPI (blauw) naar de kern te geven. Intracellulaire GFP signaal werd alleen waargenomen na elektroporatie, maar geen intracellulair eiwit werd waargenomen in cellen geïncubeerd met GFP. Soortgelijke resultaten werden waargenomen met RAW264.7 muismacrofaag-achtige cellen (Figuur 1C en 1D). Merk op dat WGA een lectine die bij voorkeur bindt aan residuen in de plasmamembraan en dus punctata kleuring vertonen gebaseerd op de lengte van incubatie. Vergelijk Figuur 1A en Figuur 2A, waarbij figuur 2A werd gedurende een langere duur dan figuur 1A.
Elektroporatie werd vervolgens uitgebreid tot een getagde, gezuiverd Salmonella effector, GtgE. GtgE, een bekende virulentiefactor 30 werd ontdekt door onze groep worden uitgescheiden in gastheercellen 31, en is onlangs aangetoond dat het een cysteïneprotease 32 zijn. HeLa-cellen werden geïncubeerd of elektroporatie met 50 ug / ml GtgE. Voor immunofluorescentie analyse werden de cellen gekleurd met een antilichaam tegen streptavidine bindende peptide affiniteit tag op GtgE. De cellen werden ook gekleurd met WGA en DAPI. In geïncubeerd HeLa-cellen (Figure 2A), geen intracellulaire GtgE zoals gevisualiseerd door het ontbreken van groene fluorescente foci. Daarentegen geëlektroporeerde HeLa-cellen (Figuur 2B) tonen significante fluorescerende intracellulaire signaal dat effector eiwit had de cellen door elektroporatie proces ingevoerd. RAW cellen vertoonden een licht verhoogde neiging tot eiwit accumuleren op het cellulaire oppervlak tijdens incubatie (figuur 2C), maar intracellulair signaal werd alleen waargenomen na elektroporatie (figuur 2D).
Het bepalen van de grenzen van de detectie voor het visualiseren van sub-cellulaire lokalisatie via confocale microscopie was belangrijk om ervoor te zorgen voldoende eiwitten ging de cel, terwijl het vermijden van overbelasting van de cel met potentieel toxische bacteriële effectoren. In figuur 3 werd GtgE geëlektroporeerd in RAW macrofaag-achtige cellen bij 2,5, 25, en 50 ug / ml. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een antilichaam tegen het tag op GtgE. Only een zeer klein aantal foci werden waargenomen bij 2,5 pg / ml GtgE (figuur 3A), met verhoogde aantallen foei duidelijk bij 25 ug / ml (figuur 3B), maar het grootste aantal verschillende foci werden gezien bij de maximale eiwit geteste concentratie van 50 ug / ml (Figuur 3C). Soortgelijke kleurpatronen waargenomen tussen de monsters aangeeft naar deze eiwitconcentraties intracellulair eiwit kan gemakkelijk worden geverifieerd door confocale microscopie. Proteïne concentraties boven 50 ug / ml werden niet getest omdat de eiwitconcentratie vergroot, zo ook de neiging van het doeleiwit aan geadsorbeerd aan het oppervlak van de cellen. Om deze aggregaten van membraan-geassocieerd eiwit te vermijden, werd het noodzakelijk om twee elektroporatie cuvetten bundelen om voldoende gastheer interactie eiwit te visualiseren op een western blot (Figuur 6, de rechter rijstrook) te verkrijgen.
Om verder aan te tonen dat de introduced eiwit was niet alleen geadsorbeerd aan het oppervlak van de cel, werden opeenvolgende optische secties afgebeeld in beeldvlakken elke 0,35-0,43 micrometer (Z-stacks) met behulp van confocale microscopie. RAW cellen werden geëlektroporeerd met 50 gg / ml GtgE en gekleurd zoals hierboven (figuur 4, A en B) beschreven. De Z-stacks bleek dat GtgE inderdaad intracellulaire en de brandpunten van de onderkant (Figuur 4A, vlak 6, 36) aan de bovenkant van de cel (figuur 4B, vlak 26 van 36). Soortgelijke resultaten werden verkregen voor alle geëlektroporeerd eiwitten. De intrinsieke fluorescentie profiel van controle celpopulaties met en zonder effector eiwit of elektroporatie werd onderzocht door TL confocale microscopie, en bleek verwaarloosbaar te zijn.
Daarnaast werd de geëlectroporeerd eiwit onderzocht om te zien of het was gericht voor degradatie via endocytisch paden. Cellen werden gekleurd voor-Ras-gerelateerde eiwit 5A (Rab5), eenmarker voor de vroege endosomen (figuur 4C), of-Lysosome geassocieerd membraaneiwit 1 (Lamp1), een marker voor late endosomen en lysosomen (figuur 4D). Co-localisatie tussen de geëlectroporeerd eiwit en deze cellulaire merkers zou een nauwe fysieke interactie tussen hen (dat wil zeggen dat de geëlectroporeerd eiwit binnen was het endosomes / lysosomen) aan te geven. Confocale microscopie toonde aan dat de geëlectroporeerd eiwit (GFP of GtgE) geen medewerking te lokaliseren met LAMP1 of Rab5. Het werd afgeleid dat eiwit leidt niet direct door endocytose in de cellen of gericht op de endocytotische route binnen vier uur behandeling.
Exogene eiwitten introductie kan cellulaire effecten in de loop van enkele uren of dagen, en daardoor is het vaak voordelig om de persistentie van geïntroduceerde eiwitten onderzocht. Om te bepalen hoe lang een geëlectroporeerd eiwit zou blijven bestaan zonder degradatie na elektroporatie. Gebaseerd on visualisatie van gehechtheid en celspreiding, 4 uur werd bepaald om de geschatte minimale hersteltijd voor geëlectroporeerd cellen zijn. Om tijdelijk observeren eiwit persistentie een tijdsverloop experiment uitgevoerd, het kleuren van de cellen 4, 24, of 96 uur na elektroporatie. Na 4 uur (figuur 5A), wanneer celmorfologie zonder herstel, was er een aanzienlijke hoeveelheid intracellulair eiwit. Na 24 uur (Figuur 5B), was er nog steeds aanzienlijke geëlectroporeerd eiwit in de cellen. Zelfs wanneer de tijd na elektroporatie werd verlengd tot 96 uur voor fixatie en kleuring (figuur 5C) er waarneembare foci zij het gereduceerd blijkt overvloed, waaruit eiwit persistentie na aanvankelijke behandeling.
Twee belangrijke kanttekeningen werden genoteerd in de loop van deze experimenten. RAW cellen vertoonden een grotere neiging dan HeLa cellen exogene eiwitten ophopen op het celoppervlak irreperspectief van incubatie (figuur 6A) of elektroporatie (Figuur 6B). Desondanks waren alle geëlektroporeerd monsters interne eiwit (Figuren 1, 2, 5B) verhoogd. Bovendien, de membraan geassocieerde eiwit verdwenen de tijd. Een tweede nadeel is een kleine populatie van cellen vertonen een fenotype dat bestaat uit kleine, afgeronde cellen opgeladen met grote hoeveelheden exogene eiwitten in beide control (geïncubeerd) en behandelde (elektroporatie) cellen (Figuur 6, C en D, incubatie monsters getoond). De kernen van deze cellen vertoonden gecondenseerde chromatine basis van DAPI kleuring, en vulde het geheel van het celvolume, wijzen op apoptose. Het is dus mogelijk dat apoptotische cellen (ontstaan als een normaal onderdeel van de celcyclus of als gevolg van oogst / behandeling) hebben een neiging om eiwit te absorberen uit de buffer.
Om aan te tonen dat geëlektroporeerd eiwitten functioneel waren en kon corre lokaliserenctly in de gastheercel, co-lokalisatie en eiwit-eiwit interactie tussen de Salmonella effector eiwit SspH1 en haar bekende gastheer doelgroep, proteïne kinase N1 (PKN1) 33 werd getoond. Na elektroporatie, werd de fysieke interactie tussen SspH1 en PKN1 geverifieerd door een affiniteit gebaseerd immunoprecipitaties gevolgd door western blot (Figuur 7A). Co-lokalisatie werd ook waargenomen door confocale microscopie, hetgeen aangeeft de fluoroforen dicht genoeg ruimtelijk overlappen 34. Na elektroporatie met 50 ug / ml SspH1 werden HeLa-cellen (Figuur 7B) gefixeerd en gekleurd voor SspH1 (groen) en PKN1 (rood). Bij lage laservermogen verschillende foci (geel) werden waargenomen in de kern aangeeft SspH1 en PKN1 waren fysiek dicht genoeg om te interageren. Deze interactie is vastgesteld in de literatuur; maar deze studie is de eerste co-localisatie te tonen in de kern.
= "Always"> 
Figuur 1: Elektroporatie van GFP - HeLa RAW 264.7 cellen Cellen werden geïncubeerd of elektroporatie met 25 ug / ml gezuiverd groen fluorescerend eiwit (GFP) en gekleurd met anti-GFP antilichaam (groen), DAPI, een nucleaire specifieke probe (Blue. ) en WGA (rood) naar de cytosolische grens bakenen. Geïncubeerde (A) HeLa cellen vertonen een afwezigheid van groene fluorescentie duidt op het ontbreken van opname van GFP. (B) toont een representatieve microfoto van geëlektroporeerd GFP. Let op de verschijning van intracellulaire foci vermelding GFP waren de cellen ingevoerd. (C) en (D) zijn representatief afbeeldingen RAW cellen geïncubeerd (C), of elektroporatie (D) met 25 ug / ml gezuiverd groen fluorescent proteïne.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Figuur 2:. Elektroporatie van Salmonella effector GtgE - HeLa-cellen Cellen werden geïncubeerd (A) of elektroporatie (B) met 50 ug / ml van een affiniteit tag Salmonella effector, GtgE en gekleurd met een anti-merker antilichaam effector (groen), DAPI, een nucleaire masker (blauw) en WGA (rood) naar de cytosolische grens bakenen. In (A), geïncubeerd HeLa cellen vertonen een afwezigheid van groene fluorescentie duidt op het ontbreken van opname van GtgE. (B) toont een representatieve microfoto van geëlektroporeerd GtgE, toont intracellulaire geëlektroporeerd effector eiwit. (C) en (D) zijn representatief afbeeldingen RAW cellen die ofwel werden geïncubeerd of geëlektroporeerd respectievelijk op dezelfde wijze met 50 ug / ml Salmonella GtgE. Lichtblauw is de combinatie, of overlay, rode fluorescentie van de WGA engroene fluorescentie van het secundaire antilichaam.
Figuur 3: Titratie van geëlektroporeerd eiwit - RAW macrofaag-achtige cellen Cellen werden geëlektroporeerd met 2,5 ug / ml (A), 25 ug / ml (B) of 50 ug / ml (C) Salmonella effector GtgE en om te herstellen. 4 uur. De cellen werden gefixeerd en gekleurd met een anti-SBP-tag antilichaam (groen) en de kernen masker, DAPI (blauw). Het is mogelijk om fluorescente foci, indicatief intracellulaire GtgE visualiseren 2,5 pg / ml via confocale microkopie, maar betere resultaten werden verkregen wanneer hogere starten hoeveelheid eiwit gebruikt. Bevredigende resultaten (waaronder intracellulair eiwit gemakkelijk waargenomen door confocale microscopie zonder overmatige membraan geassocieerde aggregaten) werden verkregen bij 50 pg / ml voor GtgE dus no grotere concentraties werden getest.
Figuur 4:. Eiwit internalisatie en het ontbreken van co-lokalisatie met endosoom markers Opeenvolgende optische schijfjes (z-stacks), verkregen door confocale microscopie te visualiseren als de geëlectroporeerd eiwit was intern. RAW cellen werden geëlektroporeerd met 50 gg / ml GtgE. (A) toont optische segment 6 van 36 de z-stack (2,1 micrometer) boven de bodem van de schaal. (B) toont hetzelfde gezichtsveld maar segment 26 van 36. De intracellulaire foci zich in de gehele cel aangeeft dat het eiwit werkelijk intracellulair en niet geaggregeerd op het oppervlak van de cel. Lichtblauw is de combinatie van rood WGA, groen secundair antilichaam, en blauw DAPI. Co-lokalisatie test met markers van endosomes / lysosomen, Rab5, (C) of een lysosoom marker, LAMP1 
Figuur 5: Eiwit persistentie na elektroporatie confocale microscoop die de persistentie van geëlectroporeerd GtgE loop van de tijd.. 50 ug / ml GtgE werd geëlektroporeerd in HeLa-cellen. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een anti-SBP-tag antilichaam (groen) en de kernen masker, DAPI (blauw). 4 uur (A) was vastbesloten om de minimale hoeveelheid tijd om cellen te herstellen zijn en zoals verwacht geeft maximale intracellulaire eiwit. Na 24 uur (B) en 96 uur (C), groene foci, zowel intracellulaire en de CELlaire oppervlak, toon effector persistentie aangeeft dat het eiwit niet afgebroken dagen na de eerste behandeling. De lichtblauwe kleur in het beeld is de overlay van de blauwe DAPI en de groene antilichaamkleuring. 
Figuur 6:. Celoppervlak proteïne aggregatie en een elektroporatie fenotype RAW macrofaag-achtige cellen werden geïncubeerd hetzij (A) of elektroporatie (B) met 50 ug / ml GtgE en gekleurd met anti-SBP-tag antilichaam (groen), WGA (Red ), en met DAPI (blauw). Zowel RAW 264.7 en in mindere mate HeLa cellen neiging effector aggregeren op het oppervlak van de cel; Alle geëlektroporeerde cellen werden intern eiwit gestegen (HeLa niet getoond). Geel is de overlay van de rode van WGA en groen van target-eiwit. RAW (C) en HeLa (D) cellen showing een veranderd fenotype na incubatie met GtgE (getoond). Verschillende experimenten toonden een fenotype dat bestaat uit kleine cellen met differentiële DAPI kleuring en verlies van cytoplasma. Lichtblauw is de overlay in de rode WGA, groen secundair antilichaam, en blauw DAPI. Confocale microscopie werd gebruikt om het doeleiwit ophopen in de kern te tonen. Aangezien dit fenotype van exogeen proteïne beladen cellen zich na zowel incubatie en elektroporatie, kan men dit fenotype hypothese wijzen op apoptose. 
Figuur 7:. Gastheer eiwit interacties met geëlektroporeerd Salmonella SspH1 - HeLa-cellen De cellen werden geëlektroporeerd in de vermelde concentraties SspH1, men herstellen gedurende 4 uren voordat een gewijzigde affiniteit zuivering gevolgd door western blot (A) te verrijken endetecteren de bekende eukaryote inwerkende partner: serine / threonine proteïne kinase N1 (PKN1). Merk op dat de uiterst rechtse rijstrook (2x EP) omvat 2 gepoolde cuvetten, als het signaal van de ene cuvette gemengd in de achtergrond, maar toch PKN1 nog verrijkt boven het gebrek aan binding gezien in de no-aas controle. De Western blot werd uitgevoerd met natief HeLa lysaat gezuiverd SspH1, en de affiniteitszuivering monsters voordat wordt gesondeerd met een monoklonaal antilichaam tegen PKN1. Target detectie werd verkregen via een horseradish peroxidase geconjugeerd secundair antilichaam met reactiviteit tegen het isotype van het primaire antilichaam. HeLa-cellen (B) toont co-lokalisatie (geel) tussen PKN1 (rood) en SspH1 (groen) via door confocale microscopie na elektroporatie met 50 ug / ml SspH1. Deze optische overlap geeft aan dat de effector en de gastheer eiwit dicht genoeg bij fysieke interactie. Het feit dat de interactie in de kern voor het eerst, biedt extra ondersteuninghet eiwit werd correct gesmokkeld door de gastheer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afgescheiden effectoren van pathogene bacteriën geëvolueerd functioneren in de gastheercel worden en daardoor is het nuttig om te bestuderen in situ in de gastheer. Invoering van specifieke effectoren van belang in gastheercellen kan de desbetreffende pathogeen-gastheer interacties worden bestudeerd isolatie zonder interferentie van andere bacteriële eiwitten. Het doel was om elektroporatie staand als middel om bacteriële effector eiwitten te introduceren in eukaryote gastheercellen, waardoor sommige van de uitdagingen in verband met transfectie of transductie vermijden. Groen fluorescent eiwit werd gebruikt als een controle en Salmonella effector eiwitten werden getest. Vanwege belangstelling bacteriële pathogenen die bestemmingshost epitheelcellen alsook immuuncellen, een humane epitheel cellijn (HeLa) en muis macrofaag-achtige cellen (RAW 264.7) gebruikt. Elektroporatie kunnen exogene eiwitten leveren in gastheercellen met geen merkbare afname in cel viability, en de geleverde eiwitten waren detecteerbaar in cellen tot vier dagen.
Om de effecten van geëlektroporeerde isolaat wordt zuiver eiwit vereist. In deze studie werden eiwitten tot expressie gebracht in E. coli stam BL21 met een N-terminale polyhistidine en streptavidine bindend peptide labels. Eiwitten werden gezuiverd met Ni-NTA hars getest concentratie (gewoonlijk tussen 5-25 mg / ml) en zuiverheid, en opgeslagen bij -80 ° C tot elektroporatie. Commercieel geproduceerde eiwitten zouden ook aanvaardbaar voor elektroporatie zijn, omdat zij meestal zeer zuiver en goed gekarakteriseerd zijn.
Belangrijke stappen in dit protocol bij het volledig verwijderen van het celkweekmedium door wassen en suspenderen cellen in eiwitvrij buffer. Dit zorgt ervoor dat stroomafwaarts fenotypes waargenomen door het exogene eiwit van belang en niet aanwezig is in het kweekmedium eiwitten. Meer efficiëntie van elektroporatie werd waargenomen wanneer celdichtheidhoger (bijvoorbeeld 6 x 10 6 vs. 1 x 10 6 cellen), al is de beste mobiele nummer zal variëren met de cel grootte en type. Een andere belangrijke stap in het experiment was om cellen de tijd om te herstellen en weer vast aan gerechten; Dit was nodig omdat hechtende cellen werden gebruikt in deze studie. Een herstelperiode moet minder belangrijk voor suspensie cellen, hoewel het noodzakelijk kan zijn om eiwitten geven tijd voor een goede intracellulair transport, eiwit-eiwit interacties of enzymatische activiteit, afhankelijk van de aard van de beoogde studie. Aangezien geleverd eiwitten werden waargenomen in cellen tot 96 uur, is er veel ruimte voor aanpassing van de incubatietijd voor visualisatie of cellulaire assay microscopie.
Meerdere variabelen in dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen, eiwit targets, of stroomafwaarts analyse regelingen. De hoeveelheid eiwit te geëlectroporeerd kan worden afgestemd op de gewenste intracellulaire concentratie. For visualisatie van eiwit lokalisatie, kunnen zo weinig als 1 ug gebruikt. Voor functionele studies, kunnen hogere basisbedragen van eiwitten die nodig zijn. Bovendien kan de hoeveelheid tijd na elektroporatie celherstel kortgesloten of uitgebreid. Labiele eiwit targets of snelle downstream processen zou een kortere incubatietijd nodig. Ook de hoeveelheid cellen uitgeplaat kunnen worden dan de voorstellen hier aangepast. Cellen worden uitgeplaat dunner als het ingebrachte eiwit wordt gecontroleerd door microscopie of bedekt dichter indien de geëlektroporeerd eiwit wordt teruggewonnen voor toepassingen zoals Western blots.
Terwijl elektroporatie is een eenvoudige en ongecompliceerde werkwijze voor het introduceren eiwitten in levende cellen, enkele beperkingen aan de techniek. De werkwijze vereist zeer zuivere eiwitten in microgram hoeveelheden. Zo weinig als 1 ug geëlektroporeerd en zichtbaar gemaakt met confocale microscopie, maar om het starten hoeveelheden eiwit gaf Betteh visuele resultaten. Hoewel eiwitfunctie niet bij alle concentraties na elektroporatie werd beoordeeld, werden eiwitconcentraties gelijk aan of groter dan 50 ug / ml voor een adequaat signaal voor western blot. Ook, door de omvang beperkingen van de elektroporatie cuvetten, opschaling kan de behandeling van multiple cuvetten cellen vereisen. Echter, gezien het feit dat de elektroporatie proces duurt enkele seconden nadat cellen worden bereid, parallelle verwerking vergt weinig extra tijd en inspanning.
Als het ingebrachte eiwit wordt gevisualiseerd door western blot, microscopie, of voor affiniteitszuivering, moet het eiwit een label 35 voor affiniteitszuivering of een beschikbare antilichamen voor detectie hebben. Echter, om onbekende redenen, sommige interacties bekend uit de literatuur of andere biochemische methoden (data niet getoond) niet konden worden geïncorporeerd na elektroporatie. Het kan zijn dat de gastheer herkent sommige geëlektroporeerd eiwitten foreign en snel markeert ze voor proteasoom degradatie.
Elektroporatie houdt een aantal voordelen ten opzichte van andere bestaande methoden voor eiwit levering. Vergeleken met micro-injectie, elektroporatie is veel sneller en eenvoudiger, en een groot aantal cellen onmiddellijk behandeld worden met bijna 100 procent levensvatbaarheid voor de geteste omstandigheden. Elektroporatie is ook goedkoper dan eiwit transfectie met commercieel verkrijgbare reagentia. DNA transfecties worden vaak gebruikt om bacteriële effector eiwitten in gastheercellen te bestuderen; echter, veroorzaakt de bacteriële eiwitten niet ideaal worden gesynthetiseerd door de gastheer. Anderzijds, elektroporatie van bacteriële eiwitten verwijdert de afhankelijkheid van zoogdierlijke eiwitexpressie machines, waardoor een betere weergave van het infectieproces waar effector eiwitten worden uitgedrukt door de bacteriën.
Verschillende toepassingen kunnen eiwit elektroporatie als een methode in de studie van bacteriële gastheer Interacties. Allereerst kan primaire cellen die vaak moeilijk te transfecteren zijn ontvankelijker voor elektroporatie op eiwit aflevering. Dit zal zorgen voor de studie van de effector functie in meer biologisch relevante celtypen. Elektroporatie geeft ook de mogelijkheid multiplexing eiwitten en / of behandelingen. Bijvoorbeeld kunnen meerdere eiwitten gelijktijdig worden ingebracht, of drugs en andere kleine moleculen naast eiwitten worden geleverd. Het meest belangrijk voor het verkrijgen van een functioneel begrip van het effect van de geïntroduceerde eiwitten, elektroporatie kunnen worden gekoppeld assays voor eiwit functie en interacties, zoals affiniteitszuivering, western blots tegen bekende doelen, totale-cel expressie analyse en microscopie bepalen subcellulaire lokalisatie van het ingebrachte eiwit. Vandaar dat deze methode heeft een groot potentieel als een instrument voor het ophelderen van bacteriële pathogenen biologie naast andere cellulair en moleculair biologische technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H.
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
